ברצוננו להודות Atsushi מיאווקי לספק לנו לבנות ratiometric-pericam-MT הביטוי. עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM081685 מן המכונים הלאומיים לבריאות (DB).

1. Pericam-MT transfection הכנה Cell. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאים הלה אמש transfection על coverslips זכוכית סטרילית להציב צלחת 6-טוב תקן תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA / Lipofectamine 2000 מתחמי כפי שהוצע על ידי היצרן (Invitrogen). אנו משתמשים 4 מיקרוגרם של וקטור ratiometric-pericam-MT הביטוי 10 μL של 2000 Lipofectamine מדולל 0.5 מ&quot;ל של Opti-ממ טוב עבור כל אחד. התאים צריכים להיות ~ ומחוברות 70% לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף הלה תרבות המדיה (שונה Dulbecco של נשרים בינוני, 10% FBS, פניצילין / סטרפטומיצין) בכל טוב עם 1.5 מ&quot;ל של התקשורת אותו ללא אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ה-DNA / Lipofectamine מתחמי זה טוב להיות transfected. מערבבים בעדינות עם נדנדה דגירה של 4 שעות תרבית תאים החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף אנטיביוטי ללא מדיה עם התקשורת בתרבות עם אנטיביוטיקה. אפשר תאים להביע pericam ratiometric עבור 1-2 ימים לפני הדמיה. </li></ol> 2. מיקרוסקופ התקנה רכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip עם תאים הלה לתא הדמיה המתאים פתרון הדמיה: 107 מ&quot;מ NaCl, KCl 7.2mM, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mM גלוקוז, 0.1% אלבומין בסרום שור, ו HEPES 20mm 7.2. המעבדה שלנו משתמשת תא תא Attofluor מן Invitrogen. הר קאמרית הדמיה בשלב מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא שטח של עניין המכיל אחד או יותר תאים להביע pericam ratiometric באמצעות טבילה 40X (או יותר) המטרה שמן. מצאנו כי pericam ratiometric הוא עמיד פחות photobleaching ב 380 ננומטר, ולכן אנו משתמשים באורך גל מתאים כדי לזהות תאים. לתמונות רכשה באיור 1, מטרה Superfluor ניקון 40X עם צמצם 1.3 מספרית היה בשימוש. מטרות בהגדלה גבוהה גם יהיה מתאים (60-100x). מסננים עירור שננקטו Chroma מסננים טכנולוגיה D380/30x (380 + / - 30 ננומטר) D495/10 (495 + / - 5 ננומטר), היה beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ואת פליטת לסנן היה HQ535/50m (535 + / - 25nm). מיקרוסקופ שלנו נהגו לרכוש את התמונות באיור 1 מורכב מיקרוסקופ Nikon TE2000 הפוך מצויד מדעי רופר Coolsnap HQ מקורר מצלמת CCD, Ludl MAC6000 מהיר גלגל לסנן מחליף, וכן רכישת נתונים MetaFluor ותוכנה ניתוח. פרוטוקול זה ניתן להתאים כל מיקרוסקופ רחב בתחום סטנדרטי עם מסננים מתאימים התוכנה מסוגלת ללכוד ועיבוד תמונות ratiometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת תוכנה עבור עירור כפול באמצעות 495 ו - 380 מסנני ננומטר. סידן מחייב pericam ratiometric מגביר ספיגת ב 495 ננומטר, ולכן היחס צריך להיות מוגדר להיות 495 nm/380 ננומטר. Ratiometric pericam יש סידן ללא עירור שיא ב 415 ננומטר 4. בפרוטוקול זה אנו ממליצים להשתמש ננומטר 380 לסנן רק משום שהוא נמצא בכל מקום במעבדות הדמיה ביותר לסידן. אם מסנן 410 ננומטר זמין, עדיף כדי לסנן את 