1. تثبيت العينة وتضمينها الراتنج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إصلاح عينات من أنسجة وخلايا جديدة لمدة لا تقل عن 2 ساعة في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، وغلوتارالدهيد 2.5 ٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات في درجة حموضة 7.4. يجب أن لا يتجاوز حجم العينة 0،150 ملم في سماكة كافية للسماح للتغلغل أو مثبت ، وينبغي ألا تترك في الإصلاح لمدة أطول من 12 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في 20ml قنينة زجاجية التلألؤ وشطف لهم ثلاث مرات ، 5 دقائق لكل منهما ، في كاكوديلات 0.1M العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 1.5 ٪ (W / V) البوتاسيوم رباعي أكسيد الأوزميوم فيروسيانيد و 1 ٪ (W / V) في 0.1 العازلة كاكوديلات M (0،1 م ، ودرجة الحموضة 7.4) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع رباعي أكسيد الأوزميوم 1.0 ٪ (W / V) في المخزن كاكوديلات 0.1M لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مرة واحدة مع الماء المقطر المزدوج لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار مع 1 ٪ (W / V) خلات اليورانيل في الماء المقطر المزدوج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف المقاطع لمدة 5 دقائق في الماء المقطر المزدوج ، ثم يجفف في سلسلة متدرجة الكحول ، 2 دقائق كل تغيير (1 × 50 ٪ ، 1 ٪ × 70 ، 1 × 90 ٪ ، 1 ٪ × 95 ، 2 × 100 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين في زيادة تركيزات من راتنج Durcupan مختلطة مع الايثانول و 30 دقيقة كل تغيير ، ابتداء من الساعة Durcupan 50 ٪ في الايثانول ، ثم تليها : 70 ٪ ، 90 ٪ ، 95 ٪ ، ثم 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال Durcupan الطازجة وتستنهض الهمم ببطء لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام المركز ، وذلك باستخدام العصي الخشبية الكوكتيل ، المجاهر على الشرائح الزجاجية المطلية مع وكيل العفن فصل ، ووضعه في الفرن 65 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li></ol> 2. إعداد نموذج لالاكذوبه / SEM <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل طبقة الراتنج ، والتي تحتوي على عينات من بين الشرائح الزجاجية المجهر اثنين وتغسل جيدا لإزالة أي قالب فصل العامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر الضوء المرسل مع أهداف الطاقة المنخفضة ، أو تشريح المجهر مع إنارة المنقولة ، لتحديد المنطقة التي تهم شريحة من داخل الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع صغيرة (3 مم × 3 مم) مربع حول المنطقة ذات الاهتمام باستخدام شفرة حلاقة وهذا العصا إلى أعلى كتلة فارغة مع الراتنج الغراء الاكريليك (الشكل 1). انتظر 5 دقائق للالغراء لتتصلب ، ومن ثم المضي قدما إلى الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك كتلة إلى صاحب ulramicrotome و، وذلك باستخدام stereomicroscope المرفقة ، وتقليم جميع أنحاء المنطقة في المصالح مع شفرة الحلاقة حتى هرم صغير فقط من البقايا المادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من خفض كتلة ، وذلك باستخدام سكين الزجاج الثابتة في مشراح مستدق ، بحيث يمكن أن تكون المنطقة ذات الاهتمام يقع بالتحديد فيما يتعلق بأبعاد سطح بلوك (الشكل 1). قطع حافة واحدة من كتلة ، على مقربة من منطقة الفائدة ، بحيث يتم قطع خطوة عمودي من خلال نموذج (الشكل 1 و 2). هذه الخطوة لمواجهة أشكال التصوير (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة من مشراح مستدق وتصوير المنطقة المصالح داخل الكتلة ، وذلك باستخدام مجهر الضوء المرسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض كتلة قلصت بعيدا عن كعب راتنج المتبقية. يتم ذلك باستخدام