אנו מודים U. Ganapati להקמת ובדיקה של הקו OP9 mStrawberry התא. בנוסף, אנו מודים ח Shafifor הסיוע שלה עם התרבות המשותפת. HP נתמכת על ידי מענק מן הלאומי ללב, ריאות, ודם המכון (F31HL087714) (HP). התוכן של עבודה זו היא באחריות הבלעדית של המחבר ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של לב ריאה הלאומי, ודם המכון או המכון הלאומי לבריאות (NIH). Cytometry זרימה UCLA מתקן Core נתמכת על ידי NIH (CA-16042 ו-AI-28697), סרטן Jonsson מרכז האיידס UCLA המכון, ובית הספר לרפואה של UCLA.

1. הכנת תאים ES <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES התרבות התאים על פי פרוטוקול סטנדרטי קו התא הספציפי שלך. הקפד להכין תאים ES מספיק על צלחת של תאים OP9 mStrawberry יום 0 (תאים ES יהיה מצופה ב 1x10 ^ 3 ס&quot;מ 2 תאים לכל יום בו 0) </li></ol> 2. הכנת OP9 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני גדל OP9 תאים mStrawberry, להכין את OP9 התקשורת צמיחה OP-9 תרבית תאים בינוני <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מניות </td><td> סופי קונצרט כלשהו. </td><td> נפח (מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 נבדק) </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 100x (200mm) </td><td> 2mm </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table> חנות ב 4 ° C ושימוש בתוך שבוע הכנה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על mStrawberry OP9 תאים, התקשורת חייבת להיות שונה בכל 2 ימים תאים צריך להיות subcultured לפני תאים להגיע confluency (תת על 70-90% confluency). mStrawberry OP9 בתרביות תאים לא בוגרים מעבר ל -90% confluency כמו זו תגרום הבידול שלהם לתוך adipocytes. ראה איור 3. <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים על ידי תאים תת כביסה 2X עם PBS (או 1x עם PBS% + 0.1 1x עם טריפסין-EDTA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טרום חימם 0.1% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (או עד תאים לנתק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים יש מנותקת, להוסיף OP-9 בינוני צמיחה. העברת התאים שפופרת 50 מ&quot;ל קונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה XG 300 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מחק supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב טרי OP9 התקשורת mStrawberry צמיחה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים בצפיפות מינימום של 4 תאים 10 / 2 ס&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול mStrawberry OP9 התאים confluency החל 3 ימים לפני יום הדרושים שיתוף culturing תאים ES (יום 0, יום 5, או Day8 / 9 של הניסוי) </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שותף תרבות התקשורת בידול <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> מניות </td><td> סופי </td><td> נפח (מ&quot;ל) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 100% </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> 200mm </td><td> 2mm </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50 מ&quot;ל </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 תאים (יום -3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד תת OP9 תאים -3 הימים, כך שיש לך שכבות של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry עבור 0 יום של תרבות משותפת. ראו תרשים 4 ב. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס&quot;מ עבור confluency ב יום 0. הקפד תאים עודפים תת ליום 5 ויום 09/08 להמשך תרבות משותפת. </li></ol></li><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף התרבות הגדרת (יום 0) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li class="jove_content" style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים ES 2x עם PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים ES עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA, דגירה של 5min @ 37 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ES תאים ב 400xg, 5-7min, RT. בטל supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב Co-תרבות התקשורת בידול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה OP9 תאים mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול כדי צלוחיות mStrawberry OP9 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1x10 3 תאים ES / 2 ס&quot;מ על בקבוק של OP9 תאים mStrawberry. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם לחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> mStrawberry OP9 תאים (יום 2) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MStrawberry תת OP9 כך יש לך ומחוברות שכבות של תאים OP9 mStrawberry יום 5 של תרבות משותפת. פלייט mStrawberry OP9 תאים ב 1x10 4 / 2 ס&quot;מ עבור confluency יום ב 5 (כמו בשלב 3.2). הקפד תאים עודפים תת ליום 8 / 9, במידת הצורך (כמו בשלב 2.2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 3) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות בינוני מתרבות שיתוף ולהחליף בינוני טרי משותף תרבות בידול </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 5) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בזהירות שיתוף תרבויות 2x עם PBS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוספת שותף לתרבות התקשורת בידול לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח להשעיה תא בודד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer. האם יש 100-150 גידול של פי מספר תאים ES מיום 0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-זרע 6.48x10 4 / 2 ס&quot;מ - 7.76x10 4 / 2 ס&quot;מ שיתוף התרבות התאים על שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 5 מבחני-נותרת שיתוף התרבות תאים יכול לשמש עבור ניתוח תזרים cytometry, cytopreps (30K תאים), מבחני CHIP, וכו &#39; </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות (יום 8 / 9 ויום 12) <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. לזרוק אל מחוץ לתאי hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם התקשורת בידול ES ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה = </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים גלולה בשעה 400xg, 7min, RT. מחק supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף משותף תרבות בידול התקשורת או PBS לתאים. השתמש מחט 21-מד bluntended resuspend אל התאים ולהבטיח יחיד השעיית ספירת תאים תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף התרבות ניתן נמשך 14 ימים כדי להעריך אבות hematopoietic יותר בוגרת מחדש על ידי זריעת שיתוף התרבות תאים על גבי שכבה חדשה של ומחוברות, OP9 תאים mStrawberry בכל יום 8 או 9 ואז שוב ביום 12. Re-תא זרע מספר אופטימיזציה המבוסס על התאוששות התא נדרש יום assay. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של הצאצאים ES-derived (יום 1-14). ES-derived הצאצאים ניתן להעריך בכל יום של תרבות משותפת על ידי זרימת מיון תאים שלילי mStrawberry (ES-derived הצאצאים). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מדיה בידול מן הבקבוק ולשמור. לשטוף monolayer 1x עם PBS להסיר תאים hematopoietic ההשעיה. אין להשליך החוצה תאים hematopoietic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize תאים חסיד עם 0.25% טרום חימם טריפסין-EDTA </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבקבוק תאים עם שותף לתרבות התקשורת בידול ולהוסיף תאים hematopoietic למצוא השעיה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים ב 400xg, 7min, RT. בטל supernatant </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend עם מחט 21-מד לספור bluntended ו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצאצאים ES-derived (תאים שלילי mStrawberry) יכול להיות זרימה של מיון mStrawberry OP9 תאים חיובית. הצאצאים ES-derived אז יכול להיות מאופיין על ידי ניתוח תזרים cytometry, cytopreps, מבחני CHIP, וכו &#39; </li></ol></li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. ES / mStrawberry OP9 משותף התרבות המערכת. המעבדה שלנו משתמשת במערכת במבחנה ES תא שיתוף התרבות לפיתוח מודל hematopoietic. במערכת שיתוף תרבות זו, תאים ES להבדיל, לתוך hemangioblasts ב Day5, כאשר הניח על שכבה של ומחוברות OP9 תאים mStrawberry. כמו שיתוף תרבות התמורה, מבשרי hematopoietic נוכחים יום 8, בעוד שושלות hematopoietic הבדיל סופני להופיע עד יום 14. החצים מצביעים על ימים של בידול כאשר passaging של הצאצאים ES-נגזר על שכבות ומחוברות חדש של תאים OP9 mStrawberry ב הצורך. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ES פרופר התמיינות תאים. לתאי גזע עובריים הם זורעים על שכבת ומחוברות של mStrawberry OP9 ב יום 0. ES-derived הצאצאים מתחילים להיות גלוי בכל יום 3 של בידול, עם ES-derived הצאצאים נראה כמו מקבץ של תאים עם גבול מוגדר או מתחילים ליצור דפוס במערבולת. Hemangioblasts, שהם מבשר mesodermal משותף השושלות האנדותל hematopoietic, אמור להופיע כמו נערמו דורים של תאים בכל יום 5. עבור שיתוף תרבות תקופות ארוכות יותר מחמישה ימים, ES-derived הצאצאים אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic. שניים עד ארבעה אשכולות תאיים, יום ב 6 / 7, אמורה להופיע ולצמוח לתוך צבירי תאים גדולים עד יום 09/08 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם קשור בחוזקה שכבת תאים חסיד סטרומה. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הבחנה מוצלחת תא ES. תוצאות מתרבות שיתוף זה משקף הבחנה פסולה תא ES. שים לב איך הצאצאים ES-derived אינם מופיעים בדפוס במערבולת ב יום 5. היעדרם של תאים דפוס במערבולת מציין היווצרות hemangioblast פסולים. אם hemangioblast לא מתפתח כראוי, ולאחר מכן המשיך שיתוף תרבות תגרום בידול ננסיים השושלת hematopoietic. משותף עם היווצרות תרבויות hemangioblast פסולים אמור להיות מושלך. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. mStrawberry OP9 תא תרבויות. (א) תא mStrawberry OP9 הם subcultured בביתConfluency 70-90%. (ב) הבחנה נכונה, תאים ES ו ES-derived הצאצאים מונחות על שכבת ומחוברות מדי של תאים OP9 mStrawberry. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5. נציג ES / mStrawberry OP9 שותף תרבות פרופיל זרימה. כל הצאצאים ES-derived הם תאים שלילי mStrawberry וניתן תזרים מיון מן OP9 תאים mStrawberry. תא mStrawberry שער שלילי נקבע באמצעות ES/OP9 המסורתית שיתוף תרבות.

