우리는 설치 및 mStrawberry OP9 세포 라인의 테스트 U. Ganapati 감사합니다. 또한, 우리는 공동 문화와 H. Shafifor 한테 도움을 주셔서 감사합니다. HP는 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 (F31HL087714) (HP)의 화목에 의해 지원됩니다. 이 작품의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 심장, 폐, 그리고 혈액 연구소 또는 국립 보건원 (NIH)의 공식 견해를 대변하지 않습니다. UCLA의 유동세포계측법 핵심 시설은 NIH (CA - 16042 및 AI - 28697), 존슨 암 센터, UCLA 에이즈 연구소와 의학의 UCLA 학교에서 지원됩니다.

1. ES 세포의 준비 <ol><li> 특정 세포 라인에 대한 표준 프로토콜에 따라 문화 ES 세포. 일 0 mStrawberry OP9 세포의 접시에 충분한 ES 세포를 준비하십시오 (ES 세포는 일 0 cm 2 당 1x10 ^ 3 세포에서 도금됩니다) </li></ol> 2. OP9 세포의 준비 <ol><li> 성장 mStrawberry OP9 세포 전에 OP9 성장 미디어를 준비 OP - 9 세포 배양 매체 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 재고 </td><td> 최종 CONC. </td><td> 볼륨 (ML) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS (OP - 9 테스트) </td><td> 백퍼센트 </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 100X (200mM) </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table> 4 스토어 ° C와 준비 후 일주일 이내에 사용 </li><li> mStrawberry OP9 세포를 유지하기 위해, 미디어, 2 일마다 변경해야하며 세포는 사전 (confluency 70~90%에서 subculture) confluency 도달 세포 subcultured해야합니다. 이 adipocytes에 자신의 차별을 초래할 수 있으므로 mStrawberry OP9 세포 문화는 confluency 90% 벗어났소되지 않습니다. 그림 3을 참조하십시오. <ol class="lalpha"><li> PBS (또는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS + 0.1 % 1X와 1X)와 배 세척 세포 Subculture 세포 </li><li> 37 미리 예열 0.1 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 ° 5 분 C (또는 셀 분리까지) </li><li> 세포가 분리되면 OP - 9 성장 매체를 추가합니다. 50mL 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 상온에서 5 분 300 XG에 펠렛 전지는. 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 신선한 mStrawberry OP9 성장 매체 Resuspend 세포 </li><li> 10 4 세포 / cm 2의 최소 밀도에서 플레이트 세포 </li><li> 공동 culturing의 ES 세포 (주 0, 5 일, 또는 실험의 Day8 / 9)에 필요한 일 이전에 삼일 시작 confluency에 mStrawberry OP9 세포 성장 </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 공동 문화 <ol><li> 공동 문화 차별 미디어 준비 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 재고 </td><td> 최종 </td><td> 볼륨 (ML) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39.5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 백퍼센트 </td><td> 20% </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> 200mM </td><td> 2mM </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50mL </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 세포 (데이 -3) <ol class="lalpha"><li> 항상 주 -3에 OP9 세포가 공동 문화의 주 0 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고 있도록 Subculture. 그림 4B를 참조하십시오. 일 0 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry는 OP9 세포. 5 일 및 공동 문화의 지속을위한 일 9분의 8에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 설정 (데이 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> PBS로 2X ES 세포 와시 </li><li> 5 분 @ 37에 대한 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 부화와 ES 세포를 Trypsinize ° C </li><li> 세포에 공동 문화 차별 미디어 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 ES 세포, 5 - 7min, RT. 뜨는 취소 </li><li> 공동 문화 차별화 미디어에 Resuspend 세포 </li><li> mStrawberry OP9 세포에서 미디어를 제거 </li><li> mStrawberry OP9의 flasks에 공동 문화 차별 미디어 추가 </li><li> mStrawberry OP9 세포의 플라스크에 플레이트 1x10 3 ES 세포 / cm 2. 37 세포를 품어 ° C 5 % 습도 CO 2. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 전지 (주 2) <ol class="lalpha"><li> Subculture의 mStrawberry OP9가 그래서 당신은 공동 문화의 날 5 mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어를 가지고. 주 5 confluency에 대한 1x10 4 / cm 2 판 mStrawberry은 OP9 세포 (단계 3.2 등). 일 9분의 8 필요한 경우 (같은 단계 2.2)에 대한 추가 subculture 세포를해야합니다. </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (3 일) <ol class="lalpha"><li> 조심스럽게 공동 문화 매체를 제거하고 신선한 공동 문화 차별화 매체로 교체 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (5 일) <ol class="lalpha"><li> 조심스럽게 PBS로 2 배 공동 문화를 씻어 </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 세포 Trypsinize </li><li> 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻어 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소 </li><li>세포에 공동 문화 차별 미디어를 추가. 