نود أن نشكر اتسوشي Miyawaki لتزويدنا بناء التعبير ratiometric - pericam - طن متري. وأيد هذا العمل عن طريق منح GM081685 من المعاهد الوطنية للصحة (DB).

1. Pericam - ترنسفكأيشن طن متري ، وإعداد الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة خلايا هيلا الليلة قبل ترنسفكأيشن coverslips على زجاج معقمة توضع في طبق معيار ثقافة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد DNA / 2000 Lipofectamine المجمعات كما اقترح من قبل الشركة المصنعة (Invitrogen). نحن نستخدم 4 ميكروغرام من ناقلات التعبير ratiometric - pericam - طن متري و 10 ميكرولتر من عام 2000 Lipofectamine مخففة في 0.5 مل من OPTI - MEM لكل بئر. وينبغي أن تكون الخلايا ~ متموجة 70 ٪ قبل ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيلا استبدال ثقافة الإعلام (Dulbecco لتعديل النسور المتوسطة ، و 10 ٪ FBS ، البنسلين / الستربتوميسين) في كل بئر مع 1.5 مل من وسائل الإعلام نفسها من دون مضادات حيوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المجمعات الحمض النووي / Lipofectamine إلى أن كل بئر transfected. المزيج بلطف مع هزاز واحتضان لمدة 4 ساعات في زنزانة حاضنة الثقافة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المضادات الحيوية خالية من وسائل الاعلام مع وسائل الاعلام الثقافة مع المضادات الحيوية. السماح للتعبير عن خلايا pericam ratiometric لمدة 1-2 أيام قبل التصوير. </li></ol> 2. إعداد المجهر والحصول على الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان ساترة مع خلايا هيلا الى غرفة التصوير المناسبة مع حلول التصوير : 107mM كلوريد الصوديوم ، بوكل 7.2mM ، 1.2mM MgCl 2 ، 1MM CaCl 2 ، 11.5mM الجلوكوز ، 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري ، وHEPES 20mM 7.2. مختبرنا يستخدم غرفة خلية Attofluor من Invitrogen. جبل غرفة التصوير في مرحلة مجهر مقلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على مجال اهتمام تحتوي على واحد أو أكثر من الخلايا معربا عن pericam ratiometric باستخدام الغمر 40X النفط (أو أعلى) الهدف. لقد وجدنا أن pericam ratiometric أقل مقاومة للphotobleaching في 380 نانومتر ، وبالتالي فإننا نستخدم هذا الطول الموجي لتحديد الخلايا المناسبة. للصور تم الحصول عليها في الشكل 1 ، كان يستخدم هدفا Superfluor نيكون 40X مع فتحة 1.3 العددية. والأهداف أعلى التكبير يكون من المناسب أيضا (100X 60). والفلاتر المستخدمة الإثارة شروما تكنولوجيا المرشحات D380/30x (380 + / -- 30 نانومتر) ، وD495/10 (495 + / -- 5 نانومتر) ، وكان beamsplitter 505DCXR (505nm longpass) ، وكان انبعاث تصفية HQ535/50m (535 + / -- 25nm). مجهر لدينا تستخدم للحصول على صور في الشكل (1) يتكون من TE2000 نيكون المجهر المقلوب مجهزة العلمية روبر Coolsnap HQ تبريد CCD الكاميرا ، Ludl MAC6000 عجلة التصفية السريعة والمغير ، والحصول على البيانات والبرمجيات MetaFluor التحليل. ويمكن تكييف هذا البروتوكول إلى أي مجال واسع المجهر القياسية مع الفلاتر المناسبة والبرامج قادرة على التقاط ومعالجة الصور ratiometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد برامج لاستثارة المزدوجة باستخدام مرشحات 495 و 380 نانومتر. الكالسيوم ملزمة لpericam ratiometric الزيادات الامتصاصية في 495 نانومتر ، وبالتالي يجب أن ضبط نسبة تصل إلى 495 nm/380 نانومتر. Ratiometric pericam ديه الكالسيوم الخالية من الإثارة ذروتها في 415 نانومتر 4. في هذا البروتوكول نقترح باستخدام 380 نانومتر فقط لأنه مرشح في كل مكان في معظم المختبرات التصوير الكالسيوم. إذا كان تصفية 410 نانومتر متوفرا ، فمن الأفضل لتصفية نانومتر 380. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور مثيرة من قبل بالتسلسل بدلا من 495 و 380 في نانومتر. الحصول على صور من مستويات الكالسيوم في الأساس على الأقل 30 ثانية قبل تطبيق ناهض عبر جهاز نضح. علامة الوقت بالإضافة لكل ناهض. وينبغي أن يكون الأمثل مرات وفترات التعرض للحيلولة دون حيازة photobleaching حين لا يزال يسمح كافية المثال resolution.For الزمنية ، لديناميات الكالسيوم شبه السريع رصد استجابة لتحفيز ناهض ، استحوذت صور كل ثانيتين في 1B أرقام ومعدلات اقتناء جيم أسرع بكثير من الممكن أيضا 6. وكانت الشركة على المدى الطويل بعد التصوير مع الادارة staurosporine أطول الفاصل الزمني (30S) بين الاستحواذ (الشكلان 1 D و E). </li></ol> 3. معالجة الصور وتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد اكتمال التجربة ، يمكن تحليل الصور التي تم الحصول عليها حاليا. تحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) الذي تريد لرصد التغيرات في مستويات الكالسيوم. استخدام ROI مختارة داخل منطقة فارغة من الحقل إلى طرح الخلفية إذا لزم الأمر. وتجدر الإشارة إلى أن الميتوكوندريا هي متحركة وديناميكية للغاية ، واستقراء الأحداث في الحبيبات الخيطية واحد على مدى فترات طويلة ليست دائما ممكنة. وبالتالي ، نظرا لحركية عالية من هذه العضية في بعض أنواع الخلايا ، ينبغي اختيار ROI يتم رصدها بعناية. وعلاوة على ذلك ، كما يتضح في الشكل 1 ، والاستجابة للمؤثرات الميتوكوندريا heterogeneously المختلفة. ولذلك فمن المهم لتحليل البيانات ورصد حاليا RO1 التنسيب على أساس الإطار حسب الإطار. وقد وصفت وصفا مفصلا لقياس الكالسيوم في الميتوكوندريا الميتوكوندريا متحركة للغاية في مكان آخر 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن استيراد نسبة القياسات التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار في Excel أو graphingsoftware مماثلة. ويمكن عرض البيانات كما يمثل تتبع التغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا في خلية واحدة أو الحبيبات الخيطية واحد ، أو متوسط ​​فلوريداuorescence إشارات من ROI عدة. وقد استخدمنا هذه التقنية أيضا لقياس متوسط ​​مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا السكان من الخلايا الليمفاوية تمر موت الخلايا المبرمج الناجمة عن يجند فاس 8. </li></ol> 4. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. (أ) من توطين التحت خلوية ratiometric - pericam - طن متري. هذه الصورة الأولى يظهر الخلية الحية هيلا معربا عن ratiometric - pericam - طن متري. في الصورة الثانية يظهر تلطيخ الفلورسنت مع الحبيبات الخيطية انتقائية صبغ MitoTracker CMXRos الأحمر. ومضان الصفراء في الصورة المدمجة يوضح شارك في توطين ratiometric - pericam - طنا ومضان MitoTracker (B) سلسلة من نسبة pseudocolor (495:380 نانومتر) صورا لخلايا هيلا معربا عن 4 طن متري ، ratiometric pericam تعامل مع ATP 10 مم (C) إلى القياس الكمي للتغيرات في مستويات الكالسيوم في الميتوكوندريا في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في (ب) سلسلة (D) تعامل مع ATP 10 مم. نسبة pseudocolor (495:380 نانومتر) صورا للتعبير عن خلية هيلا طن متري - ratiometric pericam تعامل مع staurosporine ميكرومتر 0.5. الاختلاف في الاستجابة الكالسيوم في الميتوكوندريا الفرد هو واضح ، وكذلك تجزئة كبيرة من الميتوكوندريا بنسبة 60 دقيقة. بعض الميتوكوندريا زيادات متذبذبة في الكالسيوم (أبيض الرأس السهم) ، في حين أن البعض الآخر لا تظهر تغيرات كبيرة في مستوى الكالسيوم (أصفر رئيس السهم) (E) الكمي للزيادات في مستويات الكالسيوم العالمية الميتوكوندريا في زنزانة واحدة بعد هيلا استحثاث موت الخلايا المبرمج مع 0.5 ميكرومتر staurosporine.

