这项工作是支持到A - LH从弥敦道冲击中心（P30 AG13283）和授予R01（R01 AG028516）从国家老化研究所（NIA）的试点奖

<html> 1。细菌浓度的估计建立校准曲线本节描述为任何给定的菌种（如OP50，HT115），将作为食物来源C.限制饮食实验使用细菌浓度的估算方法线虫 。每一株用于细菌，应建立单独的校准曲线。 <ol><li>接种单菌落的E.大肠杆菌 OP50细菌捡到3毫升的液体LB培养基中的细菌从一个新鲜的LB琼脂连胜。 </li><li>广场OP50文化在37℃摇床，并允许细菌的生长过夜。 </li><li>准备从过夜培养的菌悬液的序列的2倍稀释（2X，4X，8X，16X，32X）。 </li><li>一式三份分光光度计在600 nm测量吸光度（光密度），每个稀释度。 </li><li>进一步淡化每个菌悬液百万倍（两次稀释1000倍）。 </li><li>传播0.4毫升细菌悬浮液，每个稀释度100毫米的LB琼脂平板上均匀地。 </li><li> OP50在37℃培养箱中培养18-24小时发生的LB平板。 </li><li>计数每盘上生长的细菌菌落的数量。用于计算每个样本菌落计数每毫升CFU（菌落形成单位）。 </li><li>测OD 600值和OP50细菌浓度之间的关系可以建立绘制外径 600细菌浓度（CFU / ml为）的功能，并执行线性回归分析（图1）。 </li></ol>解决方案： <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">卢里亚肉汤（LB），1L： </td></tr><tr><td > 10克</td><td>细菌用的蛋白胨</td></tr><tr><td> 5克</td><td>酵母提取物</td></tr><tr><td> 10克</td><td>氯化钠</td></tr></tbody></table>加入去离子水至1L。 高压灭菌器，并在室温下储存。 2。固体板为主的饮食限制（SDR）板的制备本节介绍了编制固体板为主的饮食限制（SDR）的实验中使用的板材。通常情况下，我们认为细菌浓度为1 × 10 11 CFU / ml为自由采食的饲养条件和1 × 10 8 CFU / ml为最优的DR这种方法喂养的条件。然而，4-6浓度不同的细菌，可能需要建立一个完整的剂量依赖关系，SDR和它的响应。 <ol><li>接种单菌落的E. 3毫升液体LB培养基中的大肠杆菌OP50细菌。 </li><li>放置在37℃摇床OP50文化，使细菌的生长为6-8小时。 </li><li> OP50文化转移到一个新的烧瓶中含500 mL LB培养基中，放置在37℃摇床OP50文化过夜。 </li><li>测量外径600 OP50文化，以确定细菌浓度（使用第1部分中所产生的校准曲线的浓度计算） 。吸光度的准确测量，可能需要适当稀释。 </li><li>佩莱OP50细菌离心20分钟，在1500克。 </li><li>浓度1 × 10 12 CFU / ml为重悬细菌。 </li><li>准备在6个不同浓度10毫升细菌文化：1 × 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 CFU /毫升。 </li><li>加入0.2 mL的细菌培养成一个60毫米的中心凝固NGM的板块。避免接触枪头板的表面，表面上的刻痕允许进入琼脂平板蠕虫洞穴。 </li><li> 1小时37 °彗星孵化器板。 </li><li>将10μL的100mg/mL羧和10μL50mg/mL卡那霉素，每块板，以阻止细菌的生长。 </li><li>商店板与不同浓度抗生素杀害细菌在4 ° C以供将来使用（一个月）。重要的是整个计划实验的准备和储存足够板提前至少1-2天。使用同一批次的整个实验板是可取的。 </li><li>要验证的细菌的生存能力，刮去一些细菌的SDR板和传播与羧苄青霉素和卡那霉素的空NGM板。板放置在37 °彗星孵化器为6-8小时，然后检查细菌的生长（无细菌生长，应遵守）。 </li></ol>解决方案<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2">线虫的生长介质（NGM），1L： </td></tr><tr><td > 3摹</td><td>氯化钠</td></tr><tr><td> 2.5摹</td><td>细菌用的蛋白胨</td></tr><tr><td> 20克</td><td>洋菜</td></tr></tbody></table>ove_content“&gt;高压灭菌40分钟，放凉至65 ° C，然后添加： <table border="1"><tbody><tr><td > 1毫升</td><td> 1个M硫酸镁4 </td></tr><tr><td> 1毫升</td><td> 1个M氯化钙2 </td></tr><tr><td> 1毫升</td><td> 5 mg / mL的胆固醇</td></tr><tr><td> 25毫升</td><td> 1M磷酸钾，pH值6.0 </td></tr></tbody></table>立即倾注到60毫米× 15毫米培养皿在10毫升分装液体NGM 3。设置SDR实验对于大多数的SDR相关的研究，如寿命分析和生育率分析，一个时代同步的蠕虫病毒的人口的准备，是至关重要的。对于其他研究中，简单地转移从一个普通的OP50板的蠕虫SDR板开始限制饮食。在本节中，设立SDR动物寿命分析的协议被描述为一个例子。 <ol><li>使用铂金蠕虫选择器转移OP50 20-30繁殖到几个经常NGM的板块活跃的成年人。根据实验所需的鸡蛋的数量，需要更多的成年人可能。 </li><li>离开板块在20 ° C为4个小时，让产蛋。 </li><li>从盘子中取出的成年人。板材应目视检查鸡蛋。 </li><li>离开板块在20℃，让后代发展成Late-L4/day 1成人阶段。通常，这需要3天时间为N2野生型蠕虫病毒在20 ° C。 </li><li> SDR板转移到适当数量的第1天成人开始限制饮食。 </li><li>寿命分析，建立了6-8板，每盘10-20蠕虫每个SDR条件。 </li><li>分数每个蠕虫的生存能力，每2天，直到所有的蠕虫已经死亡。至关重要的是，蠕虫病毒被转移到新鲜SDR板，每12-48小时，以避免食物完全剥夺。 </li></ol> 4。代表性的成果： 在图1所示是一个外径600 OP50在浓度估计为代表的校准曲线图。通过线性回归分析方程，可用于未来OP50细菌浓度计算。在图2所示是化验慢性SDR治疗效果上不同的蠕虫病毒株的平均寿命的一个例子。蓝线代表正常的野生型蠕虫特别提款权的剂量依赖性反应。红线表示，部分由DRR - 2 OE抑制SDR寿命的影响，而DAF - 16（mu86）并没有对SDR -诱导寿命延长的效果。执行C.寿命分析的详细方法线虫是在以往的文献1-3。 <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="图1" /> 代表性的结果为E 的估计校准曲线图1。 大肠杆菌 OP50浓度。 OP50浓度绘制测OD 600值的函数。误差棒= 1.5X，2X，4X，8X，16X，32X的SD隔夜细菌培养前测吸光度稀释，CFU测量前进一步稀释1000倍的两倍。 <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="图2" /> 图2 A C.代表性的结果。 线虫寿命的实验比较野生型N2动物（蓝色）特别提款权（青等。图4）与两个不同突变（绿色和红色）。误差线=扫描电镜

