نشكر U. Ganapati لإنشاء واختبار خط mStrawberry OP9 الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نشكر سعادة Shafifor مساعدتها مع الثقافة المشتركة. معتمد من قبل HP الزمالة من المعهد القومي للقلب والرئة والدم (F31HL087714) (HP). مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية المؤلف ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعهد القومي للقلب والرئة والدم أو المعاهد الوطنية للصحة (NIH). يتم اعتماد التدفق الخلوي مرفق الأساسية في جامعة كاليفورنيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (CA - 16042 - 28697 ومنظمة العفو الدولية) ، ومركز السرطان يونسون ، معهد كاليفورنيا للإيدز ، وكلية الطب في جامعة كاليفورنيا.

1. إعداد الخلايا ES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا ES الثقافة وفقا لبروتوكول موحد لخطك خلية معينة. تأكد من أن تعد وفاق خلايا كافية لوحة على الخلايا OP9 mStrawberry لليوم 0 (سيتم مطلي خلايا ES 1x10 في الخلايا لكل سم 3 ^ 2 في يوم 0) </li></ol> 2. إعداد OP9 الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تنامي الخلايا OP9 mStrawberry ، وإعداد وسائط النمو OP9 OP - 9 الثقافة خلية متوسطة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> الأوراق المالية </td><td> اضرب النهائي. </td><td> الحجم (مل) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS (OP - 9 اختبار) </td><td> 100 ٪ </td><td> 20 ٪ </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> 100X (200MM) </td><td> 2mm و </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table> مخزن عند 4 درجة مئوية ، واستخدام في غضون أسبوع من التحضير </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل الحفاظ على mStrawberry OP9 الخلايا ، يجب تغيير وسائل الاعلام كل يوم 2 وينبغي subcultured الخلايا قبل الوصول إلى الخلايا confluency (ثقافة فرعية في 70-90 ٪ confluency). ونمت أبدا الثقافات mStrawberry الخلية OP9 تتجاوز 90 ٪ confluency لأن هذا سيؤدي بهم إلى التمايز في الخلايا الشحمية. انظر الشكل 3. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة فرعية الخلايا خلايا غسل 2X مع برنامج تلفزيوني (أو مع 1X PBS + 0.1 ٪ مع التربسين 1X - EDTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قبل تحسنت بنسبة 0.1 ٪ التربسين - EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (أو حتى فصل الخلايا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يكون فصل الخلايا ، إضافة OP - 9 المتوسطة النمو. نقل الخلايا إلى أنبوب 50mL المخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend خلايا جديدة في وسائط النمو mStrawberry OP9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة خلايا في مناطق ذات كثافة أدنى من الخلايا 4 10 / سم 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا لmStrawberry OP9 confluency اعتبارا من 3 أيام قبل يوم اللازمة للخلايا ES شارك في زراعة (اليوم 0 ، يوم 5 أو Day8 / 9 من التجربة) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 المشارك الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام التفريق المشارك الثقافة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> الأوراق المالية </td><td> نهائي </td><td> الحجم (مل) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100 ٪ </td><td> 20 ٪ </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> 200MM </td><td> 2mm و </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 الخلايا (اليوم -3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة ثانوية دائما OP9 -3 خلايا في اليوم ، بحيث يكون لديك طبقات من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry ل 0 يوم الثقافة المشتركة. انظر الشكل 4B. لوحة mStrawberry OP9 الخلايا في 1x10 4 / سم 2 للconfluency في اليوم 0. تأكد من خلايا فرعية اضافية