我々は、レシオメトリック- pericam - MT発現構築物を弊社に提供するための宮脇敦史に感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DB）からの助成金GM081685によってサポートされていました。

1。 Pericam - MTのトランスフェクションと細胞調製。 <ol><li>標準の6ウェル培養プレートに入れ、滅菌ガラス製カバースリップ上にプレートのHeLa細胞トランスフェクションの前に夜。 </li><li>メーカー（Invitrogen社）によって提案されたDNA /リポフェクトアミン2000複合体を準備します。我々は、レシオメトリック- pericam - MT発現ベクター4μgのと各ウェルのためのOpti - MEM 0.5mlに希釈したリポフェクタミン2000の10μLを使用してください。細胞はトランスフェクションの前に〜70％コンフルエントにする必要があります。 </li><li>抗生物質なしで同じメディアを1.5 mLで各ウェルのHeLa細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン）を交換してください。 </li><li> DNA /トランスフェクトされる各ウェルにリポフェクタミン複合体を追加。 37℃、5％CO 2でインキュベーター内で4時間振盪インキュベートで軽く混ぜる。 </li><li>抗生物質を培地に抗生物質を含まない培地を交換してください。細胞は、イメージングの前に1-2日間レシオメトリックpericamを表現す​​ることができます。 </li></ol> 2。顕微鏡のセットアップと画像の取得<ol><li> 107mMのNaCl、7.2mMのKCl、さ1.2mmのMgCl 2、1mMのCaCl 2で 、11.5mMグルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、および20mMのHEPES 7.2：イメージングソリューションで適切な画像処理室内にHeLa細胞をカバースリップを配置。我々の研究室は、InvitrogenからAttofluorセルチャンバーを使用しています。倒立顕微鏡のステージでのイメージングチャンバーをマウントします。 </li><li> 40倍（またはそれ以上）油浸対物レンズを使用して、レシオメトリックpericamを表現す​​る一つ以上の細胞を含む関心領域を見つける。我々は、レシオメトリックpericamは380 nmで光退色の少ない使用環境の良好であることを発見したため、我々は、適切なセルを識別するために、この波長を使用してください。図1で取得した画像については、1.3開口数とニコンSuperfluor 40X目的が使用されました。より高い倍率の目標でも（60〜100倍）が適切です。とD495/10（495 + / - 5 nmの） - 使用される励起フィルターはクロマテクノロジーフィルタD380/30x（30nmの380 + /）だった、ビームスプリッタは505DCXR（505nmロングパス）であり、発光フィルターはHQ535/50m（535 + / gであった。 - 25nmの）。 図1の画像を取得するために使用される私たちの顕微鏡は、ローパーサイエンティフィックCoolsnap HQはCCDカメラ、Ludl MAC6000急速なフィルターホイールとチェンジャー、およびMetaFluorデータ収集と解析ソフトウェアを冷却を装備したニコンTE2000倒立顕微鏡で構成されています。このプロトコルは、適切なフィルタとレシオメトリック画像をキャプチャし、処理することができるソフトウェアで、標準的な広視野顕微鏡に適合させることができます。 </li><li> 495および380nmのフィルターを用いて二重励起するためのソフトウェアをセットアップします。レシオメトリックpericamに結合カルシウムは495nmの吸光度を増加させる、従って比は495 nm/380 nmとするように設定する必要があります。 レシオメトリックpericamは、415 nmの4のカルシウムフリー励起ピークを持っています。このプロトコルでは、それはほとんどのカルシウムイメージングの研究室でユビキタスなので、唯一のフィルター380nmのを使用することをお勧めします。 410nmのフィルターが使用可能な場合、それは、380nmのフィルターに好適である。 </li><li> 495および380nmで連続してで交互に刺激的な画像を取得する。灌流装置を介してアゴニストのアプリケーションの前に少なくとも30秒間のベースラインのカルシウム濃度の画像を取得する。各アゴニストの添加時間をマークします。露光時間と取得間隔がまだ十分な時間的resolution.Forの例を可能にしながら退色を防止するために最適化されるべきである、アゴニスト刺激に応答して、監視半迅速なカルシウム動態のため、画像は図1BとCのはるかに高速アクイジションレートで2秒ごとに取得したまた、6可能です。スタウロスポリンの投与後の長期的なイメージングは​​、買収（図1 DとE）の間に長い間隔（30秒）で買収された。 </li></ol> 3。画像処理と解析<ol><li>実験が完了したら、得られた画像は、オフラインで分析することができます。あなたがカルシウム濃度の変化を監視するには、関心領域（ROI）を定義します。必要に応じてバックグラウンドを減算するフィールドの空の領域内で選択されたROIを使用してください。それは、ミトコンドリアが非常に運動性および動的であり、長期間にわたって、単一のミトコンドリア内のイベントを外挿することは常に可能ではないことに注意する必要があります。このように、いくつかの細胞型におけるこのオルガネラの高い運動性を考慮し、ROIの選択は慎重に監視する必要があります。さらに、図1、様々な刺激に対する不均一にミトコンドリア応答で証明。データをオフラインで分析し、フレームごとにRO1の配置を監視することが重要です。非常に運動性のミトコンドリアでミトコンドリアのカルシウムを測定するの詳細な説明は別の場所で7に記載されています。 </li><li> ROIから得られる比測定は、Excelまたは類似のgraphingsoftwareにインポートすることができます。データは、単一細胞または単一ミトコンドリアにおけるミトコンドリア内カルシウム濃度の変化を表すトレースとして表示、またはflを平均化することができます。複数のROIからuorescence信号。我々はまた、Fasリガンド8で誘導されるアポトーシスを起こしたリンパ球の集団における平均的なミトコンドリアのカルシウム濃度を測定するためにこのテクニックを使用している。 </li></ol> 4。代表的な結果： <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。レシオメトリック- pericam - MTの（A）細胞内局在。この最初のイメージは、レシオメトリック- pericam - mtを表現するライブHeLa細胞を示しています。番目のイメージはミトコンドリア選択性色素のMitoTrackerにより赤CMXRosと蛍光染色を示す。マージされた画像で黄色の蛍光は、レシオメトリック- pericam - MTおよびMitoTrackerの蛍光の共局在を示しています。（B）は、擬似カラーの比（495:380 nm）を10 mMのATPで処理MT -レシオメトリックpericamを表現する4 HeLa細胞の一連の画像（C）関心領域（ROI）のミトコンドリア内カルシウム濃度の変化の定量化は、擬似の比（495:380 nm）のmtを発現するHeLa細胞の画像の（B）10 mMのATPによる治療を受けた。（D）シリーズに示さレシオメトリックpericamは0.5μMスタウロスポリンで処理した。個々のミトコンドリアのカルシウム応答の不均一性は明らか、と同様に60分でミトコンドリアの重要な断片化です。他のカルシウムのレベルに著しい変動があった場合（黄色の矢印の頭を）表示されないのに対し、いくつかのミトコンドリアは、カルシウム（白い矢印の頭）の振動が増加している。とアポトーシスの誘導後に単一のHeLa細胞におけるグローバルミトコンドリア内カルシウム濃度の増加（E）定量0.5μMのスタウロスポリン。

