توفر زراعة أعضاء الكلى والعضيات المشتقة من الخلايا الجذعية المبرمجة طرقًا ممتازة لدراسة الآليات وراء نمو الكلى والمرض. ومع ذلك، لا يوفر نظام زراعة الجهاز الحالي تدفق الدم إلى الكلية. ونتيجة لهذا السبب، فإن النماذج الحالية غير مكتملة وتفشل في تلخيص الوظيفة الرئيسية للكلى، وهي ترشيح الدم.
في هذا المنشور، نقدم بروتوكول محسن لزراعة وتصور الكليات الجنينية والعضية على الغشاء الكورمي لجنين الدجاج. في رواية لدينا مجموعة تجريبية، ونحن تراكب بدائيات الكلى المزروعة على CAM مع خزانات معنى نفاذية التي تمتلئ الثقافة المتوسطة. هذا البروتوكول يزيد بشكل كبير من بقاء بدائيات الكلى وأيضا الخلايا البطانية الجوهرية.
الطريقة تمكن تدفق الدم إلى الكبيبات النامية. في الآونة الأخيرة نشرنا أيضا رواية رواية المحددة اتجاه الجهاز ثقافة الأسلوب الذي يقدم عالية الدقة confocal 3D التصوير الفاصل الزمني. وفرت هذه الطريقة الظروف المثلى للتصوير confocal على المدى الطويل من organoids و rudiments الجهاز.
في النهج ، ونحن ضغط بلطف الأنسجة بين زلة غطاء زجاجي وغشاء نفاذي. هنا نعرض كيف يتم إجراء اللوحات المصممة حسب الطلب وكيفية إعداد تجارب الثقافة. وهكذا، في هذا المنشور نقدم تحسين تقنية زراعة أنابيب العضية الكلوية.
هذه الطريقة تقدم طريقة أفضل لنموذج تكوين العضية وإجراء التصوير عالية الدقة لدراسة الكليات الجنينية والكلى الجهازية السابقين فيفو. اعتمادا على تجربتك تأخذ نقل خلية كونترا إدراج مصممة لستة جيدا أو 12-جيدا لوحات. قطع الجانبين من إدراج باستخدام أداة Dremel لإنشاء حلقة بلاستيكية عالية 2 ملليمتر مع غشاء نفاذي تعلق عليه.
تلميع حواف الحلبة من سوارف مع مشرط أو سكين حادة. تعقيم الخزانات الصغيرة في 70٪ الإيثانول لمدة ساعة واحدة على الأقل. ثم يغسل الخزانات الصغيرة في الأوتوكلاف بالماء المقطر وتجفيفها في غطاء محرك السيارة.
شطف الخزانات المصغرة في برنامج تلفزيوني والثقافة المتوسطة. ضع الخزان على طبق بتري على قمة قطرة ثقافتنا المتوسطة مع الغشاء الذي يواجه صعودًا. ترتيب تشريح الكليتين الجنينية السابقين أو الأورجاoidز الكلوي على الغشاء.
تجنب ترك الكثير من السوائل حول العينات وتركها تعلق من ساعتين إلى 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية. يتم زرع إكسينال إلى الغشاء الكورالي للغجاج الجنيني السابق البالغ من العمر ثمانية أيام. نقل الخزانات الصغيرة بحيث الغشاء يغطي الكسب غير المشروع.
وضعها في محيط CAM بحيث لا تغطي الجنين. ثم إضافة الثقافة المتوسطة إلى الخزانات المصغرة. زراعة العينات على CAM الدجاج لمدة تسعة أيام كحد أقصى.
استبدال الوسط الثقافة في الخزانات الصغيرة يوميا. يمكن ملاحظة عملية الأوعية الدموية للعينات بالفعل بعد 24 إلى 48 ساعة من الزراعة. لجعل مخصصة مصممة لوحات ستة جيدا للثقافة الثابتة.
تحتاج إلى البدء عن طريق حفر ثقوب 20 ملليمتر في الجزء السفلي من لوحة باستخدام آلة الحفر مع بت الحفر مناسبة. بعد ذلك، تلميع الحافات من الثقوب على الجانب العلوي من لوحة. وأخيرا، تعقيم لوحات في 70٪ الإيثانول لمدة ساعة واحدة على الأقل.
ثم يغسل الأطباق في الأوتوكلاف بواسطة الماء المقطر وتجفيفها في غطاء محرك السيارة lemiar. غسل 22x22 ملليمتر غطاء زلات في 70٪ الإيثانول والسماح لهم الجافة تماما. الغراء زلة الغطاء على رأس ثقب في الجزء السفلي من الغراء الأنسجة باستخدام الأنسجة.
بعد التجفيف، فحص لوحات تحت المجهر العقيم وإزالة الغراء الزائد. أولا، مزيج aliquot من حبات البوليسترين مع حجم متساو من الهيدروجين. ضع إدراج الحشوة تحت مجهر تشريح مع غشاء يواجه أعلى وترتيب الكلى على الغشاء.
إضافة قطرة من الماء هلام مزيج حبة المقبل الكلى بعناية. اقلب إدراج الملء بحيث يكون الغشاء والكليتين متقابلين لأسفل. ثم ضع بعناية إدراج في بئر لدينا من لوحة مصممة خصيصا ستة جيدا.
دفع إدراج بلطف جدا في البئر. اتبع درجة التسطيح من المجهر حتى تكون الكلية على مستوى الخرز. الحفاظ على إدراج ضغط قليلا إلى البئر مع يد واحدة وإصلاحه إلى لوحة عن طريق ذوبان البلاستيك في ثلاث نقاط في محيط إدراج مع الحديد لحام.
