استخدام هذا البروتوكول لإزالة الاختلاف بين العينات يمكن أن توفر رؤى في التنظيم التفاضلي للجزيئات الكبيرة على أساس الاختلافات داخل العينة بين مستويات مرنا والبروتين. استخدام نفس العينة لعزل الحمض النووي، والحمض النووي الريبي، والبروتين هو محاولة للحد من التباين، وتحسين القابلية للتكرار، وتسهيل التفسير. وتشمل الفوائد توفير الوقت والموارد في وقت جمع العينات وتحليل القطاعات المتعددة للعينات القيمة والمحدّد.
للبدء، بذور 1،000 دودة البيض في واحد 10 سم لوحة مع ظروف النمو المناسبة. احتضان في 20 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. ثم، غسل لوحة مع 5 ملليلتر من M9 العازلة ونقل 1،000 الديدان الكبار في أنبوب.
الطرد المركزي الديدان في 1، 000 غرام لمدة دقيقة واحدة، والتخلص من عظمى، ونقل الديدان بيليت، مع ملليلتر واحد من M9 العازلة، إلى أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 845 غرام لمدة دقيقة واحدة والتخلص من معظم من فوق. تخزين الديدان بيليه في ناقص 80 درجة مئوية لأكثر من أربع ساعات.
بعد ذلك، إزالة أي ناظر من بيليه المذاب. إضافة ملليلتر واحد من كاشف GTCP الباردة، مزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ووضع العينة على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من الكلوروفورم الباردة.
يهز الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، الطرد المركزي الأنبوب في 13، 500 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. مع ماصة صغيرة، نقل طبقة أعلى واضحة إلى أنبوب جديد RNase خالية من 1.5 ملليلتر جهاز طرد مركزي صغير.
نقل طبقة متداخلة بيضاء غائمة إلى أنبوب جديد المسمى B2 ونقل طبقة الوردي، من بيليه المتبقية، إلى أنبوب جديد المسمى B ووضع على حد سواء على الجليد. بوضوح فصل الطبقات الثلاث يمكن أن يكون صعبا. أوصي بنقل طبقة الطور البيني الغائمة إلى أنبوبها الخاص بدلاً من التعجيل بالحمض النووي من هذه الطبقة من الطبقة العضوية أو الطبقة الوردية.
لعزل الجيش الملكي النيبالي، أولا إضافة 500 ميكرولترات من 100٪ isopropanol إلى أنبوب A لتسريع الجيش الملكي النيبالي. ثم، احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، الطرد المركزي الأنبوب في 13، 500 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
المقبل، والتخلص من عظمى وإضافة ملليلتر واحد من 75٪ الإيثانول إلى أنبوب A لغسل بيليه. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 5، 300 غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المناط والسماح للهواء بيليه الجاف لمدة خمس إلى 10 دقائق.
إضافة 50 ميكرولترات من المياه الخالية من RNase لإعادة تشكيل بيليه من الجيش الملكي النيبالي واحتضان بيليه في 55 إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإذابته. وأخيراً، استخدم مقياس الطيف لقياس تركيز الحمض النووي الريبي المعزول عند 260 نانومتر ولتحديد أي شوائب عند 230 و280 نانومتر. لعزل الحمض النووي، أولا إضافة 300 ميكرولترات من 100٪ الإيثانول إلى المرحلة العضوية في أنبوب B وإلى طبقة بيضاء غائمة في أنبوب B2 لتسريع الحمض النووي، ومزيج عن طريق عكس وترك الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق.
ثم أنابيب الطرد المركزي B و B2 في 376 غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ل بيليه الحمض النووي. الجمع بين المابير من أنابيب B و B2 في أنبوب جديد ملليلتر المسمى C وتركها على الجليد لعزل البروتين اللاحقة. بعد ذلك، قم بغسل بيليه الحمض النووي في أنبوب B2 بميليلتر واحد من 0.1 سيترات الصوديوم الضرس في 10٪ الإيثانول لمدة 30 دقيقة.
أنبوب الطرد المركزي B2 عند 376 غ عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. كرر خطوة الغسيل ثم أعد تعليق البيليه في 1.5 ملليلتر من 75٪ الإيثانول واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك، أنبوب الطرد المركزي B2 في 376 غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ومن ثم التخلص من فائقة والسماح بيليه لتجف لمدة خمس إلى 10 دقائق.
قم بحل بيليه في 150 ميكرولترات من ثمانية ملليلتر هيدروكسيد الصوديوم. ثم، الطرد المركزي العينة في 376 غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. وأخيرا، مع micropipette، نقل فائقة تحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب جديد.
