1. לדוגמה קיבוע והטבעה שרף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות של רקמות ותאים טרי קבועים לפחות 2 שעות paraformaldehyde 2% ו -2.5% glutaraldehyde במאגר M 0.1 פוספט ב-pH של 7.4. גודל המדגם לא יעלה על 0.150 מ&quot;מ עובי על מנת לאפשר חדירה מקבע נאותה או, ולא צריך להשאיר לתקן את יותר מ 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות צלוחיות זכוכית scintillation 20ml ולשטוף אותם שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר cacodylate 0.1M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 1.5% (w / v) אוסמיום אשלגן tetroxide פרוציאני ו 1% (w / v) במאגר cacodylate 0.1 M (0.1 מ &#39;, pH 7.4) במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם tetroxide אוסמיום 1.0% (w / v) במאגר cacodylate 0.1M 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף מיד עם מים מזוקקים כפול 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכתם עם 1% (w / v) אצטט uranyl במים מזוקקים כפול במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את החלקים במשך 5 דקות במים מזוקקים כפול, ולאחר מכן מייבשים בסדרה אלכוהול ציון, 2 דקות כל שינוי (1 x 50%, 1 x 70%, 1% 90 x, 1% 95 x, 2 x 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטמע בריכוזים הגוברת של שרף Durcupan מעורבב עם אתנול, 30 דקות כל שינוי, החל Durcupan 50% אתנול, לאחר מכן על ידי: 70%, 90%, 95%, ולאחר מכן 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף Durcupan טריים להתסיס לאט במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים מקום, באמצעות מקלות עץ קוקטייל, על מיקרוסקופים שקופיות הזכוכית מצופה סוכן עובש הפרדה, ומכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. </li></ol> 2. הכנת המדגם עבור FIB / SEM <ol start="11" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את שכבת שרף, המכיל את הדגימות, החל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולשטוף ביסודיות כדי להסיר עובש הפרדת סוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר עם מטרות צריכת חשמל נמוכה, או לנתח מיקרוסקופ עם תאורה לשדר, כדי לזהות את האזור של עניין בתוך פרוסה של שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור קטן (3 מ&quot;מ x 3 מ&quot;מ) מרובע סביב האזור של עניין באמצעות סכין גילוח מקל זו לראש לחסום שרף ריק עם דבק אקרילי (איור 1). המתן 5 דקות הדבק להתקשות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את הבלוק לתוך בעל ulramicrotome ו, באמצעות stereomicroscope המצורפת, מטופח סביב האזור של עניין עם סכין גילוח עד פירמידה קטנה בלבד של חומר נשאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יתר על כן לקצץ את הבלוק, בעזרת סכין זכוכית קבוע לתוך ultramicrotome, כך האזור של עניין יכול להיות ממוקם בדיוק ביחס ממדים של פני השטח של בלוק (איור 1). חותכים קצה אחד של הרחוב, קרוב לאזור של עניין, כך צעד בניצב היא לחתוך המדגם (איור 1 ו - 2). צעד זה מהווה את הפנים הדמיה (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הבלוק מן ultramicrotome ולצלם את האזור של עניין בתוך הבלוק, באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את גוש גזוז הרחק בדל שרף הנותרים. הדבר נעשה באמצעות ראתה של צורף ומבטיח כי רק גוש קטן ממוקם בתוך FIB / SEM. הגובה הכולל של גוש זה לא צריך להיות יותר מ 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק לחסום את בדל אלומיניום עם הדבק פחמן להבטיח שהצד להיות צילמו נמצא בקצה החיצוני (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדבק התייבש, המעיל לחסום בשכבה דקה של זהב (&gt; 20 ננומטר, אידוי Cressington שואב אבק). </li></ol> 3. הדמיה של FIB / SEM <ol start="20" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהגדלה נמוכה, ושימוש משני אלקטרונים הדמיה (5 kV, 0.5 nAmp), המזרח לחסום כך את האזור שנבחר עניין הצד של הבלוק להיות צילמו עומדת בפני המפעיל (איור 2 ג, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח לחסום כך את פני להיות צילמו שקרים במקביל הקורה כרסום. זאת אומרת כי אלומת אלקטרונים מכוונת על 54 ° להתמודד עם זה (2 ב איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אלומת יונים הנוכחי של 13-27 nAmps ב kV 30 להסיר רצועה צרה של שרף מהחזית האזור להיות צילמו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר למצב