380 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונות ברצף על ידי מרגש לחילופין ב 495 ו 380 ננומטר. לרכוש תמונות של רמות הסידן הבסיסית במשך לפחות 30 שניות לפני היישום של אגוניסט באמצעות מנגנון זלוף. סמן את הזמן בנוסף עבור כל אגוניסט. פעמים חשיפה מרווחי הרכישה צריך להיות מותאם למנוע photobleaching תוך מתן resolution.For מספקת דוגמה הזמני, עבור חצי מהיר הדינמיקה סידן פיקוח בתגובה לגירוי אגוניסט, תמונות נרכשו כל שתי שניות ב 1B דמויות ו-C הרבה יותר מהר שיעורי הרכישה גם אפשרי 6. לטווח ארוך הדמיה לאחר מתן staurosporine נרכשה עם מרווח יותר (ה -30) בין רכישות (איורים 1 D ו-E). </li></ol> 3. עיבוד תמונה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הניסוי הושלם, תמונות שהושגו ניתן לנתח במצב לא מקוון. הגדרת אזורים של עניין (ROI) שבו אתם רוצים לעקוב אחר השינויים ברמות הסידן. השתמש ROI נבחרים בתוך שטח ריק של השדה כדי לחסר הרקע במידת הצורך. יצוין כי המיטוכונדריה הם ניעתי די דינמי, ואירועים וחיוץ ב mitochondrion אחת על פני תקופות המורחבת לא תמיד אפשרי. לפיכך, בהתחשב תנועתיות גבוהה של אברון זה בכמה סוגי תאים, מבחר של ההחזר על ההשקעה צריכה להיות במעקב צמוד. יתר על כן, כפי שעולה איור 1, בתגובה המיטוכונדריה הטרוגני לגירויים שונים. לכן חשוב לנתח נתונים מקוון לפקח RO1 השמה על בסיס מסגרת לפי מסגרת. תיאור מפורט של מדידת סידן המיטוכונדריה מאוד המיטוכונדריה ניעתי תוארה במקומות אחרים 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידות יחס המתקבל ROI יכול להיות מיובאים לתוך Excel או graphingsoftware דומה. נתונים ניתן להציג שמץ המייצג שינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה בתא בודד או mitochondrion בודד, או בממוצע flאותות uorescence מ ROI מספר. יש לנו גם השתמשו בטכניקה זו כדי למדוד את רמות הסידן הממוצעת המיטוכונדריה אוכלוסייה של לימפוציטים שעברו אפופטוזיס המושרה על ידי Fas ליגנד 8. </li></ol> 4. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. (א) לוקליזציה subcellular של ratiometric-pericam-Mt. זו התמונה הראשונה מציגה לחיות תא הלה הביע ratiometric-pericam-Mt. התמונה השנייה מציגה מכתים ניאון עם mitochondrion סלקטיבית MitoTracker CMXRos צבען האדום. פלואורסצנטי צהוב בתמונה הממוזג מדגים שיתוף לוקליזציה של ratiometric-pericam-MT ו - פלואורסצנציה MitoTracker. (B) סדרה של יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של 4 תאים הלה הביע MT-ratiometric pericam שטופלו 10 mM ATP . (C) כימות של השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריה באזור של עניין (ROI) המצוין סדרה (ב) (ד) שטופלו עם 10 mM ATP. יחס pseudocolor (495:380 ננומטר) תמונות של תא הלה הביע הר -ratiometric pericam שטופלו staurosporine 0.5 מיקרומטר. הטרוגניות בתגובה הסידן במיטוכונדריה הפרט בא לידי ביטוי, כמו גם פיצול משמעותי של המיטוכונדריה של 60 דקות. המיטוכונדריה יש עליות oscillatory בסידן (ראש חץ לבן), ואילו אחרים אינם מראים שינויים משמעותיים ברמת הסידן (ראש חץ צהוב). (E) כימות עליות גלובלי רמות הסידן המיטוכונדריה בתא הלה יחיד לאחר אינדוקציה של אפופטוזיס עם 0.5 מיקרומטר staurosporine.

