وأيد هذا العمل من قبل على جائزة التجريبية من مركز الصدمات ناثان (P30 AG13283) ومنحة R01 (R01 AG028516) من المعهد الوطني للشيخوخة (NIA) إلى A. - LH

<html> 1. إنشاء منحنى المعايرة لتقدير تركيزات البكتيريا هذا المقطع يصف طريقة لتقدير تركيز البكتيريا عن أي سلالة بكتيريا معينة (مثلا OP50 ، HT115) التي سيتم استخدامها كمصدر للغذاء للتجارب تقييد الغذائية في C. ايليجانس. وينبغي وضع منحنيات المعايرة منفصلة لكل سلالة البكتيريا المستخدمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من E. اختار القولونية OP50 البكتيريا من مسحة جديدة من البكتيريا على أجار LB في 3 مل مرق LB السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان OP50 الثقافة في 37 درجة مئوية شاكر وتسمح للبكتيريا لتنمو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد المسلسل 2 أضعاف التخفيفات لتعليق البكتيرية من الثقافة بين عشية وضحاها (2X ، 4X ، 8X ، 16X ، 32x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الامتصاصية (الكثافة البصرية) من كل تخفيف في 600 نانومتر بواسطة معمل في ثلاث نسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من تمييع كل تعليق البكتيرية 1000000 أضعاف (1000 أضعاف التخفيف مرتين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.4 مل من انتشار البكتيريا من كل تعليق تخفيف بالتساوي على طبق آجار LB 100 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحات LB مع OP50 في الحاضنة 37 درجة مئوية ل18-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد المستعمرات البكتيرية نمت على كل لوحة. وتستخدم التهم مستعمرة لحساب CFU (وحدة مستعمرة تشكيل) لكل مليلتر لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تأسيس العلاقة بين القيم المقاسة و600 OD OP50 تركيزات البكتيريا عن طريق التآمر OD 600 كدالة للتركيز البكتيريا (كفو / مل) ، وإجراء تحليل الانحدار الخطي (الشكل 1). </li></ol> الحلول : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> مرق لوريا (LB) ، 1L : </td></tr><tr><td > 10 ز </td><td> Bacto - تريبتون </td></tr><tr><td> 5 ز </td><td> مستخلصات الخميرة </td></tr><tr><td> 10 ز </td><td> كلوريد الصوديوم </td></tr></tbody></table> يضاف الماء منزوع الأيونات إلى 1L. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. 2. إعداد لوحة الصلبة القائمة على النظام الغذائي لوحات (SDR) تقييد هذا المقطع يصف إعداد لوحات لاستخدامها في بناء لوحة الصلبة الغذائية التجارب (SDR) التقييد. عادة ، نرى تركيز البكتيريا من 1 × 10 11 كفو / مل كما بالمال وبالشهرة أيضا إعلان حالة التغذية و1 × 10 8 كفو / مل كشرط الأمثل لتغذية DR هذا الأسلوب. ومع ذلك ، قد تكون هناك حاجة 4-6 تركيزات مختلفة البكتيريا لإقامة كاملة الجرعة التي تعتمد على العلاقة لحقوق السحب الخاصة واستجاباته. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلقيح مستعمرة واحدة من E. القولونية OP50 البكتيريا في 3 مل من السائل مرق LB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الثقافة في 37 OP50 شاكر درجة مئوية وتسمح للبكتيريا لتنمو لمدة 6-8 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ثقافة OP50 إلى قارورة جديدة تحتوي على 500 مل مرق LB ، ووضع الثقافة في OP50 الظهر 37 درجة مئوية شاكر بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس OD 600 من ثقافة OP50 لتحديد تركيز البكتيريا (ويحسب تركيز باستخدام منحنى المعايرة ولدت في الجزء 1). قد تكون هناك حاجة التخفيفات المناسبة لقياس دقيق للالامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه OP50 البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 1500 ز لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend البكتيريا إلى تركيز 1 × 12 10 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير 10 مل الثقافة البكتيريا في ستة تركيزات مختلفة : 1 × 10 12 ، 10 11 ، 10 10 ، 10 9 ، 10 8 ، 10 7 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طدت ماصة 0.2 مل من ثقافة البكتيريا في وسط لوحة NGM 60 ملم. تجنب لمس سطح اللوحة مع تلميح ماصة ، والنكات على سطح تسمح لتحفر الديدان في لوحات أجار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات مكان في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 10μL من كربنيسيلين 100mg/mL و 10 ميكرولتر من الكاناميسين 50mg/mL إلى كل لوحة لإلقاء القبض على نمو البكتيريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات تخزين مع تركيزات مختلفة من البكتيريا للمضادات الحيوية في قتل 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل (حتى شهر واحد). من المهم إعداد وتخزين ما يكفي من لوحات لتجربة المخطط بأكمله على الأقل 1-2 أيام المقبلة. باستخدام نفس دفعة من لوحات للتجارب بأكملها هو الأفضل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من صلاحية البكتيريا ، وتتخلص من بعض أنواع البكتيريا من حقوق السحب الخاصة لوحات وانتشاره على صفيحة فارغة مع NGM كربنيسيلين والكاناميسين. وضع لوحة في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات ومن ثم تحقق لنمو البكتيريا (وينبغي ملاحظة أي نمو البكتيريا). </li></ol> الحلول <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> الديدان الخيطية وسائط النمو (NGM) ، 1L : </td></tr><tr><td > 3 ز </td><td> كلوريد الصوديوم </td></tr><tr><td> 2.5 غرام </td><td> Bacto - ببتون </td></tr><tr><td> 20G </td><td> آغار </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة ، والسماح لتبرد إلى 65 درجة مئوية ، ثم تضاف : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td > 1 مل </td><td> 1 م MgSO 4 </td></tr><tr><td> 1 مل </td><td> 1 م 2 CaCl </td></tr><tr><td> 1 مل </td><td> 5 ملغ / مل نسبة الكولسترول في الدم </td></tr><tr><td> 25 مل </td><td> 1M فوسفات البوتاسيوم ، 6.0 درجة الحموضة </td></tr></tbody></table> صب السائل على الفور NGM 60 ملم × 15 ملم في أطباق بتري aliquots 10 مل 3. إعداد تجارب حقوق السحب الخاصة بالنسبة لمعظم دراسات حقوق السحب الخاصة ذات الصلة ، مثل تحليل مدى الحياة والتنميط الخصوبة ، وإعداد السكان في سن متزامنة من الديدان أمر ضروري. لدراسات أخرى ، ونقل ببساطة الديدان من لوحة OP50 منتظمة لحقوق السحب الخاصة لوحة لبدء تقييد الغذائية. في هذا المقطع ، يتم وصف بروتوكول لاقامة عمر تحليل للحيوانات حقوق السحب الخاصة على سبيل المثال. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام منتقي الدودة البلاتين لنقل 20-30 البالغين التناسل النشطة على عدة لوحات NGM منتظمة مع OP50. اعتمادا على عدد من البيض المطلوبة للتجارب ، قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من الكبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحات عند 20 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للوضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من البالغين. وينبغي لوحات تفقد البصر عن البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لوحات عند 20 درجة مئوية ، والسماح للذرية لتطوير الكبار في Late-L4/day المرحلة 1. عادة ، وهذا يستغرق 3 أيام لأنواع الديدان N2 البرية عند 20 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عدد مناسب من البالغين 1 يوم حقوق السحب الخاصة على لوحة لبدء تقييد الغذائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل عمر ، تعيين ما يصل الى 6-8 مع لوحات في لوحة 10-20 الديدان لكل حالة حقوق السحب الخاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> درجة قابلية كل دودة كل يوم 2 حتى عن الديدان لقوا حتفهم. فمن الأهمية بمكان أن يتم نقل الديدان لحقوق السحب الخاصة لوحات جديدة كل ساعة 12-48 لتجنب الحرمان الكامل من الطعام. </li></ol> 4. ممثل النتائج : هو مبين في الشكل رقم 1 هو مؤامرة ممثل منحنى المعايرة لتقدير OP50 تركيز فيما يتعلق OD 600. ويمكن استخدام المعادلة المتولدة عن تحليل الانحدار بطانة لجميع الحسابات في المستقبل تركيزات البكتيريا OP50. هو مبين في الشكل 2 مثالا على معايرة تأثير العلاجات المزمنة حقوق السحب الخاصة على عمر يعني سلالات دودة مختلفة. الخط الأزرق يمثل طبيعية تعتمد على الجرعة استجابة البرية من نوع الديدان لحقوق السحب الخاصة. الخط الأحمر يشير إلى أن قمعت جزئيا تأثير عمر من حقوق السحب الخاصة التي DRR - 2 عمر الفاروق ، في حين DAF - 16 (mu86) ليس له تأثير على تمديد عمر حقوق السحب الخاصة التي يسببها. الطريقة بالتفصيل لأداء تحليل عمر في C. ايليجانس يوصف في الأدبيات السابقة 1-3. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الممثل نتيجة لمنحنى المعايرة لتقدير E. القولونية OP50 التركيز. يتم رسم OP50 تركيز بوصفها وظيفة من 600 OD قياس القيم. أشرطة الخطأ وتخفيفه SD = ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها 8X 1.5x ، 2X ، 4X ، 16X ، 32x قبل قياس الامتصاصية ، وكذلك 1000 X المخفف مرتين قبل CFU القياس. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الممثل نتيجة لجيم ايليجانس عمر التجربة المقارنة بين الحيوانات البرية N2 نوع (الأزرق) مع اثنين من المسوخ مختلفة (الأخضر والأحمر) استجابة لحقوق السحب الخاصة (من الشكل تشينغ وآخرون 4). أشرطة الخطأ = SEM