لليوم 5 ويوم 09/08 لاستمرار ثقافة المشترك. </li></ol></li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 شارك في انشاء ثقافة (يوم 0) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا ES 2X مع برنامج تلفزيوني </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا وفاق مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA ، يحضن لمدة 37 درجة مئوية @ 5min </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الوسائط تمايز الثقافة المشارك للخلايا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا ES في 400xg ، 5 - 7min ، RT. تجاهل طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في التمايز وسائل الاعلام المشارك الثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الاعلام من الخلايا OP9 mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الوسائط تمايز المشارك الثقافة قوارير OP9 mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة خلايا ES 1x10 3 / سم 2 إلى قارورة من الخلايا OP9 mStrawberry. احتضان خلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 مع الرطوبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 الخلايا (يوم 2) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 فرعية بحيث يكون لديك طبقات من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry ليوم 5 من الثقافة المشتركة. لوحة mStrawberry OP9 الخلايا في 1x10 4 / سم 2 للconfluency في يوم 5 (كما في الخطوة 3.2). تأكد من خلايا فرعية اضافية ليوم 8 / 9 ، إذا لزم الأمر (كما في الخطوة 2.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (اليوم 3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية متوسطة من الثقافة المشتركة واستبدال الطازجة متوسطة التمايز المشارك الثقافة </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (يوم 5) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل بعناية شارك في برنامج تلفزيوني مع الثقافات 2X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام التفريق المشارك الثقافة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">إضافة الوسائط تمايز الثقافة المشارك للخلايا. استخدام إبرة عيار 21 bluntended resuspend إلى الخلايا ، وضمان لتعليق خلية واحدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. يجب أن يكون 100-150 أضعاف زيادة في عدد الخلايا ES من اليوم 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة البذور 6.48x10 4 / سم 2 -- 7.76x10 4 / سم 2 المشترك لثقافة الخلايا في طبقة جديدة من متموجة ، وخلايا OP9 mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم 5 - المقايسات المتبقية يمكن استخدام المشترك لتحليل الخلايا الثقافة التدفق الخلوي ، cytopreps (30K الخلايا) ، المقايسات رقاقة ، الخ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 المشترك الثقافة (يوم 09/08 ويوم 12) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التفرقة وسائل الاعلام من القارورة وحفظها. غسل المونولاير مع 1X PBS لإزالة الخلايا المكونة للدم في التعليق. لا طرد الخلايا المكونة للدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا الملتصقة مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام وفاق وتمايز الخلايا المكونة للدم إضافة إلى العثور عليها في تعليق = </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المشارك ثقافة الإعلام تمايز أو برنامج تلفزيوني إلى الخلايا. استخدام إبرة عيار 21 bluntended resuspend إلى الخلايا وحيدة لضمان لعدد الخلايا الخلية تعليق باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا يمكن أن تستمر المشاركة في الثقافة لمدة 14 يوما لتقييم الأسلاف لدم أكثر نضجا من قبل خلايا شارك في ثقافة إعادة البذر على طبقة جديدة من متموجة ، وخلايا OP9 mStrawberry في يوم 8 أو 9 و ثم مرة أخرى في يوم 12. إعادة البذور المحسنة عدد الخلايا على أساس استرداد الخلية المطلوبة ليوم الفحص. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم ES المستمدة من سلالة (يوم 14/01). ويمكن تقييم ES - مشتقة ذرية في أي يوم من الثقافة المشتركة التي تدفق فرز الخلايا السلبية mStrawberry (ES - مشتقة النسل). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التفرقة وسائل الاعلام من القارورة وحفظها. غسل المونولاير مع 1X PBS لإزالة الخلايا المكونة للدم في التعليق. لا إرم من الخلايا المكونة للدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا الملتصقة مع 0.25 ٪ قبل تحسنت التربسين - EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارورة غسل الخلايا قبالة مع وسائل الاعلام التفريق المشارك ثقافة وإضافة إلى الخلايا المكونة للدم وجدت في تعليق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه في الخلايا 400xg ، 7min ، RT. تجاهل طاف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا مع عيار 21 إبرة bluntended والعد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن ذرية ES - مشتقة (الخلايا السلبية mStrawberry) يكون تدفق فرزها من الخلايا mStrawberry OP9 إيجابية. ويمكن عندئذ ذرية ES - مشتقة يتسم تحليل التدفق الخلوي ، cytopreps ، المقايسات رقاقة ، الخ. </li></ol></li></ol> 4. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. ES / mStrawberry OP9 المشارك ثقافة النظام. مختبر لدينا يستخدم في المختبر ES نظام المشاركة في زراعة الخلايا المكونة للدم لنموذج التنمية. في هذا النظام المشترك والثقافة ، وخلايا ES يفرق ، في hemangioblasts في Day5 ، عند وضعه على طبقة من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry. كما شارك في العائدات والثقافة ، والسلائف للدم موجودة في يوم 8 ، في حين الأنساب المتباينة للدم عضال تظهر قبل يوم 14. تشير الأسهم يوما من تمايز عند الركض من ES - مشتقة ذرية على طبقات جديدة من الخلايا متموجة OP9 mStrawberry في الضرورة. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تمايز الخلايا السليمة وفاق. هي خلايا ES المصنفة على طبقة من mStrawberry OP9 متكدسة في اليوم 0. ES - مشتقة تبدأ ذرية لتصبح مرئية في يوم 3 من التمايز ، مع وفاق المستمدة من سلالة تبدو وكأنها كتلة من الخلايا مع حدود محددة أو بداية لتشكيل نمط دوارة. ينبغي Hemangioblasts ، والتي هي مشتركة تمهيدا لأرومية متوسطة الأنساب البطانية والمكونة للدم ، كما تظهر تراكمت جدلات من الخلايا في يوم 5. لاشتراكهما في الثقافة فترات أطول من خمسة أيام ، ينبغي ES - مشتقة ذرية تظهر مجموعات من الخلايا المكونة للدم. سنتين إلى أربع مجموعات الخلية ، في يوم 6 / 7 ، ينبغي أن تظهر وتنمو في مجموعات أكبر خلية يوم 09/08 من الثقافة المشتركة. كما تم العثور على سلالة أخرى مشتقة ES بإحكام إلى طبقة الخلايا اللحمية ملتصقة. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. غير ناجحة تمايز الخلايا ES النتائج من هذه الثقافة المشتركة تعكس سوء تمايز الخلايا ES. لاحظ كيف ذرية ES - مشتقة لا تظهر في نمط دوارة في اليوم 5. لعدم وجود خلايا في نمط دوارة يشير تشكيل أرومة وعائية غير لائق. إذا أرومة وعائية لا تتطور بشكل صحيح ، ثم واصل المشاركة في الثقافة سيؤدي إلى توقف تمايز النسب المكونة للدم. يجب التخلص من التعاون مع الثقافات تشكيل أرومة وعائية غير لائق. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. mStrawberry الثقافات الخلية OP9 (A) هي subcultured mStrawberry OP9 في الخلية70-90 ٪ confluency. (B) للحصول على التمييز الصحيح ، وتوضع الخلايا وآله وفاق وفاق المستمدة متكدسة على طبقة من الخلايا بشكل مفرط OP9 mStrawberry. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. ممثل ES / mStrawberry OP9 ملف تدفق المشارك ثقافة جميع ذرية ES - مشتقة من خلايا mStrawberry السلبية ، ويمكن فرزها من تدفق الخلايا OP9 mStrawberry. تم تحديد mStrawberry بوابة الخلية السلبية باستخدام ES/OP9 التقليدية المشترك الثقافة.