הדמיה backscattered להציג את הפנים הסתובבו כי overlies האזור של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ אור התייחסות תמונה (נלקחה ב שלב 16) ואת התמונה של הפנים הסתובבו לאתר את האזור המדויק ברחוב להיות הסתובבו וצילמו (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקדה שכבת מגן (כ 1 מיקרון עבה) של פחמן (או מתכת), באמצעות מערכת הזרקת דלק של המיקרוסקופ, על פני השטח של הבלוק, מעל האזור של עניין (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש הנוכחי של 700 picoAmps, טחנה עד דק את האזור של גוש שבתוכו תמונות הסופי יילקחו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את קרן כרסום לטחנת לחלוטין את הפנים בתמונה עד אין ממצאים כרסום ניתן לראות על הפנים. מפעל שלם של הפנים נבדק על ידי התבוננות שינויים כל תמונה שלאחר מכן על פני השדה כולו מבט. כרסום לקוי ניתן לראות גם פסים לבנים או &quot;וילונות&quot; המופיע vertically בתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו את המיקרוסקופ במשך 2 שעות לפחות עבור כל שינוי תרמית להתפוגג. פעולה זו מפחיתה את הסיכון כי הפנים לחסום ייסחף במהלך הדמיה, וכתוצאה מכך תמונות misaligned. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרמטרים מיקרוסקופ הדמיה פני סדרתי. ודא כי אלומת אלקטרונים יש מתח כי היא נמוכה מספיק כדי תמונה רק בעומק רדוד מאוד של חומר מול לחסום. זה צריך להיות גם הרבה יותר רדוד יותר בעובי של הפנים כדי להסירו. פרמטרים אופייניים הדמיה הם מתח של בין 1.2-2.0 kV עם גודל פיקסל של בין 4-20 ננומטר. פיקסל לשכון זקוק לזמן כדי להיות כל הזמן סביב 10 μsecs כך את סך כל הזמן אל טחנת הקמח פנים לרכוש תמונה אחת נשמרת מתחת ל -2 דקות (איור 3). </li></ol> 4. סודות להצלחה שלב 1) ודא דוגמאות אינן יותר עבה 150 מיקרון. זה יאפשר חדירה נאותה של כתמים שונים שרף לתוך החומר. זו יכולה להיות מושגת על ידי חתך את דגימות עם vibratome מיד לאחר קיבעון. עובי זה מתאים ברקמת המוח. רקמות אחרות צריכים להיבדק על מנת להבטיח קיבוע מכתים נאותים. שלב 3) דגימות חייב להיות מופץ בחופשיות ברחבי פתרון, ולא בכבדות יחד בחלק אחד של הבקבוקון בעוד זה מקבע המשני הוא הציג. פעולה זו תבטיח חדירה מקסימלית של המדגם ולהפחית את המדגם נעשה מעוות במהלך תהליך זה קיבעון. זו מושגת על ידי בעדינות מתערבל דגימות בתוך הבקבוקון מיד אחרי הפתרון הוא הוסיף. שלב 15) ודא כי האזור של עניין נמצא מיד מתחת (&lt;30 מיקרון) את פני השטח של הבלוק. זה יקטין את כמות הטחינה על ידי יון הקורה בשלב רכישת התמונה. שלב 22) בפעם סריקה של יון הקורה צריך להיות adequte כדי להבטיח את פני הדמיה כולו מחורץ לגמרי. כרסום לקוי יוצגו כמו פסים לבנים, או &quot;וילונות&quot; המופיע אנכית כלפי מטה מול הדמיה. שלב 26) הפנים הסתובבו הסופי חייב להיות גדול יותר מאשר הפנים כי הוא הדמיה. הסיבה לכך היא שרף הסתובבו הוא נפלט מן הבלוק redeposits על פני השטח לחסום בסביבה הקרובה. Redeposition זה יכול לפלוש למגרש הדמיה של נוף, והוא להימנע על ידי כרסום שטח גדול הרבה יותר מאשר היא הדמיה. עבור חלון הדמיה כי הוא 20 מיקרון רחב, הפנים לחסום הסתובבו גדול מ 30 מיקרון רחב. שלב 29) זה קריטי, כי הפרמטרים אלומת אלקטרונים הן כאלה התמונה נוצרת על ידי אלקטרונים העולות רק את ננומטר הראשונים של פני השטח של בלוק. זה acheved ידי מזעור מתח kV להלן 2 ולהבטיח כי האלקטרונים לא לחדור עמוק מדי. זה עזר גם באמצעות מתח רשת על הגלאי כך שרק אלקטרונים עם האנרגיות הגבוהות ביותר לתרום התמונה הסופית. בדרך כלל, מתח רשת של kV 1.3 משמש מתח הדמיה של 1.5 kV. 5. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. הכנת לחסום שרף. שרף) מוטבע סעיף העטרה (80 מיקרון עבה) דרך המוח עכברוש מבוגר שנצפו ב steromicroscope. התמונה מראה בבירור את אזורי מוח שונים שניתן לחתוך מהחלק (ב) באמצעות להב סכין המנתחים. כאן, בכיכר 1 מ&quot;מ מהקורטקס מוסר (ג) תקוע לחסום שרף ריק. ד) לחסום שרף חיתוך אז עם סכין זכוכית רכוב ultramicrotome, וברגע לחסום צומצמה רק להשאיר את האזור של עניין (ה), צעד הוא חתך בניצב לפני השטח הקדמי של החומר מוטבע. ו) זה האזור מטופח כולו ואז לחתוך מיתר שרף ועלה על בדל אלומיניום מוכן ציפוי מתכת הדמיה ב סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הכנת הפנים לחסום עבור FIB / SEM הדמיה. א) ו ב) להראות איורים של הגוש ואת קצה מחורץ כדי ליצור את הפנים הדמיה (מסומן עם החץ בעל שני ראשים שחורים). העמדה של אלומת יונים (לבן) מוצג במקביל מול הדמיה, לבין אלומת אלקטרונים (אפור) מוצג להכות את הפנים על 54 ° עד יון הקורה. ג) מראה תצוגה של גוש שצולמו עם אלומת אלקטרונים הדמיה עם אלקטרונים משניים. יחד בצד הזה של לחסום את אזור כהה יותר (מסומן עם תיבת לבן מנוקד) מראה חלק של הפנים כי כבר הסתובבו בערך (מוצג פעמיים עם ראשעורך חץ שחור) כדי לחשוף את מדגם הבסיס. ד) כאשר אזור זה הוא צילמו רק באמצעות האלקטרונים backscattered רקמת מוטבע ניתן לראות. כאן, רוחב המלא של הסעיף רקמות מוטבע מסומן בחץ כפול לבן בראשותו. בר סולם ב ג) הוא 100 מיקרון. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. הדמיה נפח של רקמת המוח עם voxels איזוטרופיים.) הפוך לעומת backscattered תמונה של הפנים לחסום מראה את ultrastructure בתוך אזור במוח חולדה. ממברנות כל נראים כמו גם מבנים macromolecular גדול. ב) סך של 1600 תמונות שנאספו על המרווח 5 ננומטר וכתוצאה מכך מחסנית תמונה עם voxels איזוטרופיים. ג) מערך זה ניתן הדמיה במישור כלשהו עם רזולוציה זהה. תמונה זו מראה קשר סינפטי יחיד הדמיה במישור xy לבין מטוס YZ.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הטכניקה של FIB / SEM הפועלת בצורה אופטימלית כאשר אזור של אינטרס אינו גדול מדי. גבול עליון נפח צילמו תלוי יון הקורה ואת השטח שהוא יכול בעקביות טחנת שוב ושוב במשך שעות רבות. עד כה זה נעשה עם האזורים של סביב 60 x 60 מיקרון, עם זאת, הדמיה זו האזור כולו אינו אפשרי עם רזולוציה תמונה מתאימה, בעיקר בשל גורם הזמן באיסוף כגון תמונה גדולה. כדוגמה, תמונה 4 KX 4 k עם פיקסל להתעכב זמן 10 מיקרו ייקח 2 דקות ו 40 שניות כדי לרכוש, ועל שדה הראייה של 60 מיקרון זה היה רק ​​לתת גודל פיקסל של 15 ננומטר. עבור הדמיה ultrastructure של תאים ורקמות, גודל פיקסל קטן יותר הוא מתאים יותר, בדרך כלל בין 4 ל 10 ננומטר / פיקסל. עבור שטח של 60 x 60 מיקרון התמונה תהיה רכשה 10 שעות, גם אם המיקרוסקופ היה ביכולת זו. מסיבות אלה, המיקרוסקופ הוא כלי אידיאלי עבור כרכים התמונה בסדר גודל של 10 x 10 x 10 מיקרון, או אזורים משמעותי של תאים שלמים. זה יכול להיעשות בקלות בתוך פרק זמן 48 שעות ביממה על דגימות היטב בניגוד הליך זה. עד כה בפרוטוקול שימש בעיקר ברקמת המוח, כמו גם סוגים שונים של בתאי יונקים בתרבית דבקות coverslips. עם זאת, ההליך קיבעון והכתים ניתן להשתמש עם סוגים רבים אחרים של חומר ביולוגי, כולל חומר צמחי לייצר תמונה שווה ערימות היטב בניגוד. לכן היתרון העיקרי של טכניקה זו היא יכולתה כרכים תמונה עם voxels איזוטרופיים. ערימות תמונה מסוג זה לאפשר ניתוחים נפח 3D באמצעות תמונות שצולמו על כל מטוס בערימה. היתרון של זה היא לאפשר את הצופה תכונות תמונה בסדרה את התמונה מכל כיוון ומתן בפירוט תמונה גדולה יותר (איור 3).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Cyanoacrylate דבק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ הביתור: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan שרף </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM מיקרוסקופ (Zeiss, NVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית היסטולוגיה שקופיות </td><td> Menzel-גלזר, גרמניה </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> סכין יצרנית הזכוכית: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> צלוחיות זכוכית scintillation (20ml) </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldehyde </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> התכשיטן של ראה </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould הפרדת סוכן </td><td> Glorex, שוויץ </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> אוסמיום tetroxide </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> פוספט מלחי פוספט עבור חיץ </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> 71642 ו 71496 </td></tr><tr><td> נתרן cacodylate </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> גמגום Coater עם יעד זהב </td><td> Cressington, ארה&quot;ב </td><td></td></tr><tr><td> טריס הבסיס (TBS) </td><td> סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, שוויץ </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotome: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, גרמניה </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl אצטט </td><td> EMS, ארה&quot;ב </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