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death:+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2++uptake+in+apoptosis.">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li><li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2.">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li><li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2++revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin.">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li><li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2++concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein.">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li><li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis.">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li><li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+binds+to+inositol+(1,4,5)+trisphosphate+receptors,+amplifying+calcium-dependent+apoptosis.">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li><li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH:+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis.">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li><li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2+/H++antiporter.">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

כאן אנו מציגים שיטה מאוד פשוטה למדידת סידן המיטוכונדריה באמצעות המיטוכונדריה במיקוד pericam ratiometric. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א &#39;, באמצעות תקן widefield אופטיקה עם deconvolution לא ניתן להציג בקלות את המיטוכונדריה בתאים בודדים הלה עם יחס אות לרעש מקובל. הסיבה לכך היא כי תאים הלה, כמו רוב התאים בתרבית, מחוץ לשטח באופן משמעותי כאשר חסיד obviating את הצורך מיקרוסקופיה confocal או ציוד מיוחד אחר. מצאנו תוצאות דומות בתאים Jurkat דבק poly-ליזין coverslips מצופה 8. בניגוד מתודולוגיות באמצעות צבעים, אותו ניתן גם הלא פולשני לעקוב אחר רמות סידן המיטוכונדריה שעות באינדיקטורים סידן מקודדים גנטית כגון pericam ratiometric (איור 1E). זה חשוב במיוחד בעת ניתוח סידן המיטוכונדריה במהלך מוות של תאים. יתר על כן, אפשר גם לדמיין ביקוע / פיצול של המיטוכונדריה במהלך תהליך אפופטוטיים. כפי שמוצג 1D דמויות ו-E, טיפול staurosporine גורמת לעלייה איטית סידן subpopulations לבחור מתוכם פסגות המיטוכונדריה ב 20 דקות. רמות סידן לרדת שוב במקביל עם פיצול המיטוכונדריה לפני הולך שוב 2 שעות לאחר הטיפול. זה עולה בקנה אחד עם גלים איטיים בסידן cytosolic המושרה על ידי טיפול staurosporine שנמדדו באמצעות Fura-2 9. לפיכך, מידע חשוב הקינטית ניתן להשיג דבר שאינו אפשרי עם שיטות העסקת מדידות סטטי. למרות הצגנו יחסי ולא ריכוזי הסידן באיור 1, ניתן לכייל את החיישן באתרו לחשב רמות הסידן מוחלט 4, 10. אזהרה אחת חשובה שיש לקחת בחשבון הוא כי pericam ratiometric רגיש pH 4, 10. כמו גם רמות ה-pH cytosolic ואת המיטוכונדריה יכולה להשתנות באופן דרמטי במהלך 11 אפופטוזיס, זה שיקול חשוב. טיטרציה של pH ב pericam מבודד להביע המיטוכונדריה להוכיח כי הגדלת [H +] מגדיל פליטת pericam כאשר נרגש ב 495 ננומטר, עם השפעה מועטה על פליטה מאולצת על ידי עירור ב 410 ננומטר, מאפיין אשר נוצל למדוד בו זמנית הן סידן המיטוכונדריה ו pH 12. לכן, באופן סלקטיבי ניטור פליטה עם עירור 410 ננומטר מספק אמצעי סידן שאינם ratiometrically לפקח המיטוכונדריה בדאגה מופחת עבור ה-pH. לבסוף, את הפרוטוקול המוצגים כאן רק מחייב גישה מיקרוסקופ epifluorescent סטנדרטי עם מסנני זמינים באופן נרחב, ובכך טכניקה זו נגישה ביותר במעבדות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>MEA53310</td>
<td>Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol.</td>
</tr>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices, Inc</td>
<td>Metafluor</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Attofluor cell chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>A-7816</td>
<td>Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice.</td>
</tr>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>11668-019</td>
<td>Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies </td>
</tr>
<tr>
<td>MitoTracker Red CMXRos</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen Corporation</td>
<td>M7512</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

monitoring dynamic changes in mitochondrial calcium levels during apoptosis using a genetically encoded calcium sensor