رأى الصائغ ويضمن التي يتم وضعها فقط كتلة صغيرة داخل الاكذوبه / SEM. وينبغي أن الارتفاع الإجمالي لهذه الكتلة لن يكون أكثر من 5 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الغراء للصق كعب الألومنيوم مع الكربون ضمان أن يكون الجانب المصورة على حافة الأبعد (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغراء قد جفت ، ومعطف كتلة بطبقة رقيقة من الذهب (&gt; 20 نانومتر ؛ Cressington نظام التبخير فراغ). </li></ol> 3. التصوير في الاكذوبه / SEM <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التكبير منخفضة ، واستخدام التصوير الثانوية الإلكترون (5 كيلو فولت ، 0.5 nAmp) ، توجيه كتلة بحيث المنطقة المختارة من الاهتمام والى جانب كتلة ليمكن تصوير يواجه المشغل (الشكل 2 ج ، د). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه كتلة بحيث يمكن تصوير لمواجهة الأكاذيب موازية لشعاع الطحن. وهذا يعني أن شعاع الالكترون هو المنحى في 54 ° إلى هذا الوجه (الشكل 2 ب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شعاع ايون الحالية 13-27 nAmps في 30 كيلوفولت إزالة شريط ضيق من راتنج من الجبهة في المنطقة ليمكن تصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع التصوير backscattered لعرض الوجه المضروب أن يعتلي المنطقة من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر الضوئي صورة المرجعية (التي اتخذت في الخطوة 16) ، وصورة الوجه المضروب تحديد موقع المنطقة المحدد على أن تكون كتلة والتقط المضروب (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ودائع طبقة واقية (حوالي 1 ميكرون سميكة) من الكربون (أو المعادن) ، وذلك باستخدام نظام حقن الغاز في المجهر ، على سطح الكتلة ، وفوق منطقة الفائدة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تيار من 700 picoAmps ، مطحنة الدقيق في المنطقة من خلال كتلة والتي سوف تؤخذ الصور النهائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك شعاع لطحن مطحنة تماما صورة هذا الوجه حتى لا يمكن رؤية التحف الطحن على وجهه. يتم فحص طاحونة كاملة للوجه من خلال مراقبة التغيرات في كل صورة لاحقة عبر مجمل ميدان العرض. يمكن طحن غير كافية كما شهدت خطوط بيضاء أو &quot;الستائر&quot; الظهور vertically في الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مغادرة المجهر لساعات لا يقل عن 2 عن أي تغيرات حرارية لتبدد. هذا يقلل من المخاطر التي تواجهها كتلة سوف تنجرف أثناء التصوير ، مما أسفر عن الصور المنحرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المعلمات مجهر لتصوير الوجه متسلسل. تأكد من أن شعاع الالكترون والجهد الذي يتم منخفضة بما فيه الكفاية لصورة فقط على عمق ضحل جدا من المواد في مواجهة كتلة. ينبغي أن يكون هذا أيضا ضحالة بكثير من سمك وجها لإزالتها. معلمات نموذجي للتصوير هي الفولتية بين 1،2-2،0 كيلوفولت مع أحجام بكسل بين 4-20 نانومتر. بكسل يسكن تحتاج الى وقت لإبقاء حوالي 10 μsecs بحيث يتم الحفاظ على الوقت الإجمالي لطاحونة الوجه والحصول على صورة واحدة أقل من 2 دقيقة (الشكل 3). </li></ol> 4. أسرار النجاح الخطوة 1) التأكد من العينات ليست أكثر سمكا من 150 ميكرون. وسيمكن هذا الاختراق الكافي لبقع مختلفة والراتنج في هذه المادة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال sectioning العينات مع vibratome مباشرة بعد التثبيت. هذا هو المناسب لسمك أنسجة المخ. الأنسجة الأخرى يجب أن يتم اختبارها لضمان التثبيت الملائم والتلوين. خطوة يجب 3) أن يكون توزيع عينات بحرية في جميع أنحاء الحل ، وليس تجمعت معا في جزء واحد من قنينة بينما قدم هذا مثبت الثانوية. وهذا ضمان أقصى قدر من الاختراق من العينة والحد من العينة أن تصبح مشوهة خلال هذه العملية التثبيت. ويتحقق