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نقدم هنا طريقة بسيطة جدا لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا الميتوكوندريا باستخدام استهداف pericam ratiometric. كما هو مبين في الشكل 1A ، وذلك باستخدام معيار widefield البصريات مع عدم وجود deconvolution أنه من الممكن بسهولة عرض الميتوكوندريا الفردية في خلايا هيلا مع نسبة الإشارة إلى الضجيج مقبول. وذلك لأن خلايا هيلا ، مثل معظم الخلايا في الثقافة ، وتتسطح الى حد كبير عندما ملتصق تفادي الحاجة للفحص المجهري مبائر أو المعدات المتخصصة الأخرى. لقد تم العثور على نتائج مماثلة في الخلايا Jurkat التمسك بولي يسين coverslips المغلفة 8. على النقيض من منهجيات تستخدم الأصباغ ، فمن الممكن أيضا غير جراحية رصد مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا لساعات باستخدام مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا مثل pericam ratiometric (الشكل 1E). هذا مهم خصوصا عند تحليل الكالسيوم خلال الميتوكوندريا موت الخلية. وعلاوة على ذلك ، فمن الممكن أيضا تصور الانشطار / تجزئة الميتوكوندريا أثناء عملية أفكارك. كما هو مبين في 1D الأرقام والبريد ، ومعالجة الأسباب staurosporine زيادة بطيئة في الكالسيوم في مجموعات سكانية فرعية مختارة من القمم التي الميتوكوندريا في 20 دقيقة. مستويات الكالسيوم تنخفض مرة أخرى مع ما يصاحب ذلك التشرذم الميتوكوندريا قبل الصعود مرة أخرى 2 ساعة بعد تلقي العلاج. وهذا يتفق مع موجات بطيئة في عصاري خلوي الكالسيوم الناجم عن العلاج staurosporine قياسها باستخدام Fura - 2 9. وبالتالي ، يمكن الحصول على معلومات الحركية الهامة التي لا يمكن لأساليب توظيف قياسات ثابتة. على الرغم من أننا قد قدمت نسب تركيزات الكالسيوم وليس في الشكل (1) ، فمن الممكن لمعايرة أجهزة الاستشعار في الموقع لحساب مستويات الكالسيوم المطلق 4 و 10. توضيح هام واحد للنظر هو أن pericam ratiometric حساسة لدرجة الحموضة 4 و 10. لأن كلا من مستويات الحموضة عصاري خلوي والميتوكوندريا يمكن أن تتغير بشكل كبير خلال 11 موت الخلايا المبرمج ، وهذا هو أحد الاعتبارات الهامة. معايرة درجة الحموضة في pericam الميتوكوندريا المعزولة معربا عن إثبات أن زيادة [H +] زيادة انبعاث pericam عندما متحمس في 495 نانومتر ، مع تأثير ضئيل على الانبعاث المستحث بواسطة الإثارة عند 410 نانومتر ، وهي الخاصية التي تم استغلالها في وقت واحد لقياس كل من الكالسيوم والميتوكوندريا الحموضة 12. وهكذا ، ورصد الانبعاثات بشكل انتقائي مع الإثارة 410 نانومتر يوفر وسيلة لرصد الكالسيوم غير ratiometrically الميتوكوندريا مع القلق انخفاض لدرجة الحموضة. أخيرا ، وبروتوكول المعروضة هنا لا يتطلب سوى الحصول على مجهر epifluorescent القياسية مع المرشحات على نطاق واسع ، مما يجعل هذه التقنية في متناول معظم المختبرات.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