שינויים דינאמיים בריכוז סידן תוך תאי בתגובה לגירויים שונים מווסת תהליכים תאיים רבים, כגון ריבוי, התמיינות, אפופטוזיס ו 1. במהלך הצטברות סידן, אפופטוזיס במיטוכונדריה מקדמת את שחרורו של תומכי אפופטוטיים גורמים מן המיטוכונדריה לתוך 2 cytosol. לכן זה עניין למדוד ישירות סידן המיטוכונדריה בתאים חיים באתרו במהלך אפופטוזיס. ברזולוציה גבוהה דימות פלואורסצנטי של תאים עמוסה עירור כפול ratiometric ולא ratiometric צבעים אינדיקטור סינתטי סידן הוכח להיות כלי אמין צדדי ללמוד היבטים שונים של סידן איתות תאיים. מדידת והנתיבים סידן cytosolic באמצעות טכניקות אלה היא פשוטה יחסית. עם זאת, מדידת רמות סידן intramitochondrial בתאים שלמים באינדיקטורים סידן סינטטי כגון rhod-2 ו-FF rhod הוא יותר מאתגר. האינדיקטורים סינתטי ממוקד המיטוכונדריה הקהו התגובות מגביר חוזרות בסידן המיטוכונדריה, ולשבש מורפולוגיה המיטוכונדריה 3. בנוסף, האינדיקטורים סינתטיים נוטים לדלוף החוצה של המיטוכונדריה על כמה שעות מה שהופך אותם מתאימים לטווח ארוך ניסויים. לכן, האינדיקטורים סידן מקודדים גנטית מבוססת על הפלואורסצנט הירוק (GFP) חלבון 4 או 5 aequorin ממוקד המיטוכונדריה הקלו מאוד מדידת דינמיקה סידן המיטוכונדריה. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה בתגובה לגירויים שונים. השיטה מבוססת על מיקרוסקופ פלואורסצנטי של &quot;ratiometric-pericam&quot; אשר מיועד סלקטיבי המיטוכונדריה. Pericam Ratiometric הוא אינדיקטור סידן על בסיס היתוך של חלבון permuted מעגלית ניאון צהוב calmodulin 4. עקידת סידן pericam ratiometric גורמת לשינוי של שיא עירור שלה nm 415-494 ננומטר, בעוד ספקטרום פליטה, אשר פסגות סביב 515 ננומטר, נשאר ללא שינוי. Ratiometric pericam נקשר יון סידן אחד עם ניתוק קבוע במבחנה של 1.7 מיקרומטר ~ 4. אלה המאפיינים של pericam ratiometric לאפשר כימות של שינויים מהירים לטווח ארוך בריכוז הסידן המיטוכונדריה. יתר על כן, אנו מתארים הסתגלות של מתודולוגיה זו מיקרוסקופ סידן תקן רחב בתחום ההדמיה עם מערכות הסינון זמין בדרך כלל. השימוש בשתי אגוניסטים ברורים, אגוניסט ATP purinergic ו אפופטוזיס וישכנע staurosporine התרופה, אנו מוכיחים כי שיטה זו היא המתאימה לניטור שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריה עם רזולוציה הזמני של שניות שעות. יתר על כן, אנחנו גם מראים כי pericam ratiometric שימושית גם עבור ביקוע מדידת הפיצול המיטוכונדריה / במהלך אפופטוזיס. לפיכך, pericam ratiometric הוא גם מתאים במיוחד למדידת לטווח ארוך מתמשך של הדינמיקה סידן המיטוכונדריה במהלך אפופטוזיס.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor at JoVE.com

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

23.9K Views.  University of Texas Medical Branch. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.

Video: Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium indicator dyes, which are BAPTA-based organic molecules that change their spectral properties in response to the binding of Ca2+ ions. Calcium indicator dyes fall into two categories, ratio-metric dyes like Fura-2 and Indo-1 and single-wavelength dyes like Fluo-4. Ratio-metric dyes change either their excitation or their emission spectra in response to calcium, allowing the concentration of intracellular calcium to be determined from the ratio of fluorescence emission or excitation at distinct wavelengths.  The main advantage of using ratio-metric dyes over single wavelength probes is that the ratio signal is independent of the dye concentration, illumination intensity, and optical path length allowing the concentration of intracellular calcium to be determined independently of these artifacts. One of the most common calcium indicators is Fura-2, which has an emission peak at 505 nM and changes its excitation peak from 340 nm to 380 nm in response to calcium binding.  Here we describe the use of Fura-2 to measure intracellular calcium elevations in neurons and other excitable cells.

Calcium signals play a key role in many cellular processes including gene expression, survival and differentiation. Here we demonstrate how to perform calcium imaging using Fura-2 AM. Calcium imaging is a valuable tool to study the regulation of intracellular calcium in real time and its regulation of signaling cascades.

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

Calcium imaging is a common technique that is useful for measuring calcium signals in cultured cells. Calcium imaging techniques take advantage of calcium ...