<ol>
	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התמיינות תקינה של תאים ES ומחוברות על שכבה של תאים OP9 תוצאות mStrawberry בייצור Flk1 hemangioblasts + בכל יום 5 של תרבות משותפת. Hemangioblasts אמור להופיע כמו נערמו למעלה דורים של תאים, כפי שנצפה באיור 1. במשך שארית של תרבות משותפת, הצאצאים גלוי ES-derived אמור להופיע כמו אשכולות של תאים hematopoietic (איור 1). בשלב Day6 / 7 03:58 אשכולות התא אמור להופיע ולצמוח לתוך אשכולות תא גדול (הן חסיד ועל השעיה) על ידי ביום 8 / 9 של תרבות משותפת. הצאצאים ES אחרים הנגזרים מצויים גם הדוק בתוך שכבת התאים חסיד סטרומה. אמנם לא מופיע בפרוטוקול, חשוב לבדוק מראש FBS בשימוש במדיום ES צמיחה, mStrawberry OP9 התקשורת הצמיחה ES / mStrawberry OP9 התקשורת בידול. נבדק כראוי בסרום צריכה להבטיח צמיחה תקינה של תאים OP9 mStrawberry, כמו גם, התמיינות תקינה של תאים ES בתרבות המשותפת עד יום 5 של בידול. כחלופה או בנוסף OP9 תאים mStrawberry, OP9 תאים יכול להיות מוקרן, ב 8000 rads, לקראת זריעת ב confluency (7.8x10 4 תאים / ס&quot;מ 2). הקרנה של OP9 תאים מאפשר לחיסולה של צעדים replating חוזרות ונשנות, וכן, מאפשר ביטול כמעט מוחלט של הישן, זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם. OP9 התאים היו שהונדסו חלבון mStrawberry ידי transducing OP9 תאים עם 3ug/mL של mStrawberry וקטור lentiviral להביע תחת שליטתו של מקדם CMV (pRRLsin-CMV וקטור, וקטור הליבה UCLA). תקן ES/OP9 שיתוף תרבות פרוטוקולים כרוך את המיקום של תאים ES על OP9 ומחוברות שכבת תאים, כמו גם, 5 היום צעד replating על מנת לצמצם ישנים, מזהמים OP9 תאים מעבר לתא. בנוסף, רק תאים hematopoietic למצוא ההשעיה יוסרו להערכת הצאצאים ES-derived. עם זאת, בצעד הן replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק ​​פוטנציאל מתגעגע מספר לא מבוטל של המתפתח בתאי גזע עובריים שמקורם hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כדי לעקוף בעיה זו המעבדה שלנו השתמשו שונה שיתוף התרבות, באמצעות mStrawberry-לבטא OP9 תאים. זה מבטיח כי כל הצאצאים ES מועברים להמשך שיתוף התרבות ביום 5, ועל היבול של הצאצאים ES-derived כל מבחני במורד הזרם. שינוי זה מספק כלים שימושיים בהערכת ואפיון של הצאצאים hematopoietic נגזר האדם והן ES קווי העכבר. זה ES-mStrawberry OP9 שיתוף התרבות המודל משחזר את השלבים השונים פרימיטיבי hematopoiesis סופי. בשנת לימוד בשלבים המוקדמים של הפיתוח hematopoietic, אנשים רבים להשתמש BL-CFC (הפיצוץ דמוי תא המושבה להרכיב) assay, אשר להעריך את התפתחות hemangioblast מהתא ES. בעוד assay BL-CFC הוא כלי שימושי כאשר חוקרת התפתחות hematopoietic מוקדם, mStrawberry-ES שיתוף התרבות מערכות תערוכות השירות להגדיל שכן היא מאפשרת להערכת hemangioblast, כמו גם, שושלות hematopoietic מבוגר יותר. עבודות קודמות באמצעות OP9/ES מסורתיים בידול פרוטוקולים EB הוכיחו כי גורמים נוספים הדרושים אולי, כמו overexpression של HoxB4, על מנת להפיק לטווח ארוך repopulating בתאי גזע hematopoietic במבחנה. עבודה נוסף יש צורך להעריך אם mStrawberry שלילית, מיון ES-derived אוכלוסיות מכילים נכון בתאי גזע hematopoietic.

