وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (K22NS050137 لJCB).

1. خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم عزل الخلايا العصبية القشرية ونمت باستخدام تقنيات الموصوفة سابقا ومطلي على أطباق الثقافة مع قاع زجاج (شركة ماتيك ، آشلاند ، MA) مغلفة بولي - D - يسين وlaminin 1. </li></ol> 2. إعداد الحلول الأسهم للتحقيقات TMRM الفلورسنت وDCF H 2 - DA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون 10 ملم من TMRM بحل 5.0 ملغ من TMRM في 1 مل من dimethylsulfoxide اللامائية. دوامة لمدة 1 دقيقة. ثم ، وجعل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية ، وحماية من الضوء ، واستخدام غضون شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وإعداد محلول المخزون 10 ملم من H 2 - DA DCF عن طريق إذابة 4.87 ملغ من H 2 - DA DCF في 1 مل من DMSO اللامائية. وبالمثل ، فإنه لدوامة 1 دقيقة. ثم ، وجعل aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية ، وحماية من الضوء ، واستخدام غضون أسبوع واحد. </li></ol> 3. العصبونات القشرية مع الفئران تحميل TMRM وDCF H 2 - DA TMRM هو potentiometric ، الخلية المنفذة للمؤشر الفلورسنت التي تتراكم في الداخل سلبيا للغاية المكلف الميتوكوندريا. من المهم استخدام تركيزات منخفضة (10-50 نطاق نانومتر) من TMRM لتجنب تبريد السيارات من TMRM الميتوكوندريا. ثم ، يمكن الإشارة مضان من TMRM تكون مباشرة المشترك المتصلة ΔΨm عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية. وفقدان أسباب ΔΨm TMRM تسرب من الميتوكوندريا مما أدى إلى فقدان كثافة مضان. H 2 - DA DCF غير قابلة للاختراق الخلية المسبار تحويلها إلى DCF - DA esterases بواسطة الخلايا ، والنتائج أكسدة في DCF الفلورسنت. وينبغي اختبار النهائي للتركيز H 2 - DA DCF يتراوح ما بين 20-10 ميكرومتر وتجريبيا في الخلايا العصبية المتأتية من مناطق الدماغ المختلفة منذ تركيزات عالية تحميل قد يؤدي إلى تشبع مضان DCF حتى في حالة عدم وجود H 2 O 2. فإن وجود أي أكسدة داخلية أم خارجية (، مثل النيتريك أكسيد الهيدروجين بيروكسيد ،) DFC زيادة كثافة مضان. أدناه ، ونحن نقدم بروتوكول للتحميل العصبونات القشرية مع الفئران وTMRM H 2 - DA DCF. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل الخلايا العصبية الفئران القشرية مع TMRM ، أولا ، وغسل الخلايا العصبية مثقف 3 مرات مع العازلة Tyrode ل(تراكب النص : السل : 145 مم كلوريد الصوديوم ، 5 ملي بوكل ، 10 الجلوكوز ملم ، 1.5 ملم CaCl 2 ، 1 ملم MgCl 2 ، و 10 HEPES مم ؛ ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم). ثم ، وإعداد 20 نيوتن متر من TMRM بواسطة تمييع الأسهم TMRM 10 ملي 1 / 1000 في أوقات السل ثم إضافة 2 ميكرولتر من TMRM المخفض 1 مل من السل. احتضان مع الخلايا العصبية لمدة 45 دقيقة TMRM في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 دقيقة ، وتركيب الطبق الثقافة على مسرح المجهر وبدء التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل العصبونات القشرية الفئران مع H 2 DCF - DA ، وغسل الخلايا العصبية مثقف 3 مرات مع السل. المقبل ، وإعداد 2 من 2 ميكرومتر H - DA DCF بواسطة تمييع 10 مم H 2 - DA DCF الأسهم 10/01 مرات في السل وثم إضافة 2 ميكرولتر من المخففة H 2 - DA DCF في 1 مل من السل. ثم ، مع احتضان