세포를 resuspend하고 단일 세포 현탁액에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘을 사용 bluntended </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 주 0에서 ES 세포 번호 100-150 배 증가 있어야합니다. </li><li> 다시 씨앗 6.48x10 4 / cm 2 - 합류, mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 7.76x10 4 / cm 2 공동 문화 전지 </li><li> 일 5 ASSAYS - 남은 공동 문화 전지는 유동세포계측법 분석, cytopreps (30K 세포), 칩 assays 등을 사용할 수 있습니다 </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 공동 문화 (주 9분의 8 앤드 데이 12) <ol class="lalpha"><li> 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. 서스펜션의 조혈 세포를 제거하는 PBS로 세척 monolayer 1X가. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오. </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize </li><li> ES의 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지 = 발견 조혈 세포에 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포는, 7min, RT가. 뜨는 취소 </li><li> 세포에 공동의 문화 분화 미디어 또는 PBS를 추가합니다. 셀을 resuspend하고 hemocytometer를 사용하여 단일 세포 현탁액의 개수 세포에 대한 보장하기 위해 21 게이지 바늘 bluntended을 사용합니다. </li><li> 공동 문화 일 12 일에 다시 다음 주 8 9 합류, mStrawberry OP9 세포의 새 레이어에 다시 시딩 공동 문화 세포에 의해 더 성숙 조혈 progenitors을 평가하고 14 일 동안 계속하실 수 있습니다. 분석의 하루 필요한 세포 회복에 따라 다시 씨앗 최적의 핸드폰 번호. </li></ol></li><li> ES - 파생 자손 (주 1-14)의 평가. ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포 (ES - 파생 자손) 밖으로 정렬 흐름 공동 문화의 모든 일에 평가할 수있다. <ol class="lalpha"><li> 플라스크에서 차별 미디어를 제거하고 저장합니다. PBS로 세척 monolayer 1X는 정지 조혈 세포를 제거하려면 다음과 같이하십시오. 조혈 세포를 밖으로 던져하지 마십시오. </li><li> 사전 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)와 자기편 세포 Trypsinize </li><li> 공동 문화 차별화 미디어 플라스크에서 세포를 씻고 정지에있는 조혈 세포에 추가 </li><li> 400xg에서 펠렛 세포, 7min, RT. 뜨는 취소 </li><li> 21 게이지 바늘 bluntended 및 계산과 셀 Resuspend </li><li> ES - 파생 자손 (mStrawberry 부정적인 세포)는 mStrawberry 긍정적인 OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. ES - 파생 자손은 다음 유동세포계측법 분석, cytopreps, 칩 assays 등 특색 수 있습니다 </li></ol></li></ol> 4. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. ES / mStrawberry OP9 공동 문화 시스템. 우리 연구실 모델 조혈 개발에 체외 ES 세포 공동 배양 시스템을 사용합니다. mStrawberry OP9 세포의 합류 레이어에 배치 때이 공동 문화 시스템에서 ES 세포는 Day5에서 hemangioblasts로, 차별. 말기 차별화된 조혈 lineages은 주 14 나타나는 동안 공동 문화가 진행되는 동안, 조혈 성의 전구 물질은 8 일 현재입니다. 필요에 mStrawberry OP9 세포의 새로운 레이어에 합류 ES - 파생 자손의 passaging 때 화살표가 차별화의 일 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 적절한 ES 세포 차별화. ES 세포는 일 0 mStrawberry OP9의 합류 계층에 씨앗을 품고있다. ES - 파생 자손은 ES - 파생 자손이 정의된 테두리와 셀 클러스터처럼 보이는 또는 소용 돌 이꼴 패턴을 형성하기 시작과 분화의 날 3 표시되기 시작합니다. 5 일째에 세포의 whorls을 쌓아으로 내피와 조혈 lineages에 대한 일반적인 mesodermal 전구체 아르 Hemangioblasts는 나타납니다. 오일 이상 공동 문화 기간 동안, ES - 유래 자손은 조혈 세포의 클러스터로 나타납니다. 두 시간 내지 네 단세포 클러스터, 6 일 7 /, 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 휴대 클러스터로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 레이어 바운드 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 이 공동의 문화에서 실패한 ES 세포 차별화. 결과 부적 절한 ES 세포의 차별을 반영합니다. ES - 파생 자손은 5 일에 소용 돌 이꼴 무늬에 나타나지 어떻게 있습니다. 소용 돌 이꼴 무늬에 세포의 부재는 부적 절한 hemangioblast 형성을 나타냅니다. hemangioblast이 제대로 개발하지 않으면, 다음 공동 문화 저하 조혈성 혈통 차별집니다 계속했다. 부적 절한 hemangioblast 형성 공동 문화가 폐기해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. mStrawberry OP9 세포 문화. (A) mStrawberry OP9 세포가에 subcultured 아르confluency 70~90%. (B) 적절한 차별 화를위한, ES 세포와 ES - 파생 자손은 mStrawberry OP9 세포 지나치게 합류 계층에 배치됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="그림 5" /> 그림 5. 대표 ES / mStrawberry OP9 공동 문화 흐름 프로필. 모든 ES - 파생 자손은 mStrawberry 부정적인 세포이고 mStrawberry OP9 세포에서 정렬 흐름하실 수 있습니다. mStrawberry 부정적인 세포 게이트는 전통적인 ES/OP9 공동 문화를 사용하여 결정되었다.