ذلك من خلال عينات بلطف يحوم داخل القارورة مباشرة بعد إضافة الحل. الخطوة 15) التأكد من أن يقع في المنطقة ذات الاهتمام فورا أدناه (&lt;30 ميكرون) على سطح الكتلة. وهذا سوف يقلل من كمية الطحن بواسطة شعاع أيون خلال المرحلة اقتناء الصور. الخطوة 22) والمسح الضوئي الوقت من شعاع ايون يحتاج إلى adequte لضمان المضروب تماما لمواجهة التصوير بأكمله. سيظهر الطحن واعتبرتها غير كافية الشرائط البيضاء ، أو &quot;الستائر&quot; تظهر عموديا إلى أسفل الوجه والتصوير. الخطوة 26) ويجب أن يواجه النهائي المضروب تكون أكبر من الوجه الذي هو تصوير. هذا هو لأنه طرد من راتنج المضروب من كتلة وredeposits على سطح كتلة في المنطقة المجاورة مباشرة. يمكن لهذا التعدي على redeposition مجال التصوير للعرض ، وتجنبها من خلال طحن مساحة كبيرة بكثير مما هو تصوير. لنافذة التصوير الذي هو 20 ميكرون واسعة ، وجهه كتلة المضروب هو أكبر من 30 ميكرون واسع. الخطوة 29) ومن الأهمية بمكان أن المعلمات شعاع الالكترون هي تلك التي يتم إنشاؤها بواسطة صورة الالكترونات التي تخرج من نانومتر القليلة الأولى فقط من سطح بلوك. هذا الأمر acheved عن طريق التقليل من الجهد إلى أقل من 2 كيلو فولت ، وضمان عدم اختراق الإلكترونات بعيدة جدا. هو أيضا ساعد هذا الجهد باستخدام الشبكة على كاشف بحيث لا الإلكترون وفقا لأعلى الطاقات المساهمة في الصورة النهائية. عادة ، يتم استخدام شبكة من التوتر 1.3 ك للحصول على الجهد التصوير من 1.5 كيلو فولت. 5. ممثل النتائج : <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. إعداد كتلة الراتنج. راتنج) جزءا لا يتجزأ من الباب الاكليلية (80 ميكرون سميكة) دماغ الفئران من خلال عرضها في البالغين steromicroscope. في الصورة تظهر بوضوح مناطق الدماغ المختلفة التي يمكن أن تقطع من المقطع (ب) باستخدام شفرة المشرط. هنا ، هو إزالة مربعة طول ضلعها 1 من القشرة و (ج) تمسك كتلة راتنج فارغة. د) ثم قلص كتلة راتنج بسكين الزجاج التي شنت في مشراح مستدق ، ومرة واحدة تم تخفيض كتلة بمغادرة فقط منطقة الفائدة (ه) ، هو قطع خطوة عمودي على السطح الأمامي من المواد المضمنة. و) ثم قص هذه المنطقة بأكملها قلصت من بقية الاجزاء والتي شنت في الصعود إلى كعب الألومنيوم جاهزة للطلاء المعادن والتصوير في المسح المجهر الالكتروني. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الاستعداد لمواجهة كتلة الاكذوبه / SEM التصوير. أ) و ب) من الرسوم التوضيحية تظهر كتلة والحافة التي يتم طحنها لخلق مواجهة التصوير (المشار إليها مع سهم مزدوج الرأس السوداء). ويظهر موقف شعاع ايون (أبيض) موازية لمواجهة التصوير ، ويظهر شعاع الالكترون (الرمادي) ضرب الوجه في 54 ° إلى شعاع ايون ج) يبين وجهة نظر الكتلة التي اتخذت مع شعاع الالكترون والتقط مع الإلكترونات الثانوية. على هذا الجانب من كتلة قتامة المنطقة (المشار إليها مع مربع أبيض منقط) يظهر جزء من الوجه الذي تم المضروب تقريبا (كما هو موضح مع المزدوج الرأسالطبعة الأسود السهم) للكشف عن نموذج المصدر. د) عندما يتم تصوير هذه المنطقة فقط باستخدام الإلكترونات backscattered يمكن رؤية الأنسجة المضمنة. هنا ، يشار إلى العرض الكامل للقسم الأنسجة المضمنة مع سهم مزدوج أبيض الرأس. الحجم في شريط ج) هو 100 ميكرون. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. عكس التصوير وبلغ حجم أنسجة المخ مع voxels الخواص. أ) صورة backscattered النقيض من الوجه كتلة يبين الترآيب الدقيق داخل المنطقة من الدماغ الفئران. كل الأغشية مرئية فضلا عن الهياكل الجزيئات الكبيرة. ب) تم جمع ما مجموعه 1600 صور في 5 نانومتر تباعد مما أدى إلى كومة صورة مع voxels آيزوتروبي ج) ولا يمكن تصوير هذا المكدس في أي طائرة مع القرار نفسه. هذه الصورة تظهر اتصال متشابك واحد هو تصوير في الطائرة س ص والطائرة YZ.