OP-9 תחזוקה Cell בינוני במלאי רכיבי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> אומגה מדעי </td><td> FB01 </td><td> טרום נבדק </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 התמיינות תאים בינוני במלאי רכיבי <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> טרום נבדק </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> PBS (ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין-EDTA </td><td> תא גזע טכנולוגיות </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

התמיינות של תאים במבחנה ES כלפי גורל התא hematopoietic שימושי כאשר לומדים אוכלוסיות תאים שקשה גישה in vivo ו לאפיון גנים המוקדם מעורב hematopoiesis, מבלי להתמודד עם lethalities עובריים. ES/OP9 שיתוף התרבות מערכת תוכנן במקור כדי לייצר צאצאים hematopoietic, ללא ייצור של מעל מקרופאגים, כמו קו OP9 תא סטרומה נגזר מכסה הגולגולת של עכברים מוטנטים osteopetrosis כי חוסר פונקציונלי M-CSF. במערכת במבחנה שיתוף תרבות ES/OP9 ניתן להשתמש כדי לשחזר פיתוח hematopoietic מוקדם. כאשר תאים בתרבית על OP9 סטרומה, תאים עובריים להתמיין Flk-1 + hemangioblasts, אבות hematopoietic, ובוגרת ולבסוף, שושלות הבדיל סופניים. תקן ES/OP9 שיתוף התרבות פרוטוקול מחייב את המיקום של תאים ES על שכבת ומחוברות OP9 של תאים, כמו גם צעדים replating תקופתיות כדי להסיר את הישן, זיהום OP9 תאים. יתר על כן, פרוטוקולים הנוכחי לערב להעריך רק את התאים hematopoietic למצוא השעיה ולא מותאמים הערכה של הצאצאים ES-נגזר על כל יום של בידול. עם זאת, עם צעדים replating ואת קצירת של תאים ההשעיה רק ​​פוטנציאל מחמיץ חלק גדול של צאצאים ES-derived ופיתוח תאים hematopoietic. נושא זה הופך להיות חשוב לטפל כאשר מנסים לאפיין פגמים hematopoietic הקשורים קווי ES בנוקאאוט. כאן אנו מתארים שונה ES / mStrawberry OP9 שיתוף תרבות, המאפשרת מניעת זיהום OP9 תאים מבחני במורד הזרם. שיטה זו מאפשרת הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל כלל ימים של תרבות משותפת, וכתוצאה מכך דפוס בידול hematopoietic, אשר באופן ישיר יותר מתאים לדפוס בידול hematopoietic נצפתה בתוך העובר.

Watch this Scientific Journal Video about Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny at JoVE.com

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.

השתנה ES / OP9 שותף לתרבות פרוטוקול מספקת שירותי אפיון משופר צאצאיהם hematopoietic

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

20.5K Views.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9 התאים מאפשרים הערכה מלאה של הצאצאים ES-derived כל מתרבות משותפת.

Video: Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

Freezing Human ES Cells

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove residual media that could otherwise quench the Trypsin reaction.  Warmed 0.05% Trypsin-EDTA is then added to cover the cells, and the plate allowed to incubate for up to 5 mins at room temperature.  During this time cells can be observed rounding, and colonies lifting off the plate surface.  Gentle repeated pipetting will remove cells and colonies from the plate surface.  Trypsinized cells are placed in a standard conical tube containing pre-warmed hES cell media to quench remaining trypsin, and then spun.  Cells are resuspended growth media at a concentration of approximately one million cells in one mL of media, a concentration such that one frozen aliquot is sufficient to resurrect a culture on a 10cm plate.  After cells are adequately resuspended, ice cold freezing media is added at equal volume.  Cell suspensions are mixed thoroughly, aliquoted into freezing vials, and allowed to slowly freeze to -80C over 24 hours.  Frozen cells can then moved to the vapor phase of liquid nitrogen for long term storage, or remain at -80 for approximately six months.