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	<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis.">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+patterning+of+the+mouse+embryo:+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation.">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li><li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal.">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li><li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoid+bodies:+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis.">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li><li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis:+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression.">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li><li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , (1994).</li><li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture.">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro.">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li><li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells:+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis.">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li><li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture.">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li><li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryonic stem cells : methods and protocols. , (2002).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

공동 문화의 날 5 Flk1 이상 hemangioblasts의 생산에 mStrawberry OP9 세포 결과 합류 레이어에 ES 세포의 적절한 분화. Hemangioblasts는 그림 1에서 관찰된 세포의 whorls을 쌓여 나타납니다. 공동 문화의 나머지 내용은 보이지 ES - 파생 자손은 조혈 세포의 클러스터 (그림 1)과 같이 나타납니다. Day6 / 7 2-4 셀 클러스터가 나타납니다 및 공동 문화의 날 9분의 8로 큰 세포 클러스터 (자기편과 정지에 모두)로 성장합니다. 기타 ES 파생 자손도 단단히 자기편 stromal 세포 계층 내에서 바운드 볼 수 있습니다. 프로토콜에 표시되지 않지만, 그것은 FBS가 ES 성장 매체, mStrawberry OP9 성장 매체와 ES / mStrawberry OP9 차별화 미디어에서 사용되는 미리 테스트하는 것이 중요합니다. 제대로 혈청 분화의 5 일 전까지 공동 문화에 적절한 mStrawberry OP9 세포의 성장뿐만 아니라, ES 세포의 적절한 분화를 보장해야 테스트. 대안 또는 mStrawberry OP9 세포 이외에, OP9 전지 전에 (7.8x10 4 셀 / cm 2) confluency에서 시딩하기 위해 8000 래드에서 조사 수 있습니다. OP9 세포의 조사는 하류 assays에서 OP9 세포를 오염, 이전의 거의 완전한 제거를 허용뿐만 아니라, 반복 replating 단계의 제거를 허용합니다. OP9 세포가 CMV 프로 모터의 제어 (pRRLsin - CMV 벡터, UCLA 벡터 코어) 아래 lentiviral 벡터 표현 mStrawberry의 3ug/mL와 OP9 세포 transducing하여 mStrawberry 단백질을 표현할 수 있도록 설계되었습니다. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜은 세포 통로에서 OP9 세포를 오염 오래된 줄이기 위해뿐만 아니라, 합류 레이어 OP9 세포에 5 일 replating 단계를 ES 세포의 위치를​​ 수반. 