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) channels. CRAC channels play important role in regulation of T cell proliferation and gene expression. Abnormal CRAC channel function in T cells has been linked to severe combined immunodeficiency and autoimmune diseases 1, 2 . Studying CRAC channel function in human T cells may uncover new molecular mechanisms regulating normal immune responses and unravel the causes of related human diseases. Electrophysiological recordings of membrane currents provide the most accurate assessment of functional channel properties and their regulation. Electrophysiological assessment of CRAC channel currents in Jurkat T cells, a human leukemia T cell line, was first performed more than 20 years ago 3, however, CRAC current measurements in normal human T cells remains a challenging task. The difficulties in recording CRAC channel currents in normal T cells are compounded by the fact that blood-derived T lymphocytes are much smaller in size than Jurkat T cells and, therefore, the endogenous whole-cell CRAC currents are very low in amplitude. Here, we give a step-by-step procedure that we routinely use to record the Ca2+ or Na+ currents via CRAC channels in resting human T cells isolated from the peripheral blood of healthy volunteers. The method described here was adopted from the procedures used for recording the CRAC currents in Jurkat T cells and activated human T cells 4-8.

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium CRAC Currents in Human T Lymphocytes

We provide a step-by-step protocol for whole-cell patch clamp recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) currents in peripheral blood mononuclear cell-derived human T lymphocytes.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

In T lymphocytes, depletion of Ca2+ from the intracellular Ca2+ store leads to activation of plasmalemmal Ca2+ channels, called Calcium Release-Activated ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce informative probes or labels into expressed receptors that do not perturb receptor function. We used amber codon suppression technology to genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine (azF) at various targeted positions in GPCRs heterologously expressed in mammalian cells. The versatility of the azido group is illustrated here in different applications to study GPCRs in their native cellular environment or under detergent solubilized conditions. First, we demonstrate a cell-based targeted photocrosslinking technology to identify the residues in the ligand-binding pocket of GPCR where a tritium-labeled small-molecule ligand is crosslinked to a genetically-encoded azido amino acid. We then demonstrate site-specific modification of GPCRs by the bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligation reaction that targets the azido group using phosphine derivatives. We discuss a general strategy for targeted peptide-epitope tagging of expressed membrane proteins in-culture and its detection using a whole-cell-based ELISA approach. Finally, we show that azF-GPCRs can be selectively tagged with fluorescent probes. The methodologies discussed are general, in that they can in principle be applied to any amino acid position in any expressed GPCR to interrogate active signaling complexes.

We genetically-encode the unnatural amino acid, p-azido-L-phenylalanine at various targeted positions in GPCRs and show the versatility of the azido group in different applications. These include a targeted photocrosslinking technology to identify residues in the ligand-binding pocket of a GPCR, and site-specific bioorthogonal modification of GPCRs with a peptide-epitope tag or fluorescent probe.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of intracellular calcium release are the major intracellular calcium storage organelles, the endoplasmic reticulum (ER) and the more specialized sarcoplasmic reticulum (SR) in muscle cells. The dynamic release of calcium from these organelles is mediated by the ryanodine receptor (RyR) and the inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) with refilling occurring through the sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) pump. A genetically encoded calcium sensor (GECI) called CatchER was created to monitor the rapid calcium release from the ER/SR. Here, the detailed protocols for the transfection and expression of the improved, ER/SR-targeted GECI CatchER+ in HEK293 and C2C12 cells and its application in monitoring IP3R, RyR, and SERCA pump-mediated calcium transients in HEK293 cells using fluorescence microscopy is outlined. The receptor agonist or inhibitor of choice is dispersed in the chamber solution and the intensity changes are recorded in real time. With this method, a decrease in ER calcium is seen with RyR activation with 4-chloro-m-cresol (4-cmc), the indirect activation of IP3R with adenosine triphosphate (ATP), and inhibition of the SERCA pump with cyclopiazonic acid (CPA). We also discuss protocols for determining the in situ Kd and quantifying basal [Ca2+] in C2C12 cells. In summary, these protocols, used in conjunction with CatchER+, can elicit receptor mediated calcium release from the ER with future application in studying ER/SR calcium related pathologies.

Monitoring ER/SR Calcium Release with the Targeted Ca2+ Sensor CatchER+

We present protocols for the application of our targeted genetically-encoded calcium indicator (GECI) CatchER+ for monitoring rapid calcium transients in the endoplasmic/sarcoplasmic reticulum (ER/SR) of HEK293 and skeletal muscle C2C12 cells using real-time fluorescence microscopy. A protocol for the in situ Kd measurement and calibration is also discussed.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

Intracellular calcium (Ca2+) transients evoked by extracellular stimuli initiate a multitude of biological processes in living organisms. At the center of ...

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

סידן הדמיה של נוירונים קליפתיים באמצעות Fura, 02:00

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

מדידת Fluxes סידן מהיר ב cardiomyocytes

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד

Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T