<ol>
	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تمايز الخلايا السليمة ES متكدسة على طبقة من الخلايا OP9 mStrawberry النتائج في إنتاج hemangioblasts + Flk1 في يوم 5 من الثقافة المشتركة. وينبغي أن تظهر Hemangioblasts مكدسة ما يصل جدلات من الخلايا ، كما لوحظ في الشكل 1. للفترة المتبقية من الثقافة المشتركة ، وينبغي مرئية ES - مشتقة ذرية تظهر مجموعات من الخلايا المكونة للدم (الشكل 1). في 7 / Day6 ينبغي كتل الخلية 2-4 تظهر وتنمو في مجموعات أكبر خلية (على حد سواء وملتصقة في التعليق) من يوم 09/08 من الثقافة المشتركة. كما تم العثور على سلالة أخرى مشتقة ES بإحكام داخل طبقة الخلايا اللحمية ملتصقة. وإن لم تكن مدرجة في البروتوكول ، من الأهمية بمكان قبل اختبار FBS المستخدمة في وفاق متوسط ​​النمو ، والنمو OP9 mStrawberry سائل الإعلام وفاق / mStrawberry وسائل الاعلام التفريق OP9. اختبار المصل بشكل صحيح وينبغي ضمان النمو السليم لخلايا OP9 mStrawberry ، وكذلك ، والتمايز للخلايا السليمة وفاق في الثقافة المشتركة حتى يوم 5 من التمايز. كبديل أو بالإضافة إلى خلايا OP9 mStrawberry ، يمكن المشع OP9 الخلايا ، في 8000 راد ، قبل البذر في confluency (7.8x10 4 خلايا / سم 2). تشعيع الخلايا OP9 يسمح للقضاء على تكرار الخطوات replating ، وكذلك ، ويسمح للقضاء التام تقريبا من العمر ، وتلويث OP9 الخلايا من المقايسات المصب. وكانت المهندسة OP9 الخلايا في التعبير عن بروتين mStrawberry بواسطة transducing OP9 الخلايا مع 3ug/mL من mStrawberry ناقلات lentiviral معربا عن إطار السيطرة على المروج CMV (pRRLsin - CMV النواقل ، UCLA ناقلات الأساسية). معيار ES/OP9 ثقافة بروتوكولات التعاون يستتبع وضع الخلايا ES في الصعود إلى طبقة الخلايا OP9 متموجة ، وكذلك ، وهي خطوة replating يوم 5 من أجل الحد من العمر ، وتلويث OP9 مرور الخلايا من الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، تتم إزالة الخلايا المكونة للدم فقط وجدت في تعليق لتقييم ES - مشتقة ذرية. ومع ذلك ، مع خطوة على حد سواء replating وحصاد الخلايا تعليق واحد فقط من المحتمل يفتقد عددا كبيرا من البلدان النامية وفاق المستمدة من الخلايا المكونة للدم. هذه المسألة هامة للتصدي ليصبح عند محاولة توصيف للدم العيوب المرتبطة بخطوط ES خروج المغلوب. من أجل الالتفاف على هذه المشكلة تستخدم مختبرنا معدلة شارك في الثقافة ، من خلال استخدام mStrawberry ، معربا عن OP9 الخلايا. هذا يؤكد أن يتم نقل جميع ذرية ES لاستمرار التعاون الثقافة في يوم 5 ، وبالنسبة لموسم جني جميع ذرية ES - مشتقة عن المقايسات المصب. هذا التعديل يوفر أدوات مفيدة في تقييم وتوصيف للدم المستمدة من سلالة بشرية وخطوط ES الماوس. هذا ES - mStrawberry OP9 يلخص نموذج التعاون ثقافة مختلف مراحل بدائية ونهائية تكون الدم. في دراسة المراحل الأولى من التنمية للدم ، كثير من الناس استخدام BL - CFC (مثل انفجار الخلية تشكيل مستعمرة) الفحص ، التي تقيم في تطوير أرومة وعائية من الخلية ES. في حين أن الفحص BL - CFC هي أداة مفيدة للدم عند التحقيق في التنمية في وقت مبكر ، يسلك mStrawberry - ES شارك في الثقافة أنظمة المرافق زيادة لأنها تسمح لتقييم أرومة وعائية ، وكذلك ، الأنساب للدم مزيد من الكبار. وقد أظهرت الأعمال السابقة باستخدام OP9/ES التقليدية والبروتوكولات تمايز EB أن هناك عوامل إضافية ربما من الضروري ، مثل overexpression من HoxB4 ، من أجل استخلاص طويلة الأجل إعادة إسكانها الخلايا الجذعية المكونة للدم في المختبر. أعمال إضافية ضرورية لتقييم ما إذا كانت سلبية mStrawberry وفرزها وفاق المستمدة من السكان تحتوي على الخلايا الجذعية المكونة للدم الحقيقي.