또한, 정지에서 발견 유일한 조혈 세포 ES - 파생 자손의 평가를 위해 제거됩니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 모두 하나가 잠재적인 개발의 상당수 ES - 파생 조혈 세포를 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 이 문제를 우회하기 위해 우리 실험실 OP9 세포를 mStrawberry - 표현의 사용을 통해, 수정 공동 문화를 사용합니다. 이것은 모든 ES의 자손은 매일 5 시에 공동 문화의 지속으로 전송됩니다 것을 보장하고, 하류 assays 모든 ES - 파생 자손의 수확. 이 수정은 인간 및 마우스의 ES 라인 모두에서 파생된 조혈 자손의 평가와 특성화에 유용한 도구를 제공합니다. 다양한 단계와 최종 원시 조혈이 ES - mStrawberry OP9 공동 문화 모델 recapitulates. 조혈 개발의 초기 단계를 공부에 많은 사람들이 ES 세포에서 hemangioblast의 발전을 평가 BL - CFC (콜로니 형성 세포 블래스트와 같은) 분석을 사용합니다. 초기 조혈 개발을 조사 때 BL - CFC 분석이 유용한 도구이지만 그것이 hemangioblast의 평가뿐만 아니라, 더 많은 성인 조혈 lineages을 허용으로 mStrawberry - ES 공동 문화 시스템은 증가 유틸리티를 전시하고있다. 전통 OP9/ES 및 EB 차별 프로토콜을 사용하여 이전 작업 순서 등 HoxB4의 overexpression로, 아마도 필요한 추가 요소가 체외에서 조혈 줄기 세포를 repopulating 장기 파생 것으로 나타났습니다. 추가 작업은 mStrawberry 부정, 정렬 ES - 파생 인구 사실 조혈 줄기 세포를 포함 여부를 평가하는 것이 필요합니다.

OP - 9 셀 유지 보수 중 스톡 구성 요소 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 오메가 과학 </td><td> FB01 </td><td> 사전 테스트 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200nM </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 세포 차별화 미디엄 스톡 구성 요소 <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> 사전 테스트 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 - CI </td><td> 200mM </td></tr><tr><td> PBS (CA이없는 +와 MG 2 +) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 - CV </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 세포 기술을 줄기 </td><td> 07,901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modified es / op9 co-culture protocol provides enhanced characterization of hematopoietic progeny

생체내 및 배아 lethalities 처리하지 않고, 조혈에 관련된 최초의 유전자를 특성화에 대한 액세스하기 어렵습니다 세포 인구를 공부하면 조혈 세포의 운명으로 ES 세포의 체외에서 차별에 유용합니다. OP9 stromal 세포 라인 M - CSF 기능 부족 osteopetrosis 돌연변이 생쥐의 calvaria에서 파생되는 등 ES/OP9 공동 문화 시스템은 원래, macrophages의 이상 생산하지 않고, 조혈 자손을 생산하도록 설계되었습니다. 체외 ES/OP9 공동 문화 시스템은 초기 조혈 발전을 요점을 되풀이하기 위해 사용할 수 있습니다. OP9 stromal 세포에 교양하면, ES 세포는 Flk - 1 + hemangioblasts, 조혈 progenitors, 마침내 성숙, 말기 차별 lineages로 구분. 표준 ES/OP9 공동 문화 프로토콜 OP9 세포의 합류 계층에 ES 세포의 위치를​​ 알아볼 수, OP9 세포를 오염 오래된 제거하기 위해뿐만 아니라, 정기 replating 단계를 반복합니다. 또한, 현재의 프로토콜은 정지에서 발견은 조혈 세포를 평가 참여하고 분화의 각 하루 ES - 파생 자손의 평가에 최적화된되지 않습니다. 그러나, replating 단계만을 정지 세포의 수확 하나의 가능성이 ES - 파생 자손과 조혈 세포를 개발의 큰 부분을 그리워. 이 문제는 녹아웃 에스 라인과 관련된 조혈 결함을 특성화하려고 할 때 주소로 중요 해지고 있습니다. 여기 하류 assays에서 OP9 세포 오염의 제거를 허용 수정 ES / mStrawberry OP9 공동 문화를 설명합니다. 이 방법은 더 직접적으로 배아 내에서 관찰 조혈성 차별화 패턴에 해당하는 조혈 차별화 패턴의 결과로, 공동 문화의 모든 일에 모든 ES - 파생 자손의 전체 평가 수 있습니다.