إضافة اثنين من المليلتر ثقافة المتوسطة في البئر من خلال فتح على الجانب. عند بدء التصوير الفاصل الزمني، قم بنقل اللوحة إلى حاضنة على المسرح لمجهر مقلوب. بروتوكول التقاط CAM المعدلة لدينا يتيح الأوعية الدموية عالية الكفاءة من organoids الكلوي والكلى الجنينية.
العديد من الخزانات التي تحتوي على الثقافة المتوسطة تزود الأنسجة المانحة ويحميها من التجفيف خلال الفترة الأولى من الوقت المضي قدما في الأوعية الدموية. هذا الفيلم يظهر تدفق خلايا الدم الدجاج في مركز الكلى الماوس الجنينية المطعمة إلى CAM الدجاج وتربية لمدة سبعة أيام. هذا لوحة الشكل يبين أن لدينا تحسين طريقة ثقافة CAM يوفر ظروف متساهلة للخلايا البطانية المشتقة من الكلى.
الأرقام A و B تظهر الكلى الجنينية نمت لمدة خمسة أيام على أيام الثقافة الفاصلة كانت مركز المطعمة إلى CAM الدجاج لمدة خمسة أيام. يُظهر تلوينها مع خصائص الماوس مضادة CD-31 أن شبكة الخلايا البطانية لمركز الكلى المطعمة لـ CAM أكثر شمولاً مما هي عليه في التحكم بالجانب الأيسر. في الشكل C نرى أن الأوعية الدموية الماوس ملطخة بالأجسام المضادة ماوس محددة CD-31 وهذا هو الأكثر مع الأوعية الدموية الدجاج.
تظهر الأرقام D و E اِشراسات الكلى الجنينية الماوس التي نمت على ثقافة السفر أو كام الدجاج لمدة خمسة أيام وملطخة بـ CD-31 و Hoechst. الأوعية الوعائية الكبيبات هو أكثر نضجا في الكلى المستزرعة على CAM الدجاج من الثقافات التحكم. يظهر الشكل F الكلى الجنينية الماوس مثقف على CAM من الدجاج GFP المعدلة وراثيا لمدة سبعة أيام.
وتلطخ الخلايا البطانية الماوس مع الأجسام المضادة CD-31 ويمكننا أن نلاحظ أن الأوعية الدموية في الكلى الماوس xenotransplant هو في الغالب ولكن ليس الماوس المشتقة حصرا. الرواية ثابت مجموعة اتجاه الثقافة تمكن من زراعة الكلى الجنينية و organoids في مسافة محددة مقيدة. في ثقافة السفر التقليدية، يتم وضع الأجهزة المستزرعة على مرشح يتم الاحتفاظ به في واجهة متوسطة الهواء بواسطة شبكة معدنية.
هذه الطريقة تسمح بظروف جيدة للتطور والنمو ولكنها ليست مثالية للتصوير. في ثقافة اتجاه مجموعة ثابتة، يتم الضغط على الجهاز مثقف بين قاع الزجاج من الطبق والغشاء وسمك من ذلك يتم التحكم بها من قبل حبات البوليسترين العمل كما الفواصل هنا. ويمكن تصوير الأجهزة النامية الحق من خلال الزجاج غطاء إعطاء تحسين عرض الجهاز.
ويبين هذا الشكل لوحة أن الكليتين الجنينية والكلى organoids يمكن أن تكون مثقفة في ثابت مجموعة اتجاه ثقافة الأسلوب. تظهر الصور الميدانية الساطعة للكلى الجنينية وعضوية الكلى في اليوم السابع التطور الطبيعي. في الشكل C, وقد تم تنشيط التعبير GFB في النبتونات النامية من الجهاز العضوى الكلي من قبل الشكل D يظهر الكلى مع الصدمة واحدة تلطيخ على برعم euretric وستة تلطيخ اثنين بمناسبة الخلايا السلائف nephron.
الأرقام E و F تقديم الكلى الماوس مثقف لمدة 12 يوما. الصدمة واحدة وتلطيخ nephron تظهر برعم eurethric وpodocites. الفيلم أيضا، ويعرض كلية جنينية من MTMG، تايوان كري الأصل، حيث كري تايوان يحفز التعبير GFB في الخلايا البطانية.
يمكننا أن نرى أن الخلايا البطانية الكلوية موجودة في الكلى الجنينية النامية ويمكن أن تتطور أيضا شبكة البطانية في طريقة الثقافة. في اللوحة على اليمين، يمكنك أن ترى كيف تهاجر الخلايا البطانية إلى الشق الوعائي في المرحلة S على شكل nephron. هنا قمنا بتقديم البروتوكول المحسن لxenotransplantation من الأورجاoidز الكلوي والكلى الجنينية لـ CAM الدجاج.
هذا البروتوكول يزيد بشكل كبير من بقاء بدائيات الكلى وأيضا خلايا البطانية الجوهرية. الطريقة تمكن تدفق الدم إلى الكبيبات النامية. البروتوكول الآخر المعروض هنا هو طريقة ثقافة الجهاز في اتجاه مجموعة ثابتة والتي تحسن جودة التصوير وتساعد على دراسة نشأة العضية على مستوى الخلية الواحدة.
الصور عالية الدقة هي مناسبة لتجزئة الخلايا الآلي ودراسة الكمبيوتر القائم على السلوك الخلوي في الغدد العضوية الكلوية وثقافات الكلى.