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.

הקפאת ES תאים אנושיים

Here we demonstrate how our lab freezes HuES human embryonic stem cell lines.  A healthy, exponentially expanding culture is washed with PBS to remove ...

Human ES cells: Starting Culture from Frozen Cells

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  approximately one (to two) million irradiated mouse embryonic fibroblast feeder cells is rinsed with HuES media to remove residual serum and cell debris, and then HuES media added and left to equilibrate in the cell culture incubator.  A frozen vial of cells from long term liquid nitrogen storage or a -80C freezer is sourced and quickly submerged in a 37C water bath for quick thawing.  Cells in freezing media are then removed from the vial and placed in a large volume of HuES media.  The large volume of HuES media facilitates removal of excess serum and DMSO, which can cause HuES human embryonic stem cells to differentiate.  Cells are gently spun out of suspension, and then re-suspended in a small volume of fresh HuES media that is then used to seed the MEF plate.  It is considered important to seed the MEF plate by gently adding the HuES cells in a drop wise fashion to evenly disperse them throughout the plate.  The newly established HuES culture plate is returned to the incubator for 48 hrs before media is replaced, then is fed every 24 hours thereafter.

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.

ES תאים אנושיים: תרבות החל מ תאים קפואים

Here we demonstrate how our lab begins a HuES human embryonic stem cell line culture from a frozen stock.  First, a one to two day old ten cm plate of  ...

ES Cell-derived Neuroepithelial Cell Cultures

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In general, the differentiation of ES cells follows the concept to first generate immature progenitor cells, which then can be propagated and differentiated into mature cellular phenotypes. This also applies for ES cell-derived neurogenesis, in which the development of neural cells follows two major steps: First, the derivation and expansion of immature neuroepithelial precursors and second, their differentiation into mature neural cells. A common method to produce neural progenitors from ES cells is based on embryoid body (EB) formation, which reveals the differentiation of cells from all germ layers including neuroectoderm. An alternative and more efficient method to induce neuroepithelial cell development uses stromal cell-derived inducing activity (SDIA), which can be achieved by co-culturing ES cells with skull bone marrow-derived stromal cells (1). Both, EB formation and SDIA, reveal the development of rosette-like structures, which are thought to resemble neural tube- and/or neural crest-like progenitors. The neural precursors can be isolated, expanded and further differentiated into specific neurons and glia cells using defined culture conditions. Here, we describe the generation and isolation of such rosettes in co-culture experiments with the stromal cell line MS5 (2-5).

Derivation of neuroepithelial precursors from embryonic stem (ES) cells using stromal cell-derived inducing activity (SDIA).

ES Cell-נגזר תא תרבויות Neuroepithelial

ES cells have the potential to differentiate into cells from all germ layers, which makes them an attractive tool for the development of new therapies. In ...

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

רביה של האדם גזע עובריים (ES) תאים

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

ביות של תאים hematopoietic אל מח העצם

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A Multi-compartment CNS Neuron-glia Co-culture Microfluidic Platform