<ol>
	<li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor.">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li><li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans.">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li><li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction. , (1988).</li><li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subfield+history:+caloric+restriction,+slowing+aging,+and+extending+life.">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li><li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+caloric+restriction+and+ageing.">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li><li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate,+stress+resistance,+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans.">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li><li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans.">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li><li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans.">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li><li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHA-4/Foxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans.">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li><li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food.">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li><li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans.">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ومن المعروف تقييد الغذائية (DR) لزيادة العمر وتأخير ظهور الأمراض المرتبطة بالعمر المختلفة في مجموعة واسعة من الأنواع ، بما فيها الثدييات 5-7. وقد استخدمت التلاعب الناحيتين البيئية والوراثية للدكتور النموذج في C. ايليجانس ، بما فيها الديدان زراعة في وسط شبه ا?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> كربنيسيلين </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> الذائبة في الماء. </td></tr><tr><td> الكاناميسين </td><td> روش </td><td> 10106801001 </td><td> الذائبة في الماء. </td></tr><tr><td> Bacto - ببتون </td><td> بيكتون ، ديكنسون ، وشركة </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto - تريبتون </td><td> بيكتون ، ديكنسون ، وشركة </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto ، خلاصة الخميرة </td><td> بيكتون ، ديكنسون ، وشركة </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> آغار </td><td> بيكتون ، ديكنسون ، وشركة </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> ثقافة العقيمة أنبوب </td><td> الولايات المتحدة الأمريكية والعلم </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> معمل </td><td> أمرشام العلوم البيولوجية </td><td> الجينات كوانت الموالية </td><td> أمرشام هي الآن جزء من شركة جنرال الكتريك للرعاية الصحية. </td></tr><tr><td> تشريح مجهر </td><td> زايس </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> بيكمان كولتر </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