פרוטוקול זה מתאר כיצד דגימות ביולוגיות, כמו רקמת המוח, ניתן הדמיה בשלושה ממדים באמצעות אלומת יונים ממוקדת / סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (FIB / SEM). הדגימות הם קבועים עם מוכתם, אלדהידים מתכות כבדות באמצעות tetroxide אוסמיום ו אצטט uranyl. הם מיובש אז עם אלכוהול הסתננו עם שרף, שהוא מוקשה אז. באמצעות מיקרוסקופ אור ultramicrotome בסכינים זכוכית, בלוק קטן המכיל את הריבית באזור קרוב לפני השטח הוא עשה. הבלוק ממוקם אז בתוך FIB / SEM, ואת אלומת יונים בעבר טחנת בערך פנים אנכי לאורך צד אחד של הרחוב, קרוב לאזור זה. שימוש אלקטרונים backscattered לתמונה מבנים הבסיסית, פנים קטנות מחורץ אז עם אלומת יונים עדינה השטח בחנו מקרוב יותר כדי לקבוע את האזור המדויק של פני להיות צילמו ו מחורץ. הפרמטרים של המיקרוסקופ נקבעים אז כך את פניו מחורץ שוב ושוב צילמו כך שהתמונות סדרתי נאספים דרך בהיקף של הבלוק. מחסנית התמונה תהיה בדרך כלל מכילים voxels איזוטרופיים עם ממדים קטנים כמו ננומטר 4 לכל כיוון. זו איכות התמונה במישור כלשהו הדמיה מאפשרת למשתמש לנתח ultrastructure תא בכל זווית צפייה בתוך ערימה של התמונה.

Watch this Scientific Journal Video about Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue at JoVE.com

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.

Video: Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microelectrodes כפולה קנה וקונצנטריים עבור אותות המדידה של תאי יון ברקמת המוח

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

ניתוח של המוח המיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופ סידורי בלוק פן אלקטרונים סורק

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה טורית של פרצוף בלוק (SBEM) לחקר קוצים דנדריטים

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...