التغيرات الدينامية في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لمختلف المحفزات ينظم العديد من العمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج 1. موت الخلايا المبرمج خلال تراكم الكالسيوم في الميتوكوندريا يعزز الافراج عن أفكارك العوامل المؤيدة للمن الميتوكوندريا في العصارة الخلوية 2. لذلك فإنه من مصلحة مباشرة لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الحية في الموقع خلال موت الخلايا المبرمج. وقد ثبت عالية الدقة التصوير الفلورية لخلايا محملة المزدوجة وعدم إثارة ratiometric ratiometric الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم ليكون أداة موثوقة ومرنة لدراسة مختلف جوانب إشارات الكالسيوم داخل الخلايا. قياس تدفقات الكالسيوم عصاري خلوي استخدام هذه التقنيات واضحة نسبيا. ومع ذلك ، وقياس مستويات الكالسيوم في الخلايا intramitochondrial سليمة باستخدام مؤشرات مثل الكالسيوم الاصطناعية rhod - 2 و FF - rhod هو أكثر تحديا. لقد أضعفت المؤشرات الاصطناعية التي تستهدف الميتوكوندريا الردود على الزيادات المتكررة في الكالسيوم الميتوكوندريا ، وتعطيل مورفولوجيا الميتوكوندريا 3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المؤشرات تميل إلى تسرب الاصطناعية من أصل أكثر من الميتوكوندريا عدة ساعات مما يجعلها غير صالحة للتجارب طويلة الأمد. وبالتالي ، فقد سهلت المؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا على أساس الفلورية الخضراء 4 (GFP) أو البروتين aequorin 5 الميتوكوندريا التي تستهدف بشكل كبير قياس الكالسيوم ديناميات الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف طريقة بسيطة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا استجابة لمحفزات مختلفة. يستند هذا الأسلوب على المجهري مضان من &#39;pericam - ratiometric&quot; التي تستهدف بشكل انتقائي للالميتوكوندريا. pericam Ratiometric الكالسيوم هو مؤشر على أساس مزيج من بروتين فلوري permuted دائري الصفراء وكالمودولين 4. من الكالسيوم لملزم pericam ratiometric أسباب تحول في ذروة الإثارة والخمسين من 415 نانومتر إلى 494 نانومتر ، في حين أن الطيف الانبعاثات ، والتي تصل ذروتها حوالي 515 نانومتر ، لا تزال دون تغيير. Ratiometric pericam يربط أيون الكالسيوم واحد مع التفكك المستمر في المختبر من 1.7 ميكرومتر ~ 4. هذه الخصائص تسمح للpericam ratiometric القياس الكمي للتغيرات السريعة والطويلة الأجل في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك ، ونحن تصف تكييف هذه المنهجية في مستوى الكالسيوم واسعة حقل التصوير المجهر مع مجموعات التصفية المتاحة عموما. باستخدام اثنين من منبهات متميزة ، وpurinergic ATP ناهض وموت الخلايا المبرمج الذي يحفز staurosporine المخدرات ، وعلينا أن نظهر أن هذا الأسلوب مناسب لرصد التغيرات في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا مع القرار الزماني للثانية لساعات. وعلاوة على ذلك ، ونحن أيضا أن تثبت أن pericam ratiometric مفيد أيضا لقياس الانشطار الميتوكوندريا / التجزئة خلال موت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، هو مناسبة بشكل خاص لقياس pericam ratiometric على المدى الطويل المستمر من خلال ديناميات الكالسيوم الميتوكوندريا موت الخلايا المبرمج.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor at JoVE.com

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.

رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.8K Views.  University of Texas Medical Branch. يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam - طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.

Video: Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

التصوير الكالسيوم من الخلايا العصبية باستخدام Fura القشرية ، 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

خلية كاملة تسجيل النسخة الكالسيوم المنشط الكالسيوم (CRAC) التيارات في الخلايا اللمفية تي الإنسان

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

قياس الكالسيوم السريع في تدفقاتها العضلية

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

رصد الباطنة شبكية الكالسيوم باستخدام<em&gt; Gaussia</em&gt; luciferase المراسل SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

قياس وقت واحد من الميتوكوندريا الكالسيوم والميتوكوندريا غشاء المحتملة في الخلايا الحية التي كتبها نيون الميكروسكوب

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة<sup&gt; 2+</sup&gt; الاستشعار الماسك<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

في الوقت الحقيقي في فيفو تسجيل إشارات الكالسيوم أعطيت خلال تغذية الحشرة باستخدام بيوسينسور نيون

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

إلى الأمام الشاشة الجينية باستخدام المعدلة وراثيا مراسل الكالسيوم أيكورين لتحديد أهداف جديدة في إشارات الكالسيوم

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...