solid plate-based dietary restriction in caenorhabditis elegans

ومن المعروف الحد من تناول الطعام من دون سوء التغذية أو المجاعة لزيادة العمر وتأخير ظهور الأمراض المرتبطة بالعمر المختلفة في مجموعة واسعة من الأنواع ، بما فيها الثدييات. كما أنه يسبب انخفاض في وزن الجسم والخصوبة ، وكذلك انخفاض مستويات السكر في البلازما ، والانسولين ، وIGF - 1 في هذه الحيوانات. وكثيرا ما يشار إلى هذا العلاج وتقييد الغذائية (DR) أو الحد من السعرات الحرارية (CR). برزت ايليجانس انواع معينة الخيطية باعتبارها كائن نموذجا هاما لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. وقد استخدمت التلاعب الناحيتين البيئية والوراثية للدكتور النموذجية وأظهرت لتمديد عمر في C. ايليجانس. ومع ذلك ، فإن العديد من الدراسات التي أعلن عنها في DR C. تم القيام به عن طريق الترويج ايليجانس الحيوانات السائل في وسائل الإعلام ، في حين تم القيام به معظم الدراسات الوراثية في مجال الشيخوخة على أجار الصلبة القياسية في لوحات بتري. هنا نقدم بروتوكول DR باستخدام معيار الصلبة NGM آغار المستندة وحة مع البكتيريا قتل.

Watch this Scientific Journal Video about Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

هنا نطرح على بروتوكول لتنفيذ لوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; مع البكتيريا قتل.

اللوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في انواع معينة ايليجانس</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

16.5K Views.  University of Michigan. هنا نطرح على بروتوكول لتنفيذ لوحة الصلبة المستندة إلى تقييد الغذائية في C. ايليجانس مع البكتيريا قتل.

Video: Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

قياس انواع معينة ايليجانس سبان الحياة على وسائل الاعلام الصلبة

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

مكملات غذائية من الأحماض الدهنية غير المشبعة في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

قياس معدلات استهلاك الأوكسجين في سليمة ايليجانس كاينورهابديتيس

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

قياس الانخفاض البروتيني البروتيوستيكي الخاص بالأنسجة في إليجانات Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This increased attention has called for the diversification and improvement of animal models capable of reproducing disease phenotypes observed in humans with PCDs. Though murine models have proven invaluable, they are expensive and are associated with laborious, low-throughput methods. Use of the Caenorhabditis elegans nematode model to study PCDs has been justified by its relative ease of maintenance, low cost, and rapid generation time, which allow for high-throughput applications. Additionally, high conservation between the C. elegans and human genomes makes this model an invaluable discovery tool. Nematodes that express fluorescently tagged tissue-specific polyglutamine (polyQ) tracts exhibit age- and polyQ length-dependent aggregation characterized by fluorescent foci. Such reporters are often employed as proxies to monitor changes in proteostasis across tissues. Manual aggregate quantification is time-consuming, limiting experimental throughput. Furthermore, manual foci quantification can introduce bias, as aggregate identification can be highly subjective. Herein, a protocol consisting of worm culturing, image acquisition, and data processing was standardized to support high-throughput aggregate quantification using C. elegans that express intestine-specific polyQ. By implementing a C. elegans-based image processing pipeline using CellProfiler, an image analysis software, this method has been optimized to separate and identify individual worms and enumerate their respective aggregates. Though the concept of automation is not entirely unique, the need to standardize such procedures for reproducibility, elimination of bias from manual counting, and increase throughput is high. It is anticipated that these methods can drastically simplify the screening process of large bacterial, genomic, or drug libraries using the C. elegans model.

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

The following protocol describes the development and optimization of a high-throughput workflow for worm culturing, fluorescence imaging, and automated image processing to quantify polyglutamine aggregates as an assessment of changes in proteostasis.

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...