الخلايا العصبية 2 H - DA DCF لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. بعد 45 دقيقة ، وغسل الخلايا العصبية 4 مرات بالسل لإزالة الزائدة مؤشر الفلورسنت قبل الحصول على الصور. </li></ol> 4. يعيش التصوير من الخلايا العصبية مع TMRM المحتضنة لتحديد ΔΨm <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء التصوير العيش من الخلايا العصبية المحتضنة مع TMRM ، مبائر المجهري المسح بواسطة أشعة الليزر (تراكب النص : LSM 510 ، كارل زايس شركة) ، وذلك مع تطبيق برنامج زمني سلسلة حية ، يستخدم. تطبيق منخفضة الدقة والموهنة ليزر الطاقة (تراكب النص : دقة منخفضة : 256 × 256 ؛ الليزر الطاقة : 1 ٪) لتقليل الوقت اللازم للحصول على صور وتجنب photobleaching. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> . المقبل ، وضبط التركيز في الخلايا العصبية التي شنت محملة TMRM باستخدام الضوء المنعكس. فحص مضان TMRM الإضاءة في 514 نانومتر ، والكشف على 570 نانومتر. تعيين كسب الكشف عن الكاميرا فقط دون مستوى التشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة والتي تشمل جميع المعلمات القرار ، وقوة الليزر ، والحصول على الكشف عن الكاميرا ، والفاصل الزمني الفاصل بين الحصول على صور يتم تعيين ؛ لا تغيير هذه الإعدادات بين التجارب. المقبل ، وتغير هذا المجال. البدء في جمع الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار التغيرات في ΔΨm ، يمكن تطبيق المنبهات مثل 1 ميكرومتر من FCCP أو 2 ميكروغرام / مل من oligomycin ، والتي سوف يزيل الاستقطاب بشكل كبير أو hyperpolarize إمكانات غشاء الميتوكوندريا ، على التوالي. وسوف تنعكس هذه التغيرات نقصان في كثافة مضان TMRM بالمقارنة مع كثافة مضان الأساس في حالة FCCP ، أو زيادة في شدة TMRM مضان في حالة oligomycin. </li></ol> 5. يعيش التصوير من الخلايا العصبية المحتضنة مع DCF 2 H - DA لتحديد ريوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء التصوير العيش من الخلايا العصبية المحتضنة مع H 2 DCF - DA ، أولا ، تركيب الطبق الثقافة على مسرح المجهر. ضبط التركيز من الخلايا لناجي ينعكس الضوء. دراسة DCF مضان بواسطة الإثارة في 488 نانومتر ، والانبعاث في 515 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل ، وضبط قوة الليزر إلى 5-7 ٪ ، والحصول على كشف ، والقرار 256 × 256. لا تغيير هذه الإعدادات بين التجارب. ثم ، تعيين الترددات للحصول على صور حية باستخدام برنامج السلسلة الزمنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الحقل الجديد والبدء في الحصول على الصور. للكشف عن تغيرات في مستويات ريوس ، وعلاج الخلايا مع 100-200 ميكرومتر من H 2 O 2. وسوف ينعكس ذلك زيادة في كثافة مضان DCF مقارنة مع مستوى خط الأساس. </li></ol> 6. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المنطقة لمصلحة (تراكب النص : ROI) أداة من برنامج LSM لتحديد المجالات. ثم ، وقياس كثافة أو TMRM ريوس مضان. حدد من مناطق رويس رويس الميتوكوندريا أو من خلايا الجسم كله في الخلايا المصورة لقياس كثافة مضان من TMRM أو ريوس ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​كثافة مضان من جميع رويس كل خلية لTMRM أو من الهيئات خلية كاملة لجميع الخلايا المصورة للروس من أجل كل نقطة زمنية. حدد المناطق المجاورة للخلايا لحساب كثافة مضان الخلفية. أخذ قياسات عديدة ، وحساب متوسط ​​كثافة الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح مضان الخلفية متوسط ​​كثافة من كثافة مضان متوسط ​​رويس في كل خلية لكل نقطة زمنية باستخدام Microsoft Excel. بعد طرح كثافة الخلفية ، تطبيع كثافة TMRM أو DCF مضان إلى مضان الأساس باستخدام هذه الصيغة (تراكب النص : ΔF FF = س / س س F 100 ، حيث F = كثافة مضان في أي نقطة زمنية ، للحصول على خط الأساس مضان =). ثم ، استخدم قطعة سيغما برنامج لتوليد المؤامرة تبين التغيرات في كثافة مضان على مر الزمن. </li></ol> 7. ممثل النتائج ويبين الشكل 1A صورة مضان من العصبونات القشرية الفئران مع TMRM المحتضنة. إضافة FCCP ، وهو uncoupler الميتوكوندريا ، يؤدي إلى الاستقطاب الميتوكوندريا وفقدان كثافة مضان TMRM (الشكل 1B). ومضان TMRM مستوى خط الأساس لا يزال مستقرا قبل إضافة FCCP (أول 350 ثانية ؛. الشكل 1C). التحليل الكمي للتغيرات مضان TMRM بمرور الوقت أن هناك انخفاضا كبيرا في مضان TMRM بعد إضافة FCCP (الشكل 1C). 1D الرقم يدل على صورة مضان من الخلايا العصبية الفئران القشرية محملة DCF. بالإضافة إلى ذلك زادت من 2 نتائج H 2 O في DCF كثافة مضان في الهيئات الخلية (الشكل 1E). مستوى خط الأساس لم يتغير مضان DCF (أول 120 ثانية) قبل تطبيق H 2 O 2. الوقت الفاصل بين قياسات مضان DCF تظهر مستوياته ثابتة ، مما يزيد من العلاج بعد 2 H 2 O (الشكل 1F). <img src="/files/ftp_upload/2704/2704fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات ريوس الخلايا العصبية في الفئران الحية القشرية. (أ) صورة الممثل مضان من العصبونات القشرية محملة TMRM. بعد المسح الأساس TMRM مضان ، تم علاج الخلايا العصبية مع FCCP protonophore (1 ميكرومتر). إلى اليمين هو شريط من شدة pseudocolor مضان TMRM مع أقصى مشرق الأصفر والأسود تمثل الحد الأدنى من وحدتها ، على التوالي. فقدان مضان TMRM من المناطق الميتوكوندريا يشير إلى انهيار ΔΨm على العلاج FCCP (لوحة باء). تمثيل كمية التغير في كثافة TMRM مضان في نقاط زمنية مختلفة قبل وبعد العلاج FCCP يظهر في لوحة جيم (د) صورة من الخلايا العصبية الفئران الإسفار القشرية محملة H2DCF - DA. بعد تحديد خط الأساس DCF مضان ، تم علاج الخلايا مع 200 ميكرومتر H 2 O 2 ، وجرى تقييم التغيير في مضان DCF. زيادة في مضان DCF تعكس الزيادة في مستويات ريوس على العلاج 2 H 2 O (E). ويظهر التحليل الكمي للتغيير في مضان DCF ، قبل وبعد العلاج 2 H 2 O ، في شريط لوحة مقياس واو = 10 ميكرومتر Video.7.1 -- labmedia 2704_Joshi.avi يعيش التصوير خلية من الخلايا العصبية في TMRM القشرية قبل وبعد اضافة الهدف باستخدام FCCP 40X. كثافة pseudocolor يظهر الحد الأقصى (أصفر مشرق ، وذلك قبل إضافة FCCP) وانخفاض (اللون الأحمر ، وبعد إضافة FCCP) TMRM كثافة مضان بعد إضافة FCCP. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video1.avi">انقر هنا لمشاهدة الفيديو</a> الفيديو. 7.5 -- labmedia 2704_Joshi.avi يعيش التصوير خلية من الخلايا العصبية في DCF القشرية قبل وبعد إضافة 2 H 2 O باستخدام الهدف 40X. الأساس DCF ومضان أخضر فاتح اللون في أجسام الخلايا ويزيد من H2O2 بالإضافة العاصمةF كثافة مضان إلى اللون الأخضر الساطع. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2704/supplemental_video2.avi">انقر هنا لمشاهدة الفيديو</a>