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تقنية الاكذوبه / SEM يعمل بشكل مثالي عندما تهم المنطقة ليست كبيرة جدا. الحد الأعلى لحجم تصوير يعتمد على شعاع ايون والمنطقة التي يمكن أن طاحونة باستمرار مرارا على مدى ساعات عديدة. حتى الآن وقد تم ذلك مع المناطق حوالي 60 ميكرون 60 × ، ولكن ، والتصوير هذه المنطقة بأكملها هو غير ممكن مع قرار صورة مناسبة ، ويرجع ذلك أساسا إلى عامل الوقت في جمع مثل هذه الصور الكبيرة. كمثال ، صورة KX 4 4 ك بكسل يسكن مع الوقت إلى 10 ميكرو سوف تتخذ 2 دقائق و 40 ثانية للحصول على وعن مجال الرؤية من 60 ميكرون هذا من شأنه أن يعطي سوى 15 من حجم بكسل نانومتر. لتصوير التركيب الدقيق للخلايا والأنسجة ، وحجم أصغر بكسل هو أكثر ملاءمة ، وعادة ما بين 4 و 10 نانومتر / بكسل. سيكون لمساحة 60 × 60 ميكرون يمكن الحصول على صورة في 10 ساعة ، حتى لو كان هذا المجهر القدرة. لهذه الأسباب ، المجهر هو أداة مثالية لمجلدات الصور في ترتيب 10 × 10 × 10 ميكرون ، أو مناطق كبيرة من الخلايا بأكمله. ويمكن بسهولة أن يتم ذلك في غضون فترة 48 ساعة على العينات التي يتم جيدا يتناقض مع هذا الإجراء. حتى الآن تم استخدام بروتوكول بشكل رئيسي مع أنسجة المخ ، وكذلك أنواع مختلفة من خلايا الثدييات مثقف التمسك coverslips. ومع ذلك ، يمكن استخدام الإجراء التثبيت وتلطيخ مع العديد من أنواع أخرى من المواد البيولوجية ، بما فيها المواد النباتية لإنتاج مداخن بالتساوي صورة جيدة مقارنة. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو قدرتها على حجم الصور مع voxels الخواص. مداخن صورة من هذا النوع يسمح لتحليل حجم 3D باستخدام الصور الملتقطة في أي طائرة في المكدس. الاستفادة من هذا هو السماح للمراقب إلى ميزات صورة في صورة سلسلة من أي اتجاه ، وتوفير قدر أكبر من التفصيل صورة (الشكل 3).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> Cyanoacrylate الغراء </td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح المجهر : ايكا MZ8 </td><td> لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan الراتنج </td><td> سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM المجهر (زايس ، NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الأنسجة الشرائح الزجاجية </td><td> منزل جلاسر ، وألمانيا </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> الزجاج صانع سكين : ايكا EM KMR2 </td><td> لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا </td><td></td></tr><tr><td> قوارير الزجاج التلألؤ (20ml) </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> غلوتارالدهيد </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> ورأى الصائغ </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> فصل عامل قوالب </td><td> Glorex ، سويسرا </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> رباعي أكسيد الأوزميوم </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> أملاح الفوسفات عازلة للفوسفات </td><td> سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا </td><td> 71642 و71496 </td></tr><tr><td> الصوديوم كاكوديلات </td><td> سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> بصق المغطي مع الهدف الذهب </td><td> Cressington ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td></td></tr><tr><td> قاعدة تريس (TBS) </td><td> سيغما الدريخ كيمي شركة محدودة ، سويسرا </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> مشراح مستدق : ايكا UCT </td><td> لايكا مايكروسيستمز ، وألمانيا </td><td></td></tr><tr><td> اليورانيل خلات </td><td> EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