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	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここでは、ミトコンドリアをターゲットとしたレシオメトリックpericamを使用してミトコンドリアのカルシウムを測定するための非常にシンプルな方法を提示する。表示しないようにデコンボリューションで標準的な広視野の光学系を用いて、図1Aに示すように、それは容易に許容可能な信号対雑音比でHeLa細胞に個々のミトコンドリアを表示することが可能です。共焦点顕微鏡やその他の特殊な装置を不要にするときに接着HeLa細胞は、培養中のほとんどの細胞と同様に、著しく平坦化されるためです。我々は、ポリ-リジンコートしたカバースリップ8に付着したJurkat細胞で同様の結果を発見した。染料を使用しての方法論とは対照的に、それは非侵襲的にレシオメトリックpericam（図1E）などの遺伝的に符号化されたカルシウムの指標を用いて時間のミトコンドリア内カルシウム濃度を監視することも可能です。細胞死の間にミトコンドリアのカルシウムを分析するときに特に重要です。さらに、アポトーシス過程でミトコンドリアの分裂/断片化を視覚化することも可能です。図1DおよびEに示すように、スタウロスポリン処理は20分でのミトコンドリアのピークの選択部分母集団におけるカルシウムでゆっくりと増加を引き起こす。カルシウム濃度は、再び2時間処理した後に再び行く前にミトコンドリアの断片化との併用下に行く。これは、フラ-2 9を用いて測定したスタウロスポリン処理による細胞内カルシウムの徐波と一致している。したがって、重要な運動情報は静的な測定を用いる方法では不可能である得ることができます。我々は比と図1のないカルシウム濃度を示してきたが、それは絶対的なカルシウムレベル4、10を計算するためにその場でセンサーを校正することが可能です。考慮すべき重要な注意事項は、レシオメトリックpericamは、pH 4、10に敏感であることです。細胞質とミトコンドリアの両方のpHレベルは、アポトーシス11で劇的に変えることができるように、これは重要な考慮事項です。単離されたミトコンドリアに発現pericamにおけるpHの滴定は示してその増加して[H +]が増加するの410nmでの励起、同時にミトコンドリアのカルシウムの両方を測定するために悪用されているプロパティによって誘導放出にほとんど影響で、495 nmで励起したpericamの排出量とpHは12。従って、選択的に410 nm励起での発光を監視することはpHの低下懸念と非レシオメトリックモニターミトコンドリアカルシウムする手段を提供します。最後に、ここで紹介するプロトコルではこのように、ほとんどの研究室へのこの技術にアクセスできるように、広く利用可能なフィルタを使用して標準落射蛍光顕微鏡にアクセスする必要があります。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

様々な刺激に応答して細胞内カルシウム濃度のダイナミックな変化は、増殖、分化、およびアポトーシス1など多くの細胞プロセスを調節する。アポトーシス時には、ミトコンドリアのカルシウムの蓄積は、細胞質ゾル2にミトコンドリアからアポトーシス因子の放出を促進する。それは、直接アポトーシス間にその場で生きている細胞でミトコンドリアのカルシウムを測定するために興味深い。デュアル励起レシオメトリックおよび非レシオメトリック合成カルシウム指示薬染料でロードされた細胞の高分解能蛍光イメージングは​​、細胞内カルシウムシグナル伝達のさまざまな側面を研究するために信頼性の高い多目的なツールであることが証明されています。これらの手法を用いて細胞内カルシウムフラックスを測定することは比較的簡単です。しかし、このようなrhodo -の異形2とrhodo -の異形FFなどの合成カルシウムインジケータを使用して無傷の細胞のミトコンドリア内のカルシウム濃度を測定することはより困難です。ミトコンドリアをターゲットとする合成指標は、ミトコンドリアのカルシウムの反復的な増加への対応を平滑化し、ミトコンドリアの形態3を中断している。さらに、合成指標は、長期的な実験には適していません数時間にわたってミトコンドリアから漏れする傾向がある。このように、ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質（GFP）4またはエクオリン5に基づいて遺伝的に符号化されたカルシウムの指標は大幅にミトコンドリアのカルシウム動態の測定を容易にしている。ここでは、さまざまな刺激に応答してミトコンドリア内カルシウムフラックスのリアルタイム計測のためのシンプルな方法を説明します。メソッドは、選択的にミトコンドリアをターゲットとする&quot;レシオメトリック- pericam&quot;の蛍光顕微鏡法に基づいています。レシオメトリックpericamは、循環順序を変える黄色蛍光タンパク質とカルモジュリン4の融合に基づいて、カルシウム指示薬です。 515 nm付近のピーク発光スペクトルは、、変わらないまま。レシオメトリックpericamへのカルシウムの結合は、415 nmから494 nmまでの励起ピークのシフトを引き起こすレシオメトリックpericamは約1.7μM4のin vitroでの解離定数を持つ単一のカルシウムイオンを結合する。レシオメトリックpericamのこれらのプロパティは、ミトコンドリアのカルシウム濃度の急激かつ長期的な変化の定量化を可能にする。さらに、我々は一般に入手可能なフィルターセットを持つ標準ワイドフィールドカルシウムイメージング顕微鏡にこの方法論の適応を説明します。二つの異なるアゴニスト、プリン作動性アゴニストATPとアポトーシス誘導剤のスタウロスポリンを使用して、我々は、この方法は時間の秒の時間分解能でミトコンドリアのカルシウム濃度の変化を監視するための適切であることを示している。さらに、我々はまた、レシオメトリックpericamはまた、アポトーシス中にミトコンドリアの分裂/断片化を測定するための有用であることを示している。このように、レシオメトリックpericam、特によくアポトーシス時のミトコンドリアのカルシウム動態の連続的な長期的な測定に適しています。

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Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam - MT）を利用しています。

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.9K ビュー.  University of Texas Medical Branch. このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam - MT）を利用しています。

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Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

二層弾性特性の変化をモニタリングするための単一分子法

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

生物学

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

ヒトTリンパ球におけるカルシウム放出、活性化カルシウム（CRAC）電流のホールセル記録

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

遺伝的にコードされた分子プローブは、Gタンパク質共役受容体を研究する

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

Forward Genetic Screen Using Transgenic Calcium Reporter Aequorin to Identify Novel Targets in Calcium Signaling

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis of the screen is to generate a mutant population that can be screened with a phenotype of interest. EMS (ethyl methane sulfonate) is a commonly used alkylating agent for inducing random mutation in a classical forward genetic screen to identify multiple genes involved in any given process. Cytosolic calcium (Ca2+) elevation is a key early signaling pathway that is activated upon stress perception. However the identity of receptors, channels, pumps and transporters of Ca2+ is still elusive in many study systems. Aequorin is a cellular calcium reporter protein isolated from Aequorea victoria and stably expressed in Arabidopsis. Exploiting this, we designed a forward genetic screen in which we EMS-mutagenized the aequorin transgenic. The seeds from the mutant plants were collected (M1) and screening for the phenotype of interest was carried out in the segregating (M2) population. Using a 96-well high-throughput Ca2+ measurement protocol, several novel mutants can be identified that have a varying calcium response and are measured in real time. The mutants with the phenotype of interest are rescued and propagated till a homozygous mutant plant population is obtained. This protocol provides a method for forward genetic screens in Ca2+ reporter background and identify novel Ca2+ regulated targets.

A forward genetic screen based on Ca2+ elevation as a read-out leads to identification of genetic components involved in calcium dependent signaling pathways in plants.

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

Forward genetic screens have been important tools in the unbiased identification of genetic components involved in several biological pathways. The basis ...