<ol>
	<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures.">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J. Vis. Exp. , (2007).</li><li>Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+using+fluorescent+rhodamine+derivatives.">Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives.</a> Biophys. J. 76, 469-477 (1999).</li><li>Ward, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+(AICD)+disrupts+actin+dynamics+and+mitochondrial+bioenergetics.">The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) disrupts actin dynamics and mitochondrial bioenergetics.</a> J. Neurochem. 113, 275-284 (2010).</li><li>Gunasekar, P. G., Kanthasamy, A. G., Borowitz, J. L., Isom, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+activation+produces+concurrent+generation+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species:+implication+for+cell+death.">NMDA receptor activation produces concurrent generation of nitric oxide and reactive oxygen species: implication for cell death.</a> J. Neurochem. 65, 2016-2021 (1995).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدمنا ​​إجراء خطوة بخطوة يصف كيفية تحديد ΔΨm وريوس في العصبونات القشرية الفئران باستخدام المؤشرات TMRM الفلورسنت وDCF H 2 - DA ، على التوالي. لأنواع الخلايا الأخرى ، فمن المهم تحديد تجريبيا تركيز النهائي والوقت لتحميل TMRM أو H 2 - DA DCF. بوجه عام ، تتراوح التركيزات TMRM 2-20 نانومتر ، وفترة حضانة الخلية يختلف مع TMRM 20-60 دقيقة. تركيز النهائي من H 2 - DA DCF يتراوح 2-10 ميكرون ، وحضانة الخلايا في محلول يحتوي على تحميل هذا المؤشر يختلف 30-45 دقيقة. من المهم لتحسين قوة الليزر وسرعة مسح أخذ الصور لتجنب كل الصور سمية للخلايا والتغيرات في كثافة مضان (على سبيل المثال من الخفقان مضان TMRM) في غياب أي حافز. وينبغي ضبط الأمثل الضوئية نتيجة في إشارة مضان التي لم تنته أو تحت المشبعة (العتبة) في غياب التحفيز. تتحقق الظروف المثلى لجمع الصور من حقل محدد في السلطة ليزر خاص وسرعة الفحص عندما تكون هناك أي تغييرات في كثافة مضان لجنة التحقيق في ظل غياب أي حافز لمدة 10-15 دقيقة من التصوير الحي. مضان تحقيقات أخرى لتحديد ΔΨm رودامين تشمل 123 ورباعي إيثيل الميثيل رودامين استر (TMRE). ومع ذلك ، تم العثور عليها لكبح عمليات التنفس في 2 الميتوكوندريا المعزولة. الأهم من ذلك ، TMRM له أي تأثير على التنفس الميتوكوندريا في تركيزات منخفضة (2) ولقد الضيائية منخفضة وphotobleaching 3 بالمقارنة مع تحقيقات أخرى. H 2 - DA DCF يعد مؤشرا جيدا لريوس كما يتم الاحتفاظ جيدا في الخلايا ، ويعترف للأكسدة أنواع عدة ، مثل البيروكسيدات ، وأكاسيد فائقة ، وأكسيد النيتريك 4.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> طبق زجاج أسفل الثقافة </td><td> شركة ماتيك </td><td> P35G - 1.5 - 14 - C </td></tr><tr><td> NbActive4 </td><td> BrainBits </td><td> NbActive4 </td></tr><tr><td> TMRM </td><td> Invitrogen </td><td> T668 </td></tr><tr><td> H 2 DCF - DA </td><td> Invitrogen </td><td> C400 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S6191 </td></tr><tr><td> بوكل </td><td> سيغما </td><td> P3911 </td></tr><tr><td> CaCl 2 • 2H 2 O </td><td> سيغما </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> MgCl 2 • 6H 2 O </td><td> سيغما </td><td> M2670 </td></tr><tr><td> D - غلوكوز </td><td> سيغما </td><td> G6152 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td></tr></tbody></table>

determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons

غشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨm) أمر حاسم للحفاظ على وظيفة فسيولوجية من السلسلة التنفسية لتوليد ATP. خسارة كبيرة من الخلايا المنضب ΔΨm يجعل من الطاقة مع الموت لاحقة. أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) مهمة جزيئات الإشارة ، ولكن تراكمها في ظروف مرضية تؤدي الى الاكسدة. مصادر الرئيسيتين لريوس في الخلايا هي السموم البيئية وعملية الفسفرة المؤكسدة. وقد تسببت ضعف الميتوكوندريا والاكسدة في الفيزيولوجيا المرضية لكثير من الأمراض ، وبالتالي ، فإن القدرة على تحديد وΔΨm ريوس يمكن أن توفر مؤشرات مهمة عن حالة الفسيولوجية للخلية وظيفة من وظائف الميتوكوندريا. ويمكن استخدام عدة تحقيقات فلوري (رودامين 123 ، TMRM ، TMRE ، JC - 1) لتحديد Δψm في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، وكثير من المؤشرات مضان (Dihydroethidium ، Dihydrorhodamine 123 ، H 2 DCF - DA) يمكن استخدامها لتحديد ريوس . ما يقرب من جميع التحقيقات مضان المتاحة المستخدمة لتقييم ΔΨm أو ريوس واحد الطول الموجي المؤشرات ، التي تزيد أو تنقص حدتها مضان النسبي إلى أن التحفيز الزيادة أو النقصان في مستويات ΔΨm أو ريوس. وهكذا ، فإنه لا بد من قياس كثافة مضان هذه التحقيقات على مستوى خط الأساس وبعد تطبيق حافز معين. هذا يسمح احد لتحديد النسبة المئوية للتغيير في كثافة مضان بين مستوى خط الأساس والحافز. هذا التغيير في كثافة مضان يعكس التغير في المستويات النسبية للΔΨm أو ريوس. في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية الفئران لتحديد النسبة المئوية للتغير في كثافة مضان TMRM بين مستوى خط الأساس وبعد تطبيق FCCP ، وهو uncoupler الميتوكوندريا. انخفاض مستويات TMRM مضان الناتجة عن المعالجة FCCP تعكس الاستقطاب من إمكانات غشاء الميتوكوندريا. علينا أن نبين كيفية تطبيق مضان التحقيق H 2 - DA DCF لتقييم مستوى ريوس في الخلايا العصبية القشرية ، أولا في الأساس ثم بعد تطبيق H 2 O 2. يمكن أن يكون هذا البروتوكول (مع تعديلات طفيفة) تستخدم أيضا لتحديد التغيرات في ΔΨm وريوس في أنواع مختلفة من الخلايا والخلايا العصبية في المناطق المعزولة من الدماغ الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons at JoVE.com

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

نظهر تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية لتحديد التغيرات النسبية في كثافة مضان TMRM قبل وبعد تطبيق حافز معين. نعرض أيضا تطبيق H التحقيق مضان<sub&gt; 2</sub&gt; DCF - DA تقييم المستوى النسبي لأنواع الاكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية.

تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

determination-mitochondrial-membrane-potential-reactive-oxygen

Research

JoVE Journal

Neuroscience

64.7K Views.  Loyola University Chicago. نظهر تطبيق مؤشر مضان ، TMRM ، في العصبونات القشرية لتحديد التغيرات النسبية في كثافة مضان TMRM قبل وبعد تطبيق حافز معين. نعرض أيضا تطبيق H التحقيق مضان 2 DCF - DA تقييم المستوى النسبي لأنواع الاكسجين التفاعلية في العصبونات القشرية.

Video: Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

تعديل العمليات العصبية والنقل الميتوكوندريا : تصوير مباشر في الخلايا العصبية الحصين خلال فترات طويلة

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or co-culture model. This system is suitable for a variety of experimental needs requiring either a glass or plastic growth substrate and can also be used for culture of other types of neurons.
Rat cortical neurons obtained from the late embryonic stage (E17) are plated on glass coverslips or tissue culture dishes facing a feeder layer of glia grown on dishes or plastic coverslips (known as Thermanox), respectively. The choice between the two configurations depends on the specific experimental technique used, which may require, or not, that neurons are grown on glass (e.g. calcium imaging versus Western blot). The glial feeder layer, an astroglia-enriched secondary culture of mixed glia, is separately prepared from the cortices of newborn rat pups (P2-4) prior to the neuronal dissection.
A major advantage of this culture system as compared to a culture of neurons only is the support of neuronal growth, survival, and differentiation provided by trophic factors secreted from the glial feeder layer, which more accurately resembles the brain environment in vivo. Furthermore, the co-culture can be used to study neuronal-glial interactions1.
At the same time, glia contamination in the neuronal layer is prevented by different means (low density culture, addition of mitotic inhibitors, lack of serum and use of optimized culture medium) leading to a virtually pure neuronal layer, comparable to other established methods1-3. Neurons can be easily separated from the glial layer at any time during culture and used for different experimental applications ranging from electrophysiology4, cellular and molecular biology5-8, biochemistry5, imaging and microscopy4,6,7,9,10. The primary neurons extend axons and dendrites to form functional synapses11, a process which is not observed in neuronal cell lines, although some cell lines do extend processes.
A detailed protocol of culturing rat hippocampal neurons using this co-culture system has been described previously4,12,13. Here we detail a modified protocol suited for cortical neurons. As approximately 20x106 cells are recovered from each rat embryo, this method is particularly useful for experiments requiring large numbers of neurons (but not concerned about a highly homogenous neuronal population). The preparation of neurons and glia needs to be planned in a time-specific manner. We will provide the step-by-step protocol for culturing rat cortical neurons as well as culturing glial cells to support the neurons.