هذا البروتوكول يصف كيف العينات البيولوجية ، مثل أنسجة المخ ، ولا يمكن تصوير في ثلاثة أبعاد باستخدام المجهر تركز أيون شعاع الالكترون / المسح (FIB / SEM). يتم إصلاح هذه العينات مع الألدهيدات ملطخة المعادن الثقيلة باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم وخلات اليورانيل. هم المجففة ثم مع الكحول وتسللت مع الراتنج ، وهو تصلب ذلك الحين. باستخدام مجهر الضوء ومشراح مستدق بالسكاكين الزجاج ، ويتم إجراء كتلة صغيرة تحتوي على مصلحة المنطقة القريبة من السطح. ثم يتم وضع كتلة داخل الاكذوبه / ووزارة شؤون المرأة ، وشعاع ايون المستخدمة في طاحونة ما يقرب من وجه رأسية على طول جانب واحد من الكتلة ، على مقربة من هذه المنطقة. باستخدام الإلكترونات backscattered لصورة الهياكل الأساسية ، ويطحن ثم أصغر وجه مع أدق شعاع ايون وفحص السطح بشكل وثيق لتحديد الدقيق للمنطقة وجها ليمكن تصوير ويطحن. ثم يتم تعيين المعلمات من المجهر بحيث يتم طحنها مرارا وتكرارا على وجهه وتصويرها بحيث يتم جمعها من خلال الصور التسلسلية حجم الكتلة. سوف تحتوي عادة على صورة كومة voxels الخواص ذات أبعاد صغيرة كما نانومتر 4 (أ) في كل اتجاه. هذا جودة الصورة في أي طائرة التصوير تمكن المستخدم لتحليل التركيب الدقيق خلية في أي زاوية المشاهدة داخل كومة الصورة.

Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

هذا البروتوكول يصف كيف يمكن أن تكون على استعداد نسيج المخ جزءا لا يتجزأ من الراتنج والمصورة في الأبعاد الثلاثة في شعاع ايون ركزت والمسح الضوئي المجهر الالكتروني.

ركزت شعاع ايون طحن والمجهر الإلكتروني لأنسجة الدماغ

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. هذا البروتوكول يصف كيف يمكن أن تكون على استعداد نسيج المخ جزءا لا يتجزأ من الراتنج والمصورة في الأبعاد الثلاثة في شعاع ايون ركزت والمسح الضوئي المجهر الالكتروني.

Video: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

الميكروية مزدوجة الماسورة والمركزة لقياس خارج الخلية ايون إشارات في أنسجة المخ

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

تميز خصائص متعددة النطاقات الميكانيكية للأنسجة المخ عن طريق مجهر القوة الذرية، تأثير المسافة البادئة، وRheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ الرئيسيات غير البشرية لمرحلة ما قبل تضمين المناعية والمجهر الإلكتروني

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

شرائح فرس النهر الأفقية من دماغ الفأر

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

المسلسل كتلة الوجه المسح المجهري الإلكترون (SBEM) لدراسة العمود الفقري Dendritic

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...