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Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES - 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.

수정 ES / OP9 공동 문화 프로토콜 조혈 제니의 향상된 특성화를 제공합니다

The in vitro differentiation of ES cells towards a hematopoietic cell fate is useful when studying cell populations that are difficult to access in vivo ...

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

20.6K 조회수.  University of California, Los Angeles. mStrawberry OP9 세포가 공동 문화의 모든 ES - 파생 자손의 완전한 평가를 위해 수 있습니다.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations including low yields and heterogeneous populations of differentiated cells hinder the progress of stem cell therapies. A fate restricted immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cell line was generated to facilitate efficient differentiation of large numbers of functional hair cells and spiral ganglion neurons (SGN) for inner ear cell replacement therapies. Starting from dissociated cultures of single iMOP cells, protocols that promote cell cycle exit and differentiation by basic fibroblast growth factor (bFGF) withdrawal were described. A significant decrease in proliferating cells after bFGF withdrawal was confirmed using an EdU cell proliferation assay. Concomitant with a decrease in proliferation, successful differentiation resulted in expression of molecular markers and morphological changes. Immunostaining of Cdkn1b (p27KIP) and Cdh1 (E-cadherin) in iMOP-derived otospheres was used as an indicator for differentiation into inner ear sensory epithelia while immunostaining of Cdkn1b and Tubb3 (neuronal &#946;-tubulin) was used to identify iMOP-derived neurons. Use of iMOP cells provides an important tool for understanding cell fate decisions made by inner ear neurosensory progenitors and will help develop protocols for generating large numbers of iPSC or ESC-derived hair cells and SGNs. These methods will accelerate efforts for generating otic cells for replacement therapies.

The current protocols to maintain immortalized multipotent otic progenitor (iMOP) cells and otic differentiation are described. Culture conditions and molecular markers that indicate differentiation into sensory epithelia and spiral ganglion neurons (SGN) are highlighted.

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

발생학

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We first designed a reporter screen using MEFs from human CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP) double transgenic mice. CD34+ cells from these mice label H2B histones with GFP, and cease labeling upon addition of doxycycline (DOX). MEFS were transduced with candidate TFs and then observed for the emergence of GFP+ cells that would indicate the acquisition of a hematopoietic or endothelial cell fate. Starting with 18 candidate TFs, and through a process of combinatorial elimination, we obtained a minimal set of factors that would induce the highest percentage of GFP+ cells. We found that Gata2, Gfi1b, and cFos were necessary and the addition of Etv6 provided the optimal induction. A series of gene expression analyses done at different time points during the reprogramming process revealed that these cells appeared to go through a precursor cell that underwent an endothelial to hematopoietic transition (EHT). As such, this reprogramming process mimics developmental hematopoiesis "in a dish," allowing study of hematopoiesis in vitro and a platform to identify the mechanisms that underlie this specification. This methodology also provides a framework for translation of this work to the human system in the hopes of generating an alternative source of patient-specific hematopoietic stem cells (HSCs) for a number of applications in the treatment and study of hematologic diseases.

The protocol described here details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts via overexpression of a minimal set of transcription factors. This technology may be translated to the human system to provide platforms for future study of hematopoiesis, hematologic disease, and hematopoietic stem cell transplant.