Here we provide a protocol for culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer. The cultured neurons establish polarity and create synapses, and can be separated from the glia for use in various applications, such as electrophysiology, calcium imaging, cell survival assays, immunocytochemistry, and RNA/DNA/protein isolation.

ثنائي الصفائح المشارك ثقافة الجرذ الخلايا العصبية الابتدائية القشرية والدبقية

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Stimulus-specific Cortical Visual Evoked Potential Morphological Patterns

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using 128-channel high-density electroencephalography (EEG). The specific aim of the described stimuli and analyses is to examine whether it is feasible to replicate previously reported CVEP morphological patterns elicited by an apparent motion stimulus, designed to simultaneously stimulate both ventral and dorsal central visual networks, using object and motion stimuli designed to separately stimulate ventral and dorsal visual cortical networks.&#160; Four visual paradigms are presented: 1. Randomized visual objects with consistent temporal presentation. 2. Randomized visual objects with inconsistent temporal presentation (or jitter).&#160; 3. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion without jitter.&#160; 4. Visual motion via a radial field of coherent central dot motion with jitter.&#160; These four paradigms are presented in a pseudo-randomized order for each participant.&#160; Jitter is introduced in order to view how possible anticipatory-related effects may affect the morphology of the object-onset and motion-onset CVEP response.&#160; EEG data analyses are described in detail, including steps of data exportation from and importation to signal processing platforms, bad channel identification&#160;and removal, artifact rejection, averaging, and categorization of average CVEP morphological pattern type based upon latency ranges of component peaks. Representative data show that the methodological approach is indeed sensitive in eliciting differential object-onset and motion-onset CVEP morphological patterns and may, therefore, be useful in addressing the larger research aim. Given the high temporal resolution of EEG and the possible application of high-density EEG in source localization analyses, this protocol is ideal for the investigation of distinct CVEP morphological patterns and the underlying neural mechanisms which generate these differential responses.&#160; &#160; &#160;&#160;

In this paper, we present a protocol to investigate differential cortical visual evoked potential morphological patterns through stimulation of ventral and dorsal networks using high-density EEG. Visual object and motion stimulus paradigms, with and without temporal jitter, are described. Visual evoked potential morphological analyses are also outlined.&#160;&#160;

المحفزات الخاصة بالقشرية البصرية التي تثير الأنماط المورفولوجية المحتملة

This paper presents a methodology for the recording and analysis of cortical visual evoked potentials (CVEPs) in response to various visual stimuli using ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

جيل من المجالات العصبية من الخلايا العصبية خلية فرس النهر الأولية المختلطة والقشرية معزولة عن E14-E16 سبراغ دولي الفئران الجنين

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. In addition, photoreceptors also exhibit high aerobic glycolysis like cancer cells. Precise measurements of these metabolic activities can provide valuable insights into cellular homeostasis under physiological conditions and in disease states. High throughput microplate-based assays have been developed to measure mitochondrial respiration and various metabolic activities in live cells. However, a vast majority of these are developed for cultured cells and have not been optimized for intact tissue samples and for application ex vivo. Described here is a detailed step-by-step protocol, using microplate-based fluorescence technology, to directly measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration, as well as extracellular acidification rate (ECAR) as an indicator of glycolysis, in intact ex vivo retinal tissue. This method has been used to successfully assess metabolic activities in adult mouse retina and demonstrate its application in investigating cellular mechanisms of aging and disease.

Determination of Mitochondrial Respiration and Glycolysis in Ex Vivo Retinal Tissue Samples

Described here is a detailed protocol for performing mitochondrial stress assay and glycolytic rate assay in ex vivo retinal tissue samples using a commercial bioanalyzer.

تحديد التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في عينات الأنسجة الشبكية Ex Vivo

Mitochondrial respiration is a critical energy-generating pathway in all cells, especially retinal photoreceptors that possess a highly active metabolism. ...