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to six independent experiments in parallel for higher-throughput. We developed a new fabrication method to create microfluidic devices having both micro and macro scale structures within the same device through a single soft-lithography process, enabling mass fabrication with good repeatability.
The multi-compartment microfluidic co-culture platform is composed of one soma compartment for neurons and six axon/glia compartments for oligodendrocytes (OLs). The soma compartment and axon/glia compartments are connected by arrays of axon-guiding microchannels that function as physical barriers to confine neuronal soma in the soma compartment, while allowing axons to grow into axon/glia compartments. OLs loaded into axon/glia compartments can interact only with axons but not with neuronal soma or dendrites, enabling localized axon-glia interaction studies. The microchannels also enabled fluidic isolation between compartments, allowing six independent experiments to be conducted on a single device for higher throughput.
Soft-lithography using poly(dimethylsiloxane) (PDMS) is a commonly used technique in biomedical microdevices. Reservoirs on these devices are commonly defined by manual punching. Although simple, poor alignment and time consuming nature of the process makes this process not suitable when large numbers of reservoirs have to be repeatedly created. The newly developed method did not require manual punching of reservoirs, overcoming such limitations. First, seven reservoirs (depth: 3.5 mm) were made on a poly(methyl methacrylate) (PMMA) block using a micro-milling machine. Then, arrays of ridge microstructures, fabricated on a glass substrate, were hot-embossed against the PMMA block to define microchannels that connect the soma and axon/glia compartments. This process resulted in macro-scale reservoirs (3.5 mm) and micro-scale channels (2.5 &mu;m) to coincide within a single PMMA master. A PDMS replica that served as a mold master was obtained using soft-lithography and the final PDMS device was replicated from this master.
Primary neurons from E16-18 rats were loaded to the soma compartment and cultured for two weeks. After one week of cell culture, axons crossed microchannels and formed axonal only network layer inside axon/glia compartments. Axons grew uniformly throughout six axon/glia compartments and OLs from P1-2 rats were added to axon/glia compartments at 14 days in vitro for co-culture.

We developed a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research. The platform is capable of conducting up to six independent experiments in parallel and was fabricated using a newly developed macro/micro hybrid fabrication method.

תא Multi-CNS-Neuron גליה שותף תרבות Microfluidic רציף

We present a novel multi-compartment neuron co-culture microsystem platform for in vitro CNS axon-glia interaction research, capable of conducting up to ...

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work has been done using classical two-dimensional cell culture models, which allow for easy cell manipulation. It has become clear that intracellular signaling pathways are affected by extracellular forces, including dimensionality and cell surface tension3-4. Multiple approaches have been taken to develop three-dimensional models that more accurately represent biologic tissue architecture3. While these models incorporate multi-dimensionality and architectural stresses, study of the consequent effects on cells is less facile than in two-dimensional tissue culture due to the limitations of the models and the difficulty in extracting cells for subsequent analysis.
The important role of the microenvironment around tumors in tumorigenesis and tumor behavior is becoming increasingly recognized4. Tumor stroma is composed of multiple cell types and extracellular molecules. During tumor development there are bidirectional signals between tumor cells and stromal cells5. Although some factors participating in tumor-stroma co-evolution have been identified, there is still a need to develop simple techniques to systematically identify and study the full array of these signals6. Fibroblasts are the most abundant cell type in normal or tumor-associated stromal tissues, and contribute to deposition and maintenance of basement membrane and paracrine growth factors7.
Many groups have used three dimensional culture systems to study the role of fibroblasts on various cellular functions, including tumor response to therapies, recruitment of immune cells, signaling molecules, proliferation, apoptosis, angiogenesis, and invasion8-15. We have optimized a simple method for assessing the effects of mammary fibroblasts on mammary epithelial cells using a commercially available extracellular matrix model to create three-dimensional cultures of mixed cell populations (co-cultures)16-22. With continued co-culture the cells form spheroids with the fibroblasts clustering in the interior and the epithelial cells largely on the exterior of the spheroids and forming multi-cellular projections into the matrix. Manipulation of the fibroblasts that leads to altered epithelial cell invasiveness can be readily quantified by changes in numbers and length of epithelial projections23. Furthermore, we have devised a method for isolating epithelial cells out of three-dimensional co-culture that facilitates analysis of the effects of fibroblast exposure on epithelial behavior. We have found that the effects of co-culture persist for weeks after epithelial cell isolation, permitting ample time to perform multiple assays. This method is adaptable to cells of varying malignant potential and requires no specialized equipment. This technique allows for rapid evaluation of in vitro cell models under multiple conditions, and the corresponding results can be compared to in vivo animal tissue models as well as human tissue samples.

A simple method is described for analyzing effects of tissue fibroblasts on associated epithelial cells. The combination of this method and three-dimensional tissue culture can facilitate analysis of cells after isolation from 3D. The technique is applicable to cells of varying malignant potential, allowing systematic study of effects of tumor-associated stroma on tumor cells.

בידוד של תאים אפיתל החלב של תלת ממדי תאים משולבים תרבות משותפת אליפטית

While enormous efforts have gone into identifying signaling pathways and molecules involved in normal and malignant cell behaviors1-2, much of this work ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

Subcloning Plus ההכנסה (SPI) - Recombineering שיטה חדשה לבנייה המהירה של וקטורי גן המיקוד

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...