전사 인자와 마우스 배아 섬유 아 세포를 재 프로그램하는 것은 Hemogenic 프로그램을 유도하는

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

T 세포의 유도<em&gt; 체외</em&gt; 마우스 배아 줄기 세포에서

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

면역학 및 감염병학

Co-Culture and Transduction of Murine Thymocytes on Delta-Like 4-Expressing Stromal Cells to Study Oncogenes in T-Cell Leukemia

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4). As retroviral transduction requires dividing cells for transgene integration, OP9-DL4 provides a suitable in vitro environment for cultivating hematopoietic progenitor cells. This is particularly advantageous when studying the effects of the expression of a specific gene during normal T cell development and leukemogenesis, as it allows researchers to circumvent the time-consuming process of generating transgenic mice. To achieve successful outcomes, a series of coordinated steps involving the simultaneous manipulation of different types of cells must be carefully performed. Although these are very well-established procedures, the lack of a common source in the literature often means a series of optimizations are required, which can be time-consuming. This protocol has been shown to be efficient in transducing primary thymocytes followed by differentiation on OP9-DL4 cells. Detailed here is a protocol that can serve as a quick and optimized guide for the co-culture of retrovirally transduced thymocytes on OP9-DL4 stromal cells.

This protocol describes the isolation of double-negative thymocytes from the mouse thymus followed by retroviral transduction and co-culture on the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line co-culture system (OP9-DL4) for further functional analysis.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

Transduced mouse immature thymocytes can be differentiated into T cells&#160;in vitro&#160;using the delta-like 4-expressing bone marrow stromal cell line ...

암 연구학

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

식별 및 Oligopotent 및 계보 커밋된 골수성 창시자 마우스 골 수에서 격리

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able to generate large datasets, necessitate the destruction of the cell of interest, making it impossible to assess its functional fate. Heterogeneous biological differentiating systems like hematopoiesis are therefore difficult to describe. Building on cell division tracking dyes, we further developed a protocol to simultaneously determine kinship, division number, and differentiation status for many single hematopoietic progenitors. This protocol allows the assessment of the ex vivo differentiation potential of murine and human hematopoietic progenitors, isolated from various biological sources. Moreover, as it is based on flow cytometry and a limited number of reagents, it can quickly generate a large amount of data, at the single-cell level, in a relatively inexpensive manner. We also provide the analytical pipeline for single-cell analysis, combined with a robust statistical framework. As this protocol allows the linking of cell division and differentiation at the single-cell level, it can be used to quantitatively assess symmetric and asymmetric fate commitment, the balance between self-renewal and differentiation, and the number of divisions for a given commitment fate. Altogether, this protocol can be used in experimental designs aiming to unravel the biological differences between hematopoietic progenitors, from a single-cell perspective.

Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Presented here is a flow cytometry-based technique that allows for simultaneously measuring the number of cell divisions, surface cell phenotype, and cellular kinship. Those properties can be tested statistically using a permutation-based framework.

조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

Few techniques can assess phenotype and fate for the same cell simultaneously. Most of the current protocols used to characterize phenotype, although able ...

Utilizing Low Oxygen Tension to Reduce Hematopoietic Cells in Murine Bone Marrow Stromal Cell Cultures

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this reason, BMSCs, which support hematopoiesis and contribute to all the functions of the skeleton, continue to be widely used to study multipotent mesenchymal progenitors (MMPs) and to infer SSC function. Moreover, given the breadth of transgenic murine models used to study musculoskeletal diseases, the use of BMSCs also serves as a powerful tool to examine the molecular mechanisms regulating MMPs and SSCs. However, common isolation procedures for murine BMSCs result in over 50% of recovered cells being of hematopoietic origins, potentially hindering the interpretation of the data generated during these studies. Here, we describe a method using low oxygen tension or hypoxia for the selective elimination of CD45+ cells in BMSC cultures. Importantly, this method can be easily implemented to not only reduce hemopoietic contaminants but to also enhance the percentage of MMPs and putative SSCs in BMSC cultures.

A routine culture of bone marrow stromal cells (BMSCs) leads to the isolation of heterogeneous cell populations, with many cells being of hematopoietic origins. Here, we describe a method that utilizes low oxygen tension to greatly reduce hematopoietic contaminants in murine BMSC cultures.

Currently, there remains a lack of universally accepted markers to prospectively isolate a homogeneous population of skeletal stem cells (SSCs). For this ...