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	<li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor.">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li><li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans.">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li><li>Ching, T. 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H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHA-4/Foxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans.">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li><li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li><li>Kaeberlein, T. 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饮食限制（DR）是已知的，以增加寿命和延迟在广泛的物种，包括哺乳动物5-7中各种与年龄有关的的疾病的发病。已用于环境和遗传操作模式在 C DR 线虫，包括在定义一个半液体介质中8,9，稀释10-12日在液体介质中的细菌的食物来源和使用行为的突变体，饲料以较慢的速率13培养蠕虫。然而，DR的遗传模拟可能产生的表型无关的DR，而在液体培养基中培?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 试剂名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td><td> 评论 </td></tr><tr><td>羧</td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td>溶于水。 </td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>罗氏公司</td><td> 10106801001 </td><td>溶于水。 </td></tr><tr><td>细菌用的蛋白胨</td><td>流式细胞，Dickinson公司</td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td>细菌用的蛋白胨</td><td>流式细胞，Dickinson公司</td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td>细菌用的酵母提取物</td><td>流式细胞，Dickinson公司</td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td>洋菜</td><td>流式细胞，Dickinson公司</td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td>无菌培养管</td><td>美国科学</td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td> Amersham公司生物科学</td><td>基因定量亲</td><td> Amersham公司是通用电气医疗集团的一部分。 </td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>蔡司</td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td>离心分离</td><td> Beckman Coulter公司</td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

solid plate-based dietary restriction in caenorhabditis elegans

没有营养不良或饥饿，减少食物的摄入，增加寿命和延迟发病的各种与年龄有关的疾病，在广泛的物种，包括哺乳动物。这也导致在体重和生育能力下降，以及血浆葡萄糖，胰岛素和IGF - 1在这些动物的较低水平。这种治疗方法通常被称为饮食限制（DR）或热量限制（CR）。 线虫已经成为一个重要的模式生物，研究衰老的生物学。环境和遗传操作已被用于模型的DR，并已显示出在 C的寿命延长线虫 。但是，许多报道DR 在 C的研究线虫是通过在液体介质中传播的动物，而在老龄问题领域的遗传研究的最标准在固体琼脂培养皿板。在这里，我们目前使用标准的固体NGM杀害细菌的琼脂板DR的协议。

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Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

在这里，我们目前执行固体板为主的饮食限制在一个协议<em&gt; C。线虫</em&gt;与杀害细菌。

实心板为基础的饮食限制在线虫</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

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Biology

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

16.5K 次观看.  University of Michigan. 在这里，我们目前执行固体板为主的饮食限制在一个协议 C。线虫与杀害细菌。