استخدم مقياس طيف لقياس تركيز الحمض النووي المعزول عند 260 نانومتر ولتحديد أي شوائب عند 230 و280 نانومتر. لتسريع البروتين، أولاً إضافة ما يصل إلى 1.5 ملليلتر من 100٪ isopropanol إلى فائقة الوردي في أنبوب C، مزيج عن طريق عكس عدة مرات، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم، أنبوب الطرد المركزي C في 13، 500 غرام في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
تخلص من السوبر واغسل البيليه بمليلترين من هيدروكلوريد 0.3 مولار غوانيدين في 95٪ من الإيثانول لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي الأنبوب مرة أخرى في 5, 300 ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وكرر خطوة الغسيل كما كان من قبل. نقل بيليه البروتين إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر المسمى C2 وإضافة ما يصل إلى 1.5 ملليلتر من 95٪ الإيثانول، دوامة، والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 5، 300 غرام في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل المابير واسمحوا بيليه الجافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم، حل بيليه في 300 ميكرولترات من 5٪ SDS في 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
وأخيرا، الطرد المركزي أنبوب في 13،500 غرام في 17 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ونقل المُنطَع الذي يحتوي على البروتين إلى أنبوب جديد. لإجراء النسخ العكسي الكمي PCR.
أولاً، استخدم نانوغرام واحد من الحمض النووي الريبي المعزول لإعداد cDNA عن طريق النسخ العكسي. لجعل لوحة الأسهم من cDNA، إضافة 100 ميكرولترات من واحد إلى 100 تخفيف من كل عينة cDNA إلى آبار فردية من لوحة 96 بئر، وتشمل الضوابط المناسبة، مثل آبار المياه فقط والعينات المخففة تسلسليا، لتحديد كفاءة التمهيدي لكل جين. لجعل مزيج رئيسي لكل مجموعة من التمهيديات، إضافة ما يصل إلى سبعة ميكرولترات من الماء، وصبغة السيانيد الحمض النووي بين السيانيد، وخمسة ضرس صغير كل من التمهيديات إلى الأمام وعكس.
أضف سبعة ميكروليترات من المزيج الرئيسي إلى الآبار المناسبة لصفيح RT-qPCR. ثم، إضافة ثلاثة microliters من cDNA من لوحة الأسهم وتشغيل لوحة باستخدام بروتوكول RT-qPCR مناسبة ل التمهيديات المستخدمة. تم إجراء تحليل RT-qPCR لمورناس معزولة من أربع عينات مستقلة من ثلاث سلالات دودة لتأكيد الأهداف التي تم تحديدها من قبل مقايسة RNA مقبِل.
تم رفع الجين F07C4.12 في كل من المقايسات في الديدان أكل-2، ولكن لم يتم الكشف عن رفع تنظيمها في الديدان rsks-1 من قبل المقايسة RT-qPCR. أيضا، تم تأكيد الحمض النووي الريبي seq التغيرات التعبير من mrp-1 في الديدان أكل-2 و rsks-1 عن طريق RT-qPCR. تم الكشف عن Upregulation أو أسفل تنظيم الجينات علامة العضية في الديدان متحولة أيضا من قبل تحليل RT-qPCR.
مقارنة GTCp مقابل البروتين المستخرج من RIPA في الديدان التي تفصلها صفحة SDS والملطخة باللون الأزرق coomassie أظهرت جودة مماثلة مع دقة أفضل من البروتينات الأكبر للبروتينات المستخرجة من GTCP. وأظهر تحليل البقعة الغربية مستويات مماثلة من البروتين في معظم الحالات؛ ومع ذلك، أظهرت البروتينات الأكبر من 75 كيلودالتون مستويات أقل في البروتين المستخرج من RIPA. وأظهرت المقارنة بين مستويات الحمض النووي الريبي (مرنا) المستهدفة والبروتين من أربع عينات فردية من ثلاث سلالات دودة وجود تباين منخفض في مستويات مرنا مع قدر أكبر من التقلبات على مستوى البروتين.
في سياق عزل الحمض النووي، تعتمد الغلة بشكل كبير على الكفاءة لاستعادة طبقة الطور البيني الغائم من الطبقة العضوية أو الوردية. لتحسين solubilization من البروتينات من بيليه زيادة حجم عازلة resolububilization أو إضافة المنظفات الأخرى إلى جانب SDS قد يكون من الضروري. يمكن أن يساعد استخدام هذه الطريقة في تحديد الحالات التي لا تكون فيها ترجمة مرنا إلى بروتينات أساسية بشكل صحيح ويمكن أن تؤدي إلى تحقيق أعمق في الآليات التنظيمية اللاحقة للترجمة في ظل ظروف مختلفة.
في مختبرنا، تم استخدام هذا البروتوكول للحفاظ على عينات أساسية زمنية قيّمة ومحدودة. وعلاوة على ذلك ، أستطيع أن أتخيل هذا سيكون بروتوكولا مفيدا لاعتماد في مجال إيقاع circadian. كاشف GCTP والمذيبات المستخدمة في عزل الحمض النووي الريبي هي مخاطر وينبغي استخدامها بحذر.