OP - 9 متوسطة صيانة مكونات الخلية الأسهم <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> أوميغا العلمية </td><td> FB01 </td><td> قبل اختبار </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> التربسين - EDTA </td><td> وقف سيل تكنولوجيز </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 متوسطة مكونات تمايز الخلايا الأسهم <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> رقم كتالوج </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> قبل اختبار </td></tr><tr><td> L - الجلوتامين </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200MM </td></tr><tr><td> PBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td></td></tr><tr><td> التربسين - EDTA </td><td> وقف سيل تكنولوجيز </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

وتمايز الخلايا في المختبر من أجل التوصل إلى وفاق مصير الخلايا المكونة للدم ومفيدة عند دراسة السكان الخلية التي يصعب الوصول إليها في الجسم الحي والتي تتميز عن أقرب الجينات المسؤولة عن تكون الدم ، دون الاضطرار إلى التعامل مع lethalities الجنينية. وقد صممت في الأصل المشترك ES/OP9 ثقافة النظام لإنتاج الذرية المكونة للدم ، من دون إنتاج أكثر من الضامة ، كما هو اشتقاق خلايا انسجة OP9 خط من calvaria تصخر العظم من الفئران الطافرة التي تفتقر الوظيفية M - CSF. يمكن استخدام النظام في المختبر المشترك ES/OP9 الثقافة من أجل التنمية ألخص للدم في وقت مبكر. عندما مثقف على OP9 الخلايا اللحمية والخلايا ES تفرق في hemangioblasts + Flk - 1 ، أسلاف المكونة للدم ، وتنضج في النهاية ، الأنساب المتباينة عضال. المعيار المشترك ES/OP9 ثقافة يستتبع بروتوكول موضع وفاق على خلايا طبقة متموجة من OP9 الخلايا ، وكذلك دورية replating الخطوات من أجل إزالة القديمة ، وتلويث OP9 الخلايا. وعلاوة على ذلك ، والبروتوكولات الحالية تنطوي على تقييم فقط على الخلايا المكونة للدم وجدت في تعليق وليست الأمثل لتقييم ES - مشتقة ذرية في كل يوم من التمايز. ومع ذلك ، مع الخطوات replating وحصاد الخلايا تعليق واحد فقط من المحتمل يفتقد جزء كبير من وفاق المستمدة من سلالة الخلايا المكونة للدم والبلدان النامية. هذه المسألة هامة للتصدي ليصبح عند محاولة توصيف للدم العيوب المرتبطة بخطوط ES خروج المغلوب. نحن هنا وصف تعديل ES / mStrawberry OP9 شارك في الثقافة ، والذي يسمح للقضاء على الخلايا من تلويث OP9 المقايسات المصب. هذا الأسلوب يسمح للتقييم الشامل لجميع ذرية ES - مشتقة في جميع أيام الثقافة المشتركة ، مما أسفر عن نمط التمييز المكونة للدم ، والذي يتوافق بشكل مباشر للنمط التمايز للدم لاحظ داخل الجنين.

Watch this Scientific Journal Video about Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny at JoVE.com

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9 الخلايا تسمح لتقييم كامل لجميع ذرية ES المستمدة من الثقافة المشتركة.

تعديل ES / OP9 المشارك الثقافة ينص البروتوكول خصائص محسنة من النسل للدم

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Views.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9 الخلايا تسمح لتقييم كامل لجميع ذرية ES المستمدة من الثقافة المشتركة.

Video: Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

تجميد الخلايا البشرية ES

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

ES خلايا الإنسان : ثقافة ابتداء من خلايا مجمدة

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES الخلية المستمدة من الثقافات خلية عصبية ظهارية

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

صاروخ موجه من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظام

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

حجرة متعددة الخلية العصبية الجهاز العصبي المركزي ، الدبقية منهاج ميكروفلويديك المشارك الثقافة

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

ميكروفلويديك المشارك ثقافة الخلايا الظهارية والبكتيريا للتحقيق في ذوبان الإشارات بوساطة التفاعلات

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

عزل الخلايا الظهارية الثديية من ثلاثي الأبعاد الخلايا المختلطة الجسم الشبه الكروي ثقافة المشارك

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

استنساخ فرعي زائد الإدراج (SPI) - رواية الطريقة Recombineering عن البناء السريع للجين استهداف ناقلات

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...