يوفر هذا البروتوكول تحليلا في الوقت الفعلي لاثنين من المسارات الحيوية الرئيسية: التنفس الميتوكوندريا وتحلل الجليكوليسيس في أنسجة شبكية العين السابقة للفأرة السابقة التي تم تشريحها حديثا. وركز التحليل التقليدي لحصان البحر على الخلايا الأحادية الطبقات المستزرعة، في حين يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة نشاط الميتوكوندريا في الأنسجة التي تم تشريحها حديثا، وتحديدا شبكية العين. وتستخدم هذه التقنية لدراسة أنشطة الميتوكوندريا وأعلام انحلال الجليكوليسيس في شبكية العين من نماذج الماوس انحطاط الشبكية الموروثة.
وهو أداة مفيدة لأبحاث الشبكية ولديه أيضا إمكانية لتطبيقه على نوع آخر من الأنسجة لتطوير العلاجات المحتملة. الجزء الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول هو الحصول على أقراص لكمة عالية الجودة من شبكية العين الماوس تشريح حديثا، لذلك فمن المستحسن أن الفرد الذي سيؤدي هذه التقنية لديه مهارات تشريح شبكية العين جيدة. في اليوم السابق للتجربة، افتح كاسيت خرطوشة المستشعر وأضف ملليلتر واحد من وسيط المعايرة إلى كل بئر من لوحة المرافق.
احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة خالية من ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لتنشيط الفلوروفوريس. في يوم التجربة، وإعداد متوسطة المقايسة في الأدوية المركبة المخففة من المخزون. الاحماء المتوسطة المقايسة في حمام الماء 37 درجة مئوية.
إعداد برنامج الفحص على الجهاز كما هو موضح في المخطوطة النصية. افتح غطاء الكاسيت الذي يحتوي على إدراجات شبكية. Pipette ثمانية ميكرولترات من مزيج الطلاء إلى كل إدراج شبكة، ثم استخدام طرف ماصة لنشر بلطف قطرة حول لتوزيع مزيج الطلاء على قدم المساواة في جميع أنحاء إدراج شبكة.
أغلق الكاسيت واترك إدراج الشبكة يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة على الأقل للامتصاص. بعد الحضانة، اغسل إدراج الشبكة عن طريق أنابيب أربعة ملليلترات من وسيط المقايسة مباشرة على الإدراجات. هز بلطف كاسيت لضمان غسل جميع إدراج شبكة مع وسيطة المقايسة.
لإعداد لكمة الشبكية، واختزال العينين من فأر القتل الرحيم الكبار ووضعها في الجليد البارد PBS في طبق بيتري، ثم وضع طبق بيتري تحت المجهر تشريح. باستخدام الميكروسيستورات، وقطع العصب البصري، ثم إزالة بعناية عضلات خارج القولون تعلق خارج مقلة العين. باستخدام إبرة قياس 30، لكمة حفرة على حافة القرنية.
ثم استخدم microscissors تشريح غرامة لجعل قطع دائرية على طول حافة القرنية. باستخدام ملقط تشريح حاد ، قم بإزالة القرنية والعدسة والفكاهة الزجاجية من كأس العين. إجراء عدة تخفيضات صغيرة على طبقة الصلب في حافة كوب العين باستخدام microscissors تشريح غرامة.
استخدام اثنين من ملقط تشريح حادة للتمسك الأنسجة الصلبة في كل جانب وسحب على طبقة مشقوق بعناية فائقة لإزالته من شبكية العين العصبية. كرر هذا حول كوب العين حتى تتم إزالة جميع تصلب ويتم الحصول على كوب الشبكية سليمة. إجراء تخفيضات شعاعي على كأس الشبكية لتسطيح وتوليد عدة أقسام متميزة باستخدام microscissors تشريح.
بعد ذلك ، باستخدام جهاز لكم خزعة قطره ملليمتر واحد ، اقطع قرص شبكية واحد من كل قسم من كوب الشبكية المسطح. لكمة على مسافة متساوية من رأس العصب البصري. نقل إدراج شبكة المغلفة مسبقا في طبق بيتري تشريح باستخدام ملقط.
مع مساعدة من اثنين من فرش رمش فائقة غرامة، ووضع قرص لكمة الشبكية في وسط إدراج شبكة مع الجانب طبقة الخلية العقدة أسفل لمس شبكة وطبقة مستقبلات ضوئية تواجه ما يصل. لتحميل خرطوشة الاستشعار، أخرج كاسيت لوحة خرطوشة الاستشعار المرطب من حاضنة 37 درجة مئوية. بعد إزالة غطاء الداعم المائي، ضع خرطوشة المستشعر مرة أخرى على لوحة المرافق.
تحميل الحجم المطلوب من حلول مركب الحقن في المنافذ المناسبة عن طريق عقد تلميح ماصة في زاوية 45 درجة، وإدراج طرف ماصة في منتصف الطريق إلى منفذ الحقن مع شطبة من طرف ضد الجدار المقابل من منفذ الحقن. تحميل المركب برفق في كل منفذ. قم بتحميل خرطوشة المستشعر في الجهاز للمعايرة بالنقر فوق زر التشغيل لبدء تشغيل لفتح درج الجهاز.
ضع خرطوشة الاستشعار في الجهاز وانقر فوق أنا مستعد زر لبدء المعايرة. تحميل الحجم المطلوب من المتوسط المقايسة في كل بئر من لوحة التقاط الجزيرة. باستخدام ملقط، والاستيلاء على حافة إدراج شبكة تحتوي على أقراص لكمة الشبكية وأخذها من طبق بيتري.
اضغط بخفة على الجزء السفلي من إدراج شبكة على النسيج مسح امتصاص لإزالة السائل الإضافي ووضعها في بئر لوحة التقاط الجزيرة. كرر هذه الخطوة حتى يتم وضع جميع إدراج شبكة مع اللكمات الشبكية في لوحة التقاط الجزيرة ملء آبار تصحيح الخلفية والآبار الفارغة مع إدراج شبكة فارغة. باستخدام ملقطين Graefe، اضغط على حافة كل شبكة إدراج بعناية وبلطف، والتأكد من أن يتم إدراج هذه بأمان في الجزء السفلي من لوحة التقاط الجزيرة.
ضع صفيحة التقاط الجزر المحملة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للإحماء ، ثم أخرج لوحة المرافق بعد اكتمال المعايرة. استبداله مع لوحة التقاط الجزيرة التي تحتوي على اللكمات الشبكية واستئناف تشغيل المقايسة عن طريق النقر على زر لوحة الخلية تحميل. بعد اكتمال التشغيل، أخرج خرطوشة الاستشعار ولوحة التقاط الجزر التي تحتوي على لكمات شبكية العين عن طريق النقر على زر الإخراج، ثم انقر فوق الزر الذي تم حتى يتم حفظ البيانات تلقائيا كملف ASYR وتغيير الشاشة تلقائيا لعرض النتيجة.
تم إجراء فحص الإجهاد الميتوكوندريا الذي يظهر تتبع OCR ومقايسة معدل الجليكوليك التي تظهر كل من OCR وECAR تتبع باستخدام أقراص لكمة شبكية العين ملليمتر واحد تشريح حديثا. في اختبار الإجهاد الميتوكوندريا، تم حقن Bam15 لفك تدرج البروتون من إنتاج ATP الميتوكوندريا، مما أدى إلى زيادة OCR إلى أقصى مستوى. تم حقن روتينون وأنتيميسين A لمنع تنفس الميتوكوندريا في مجمع واحد وثلاثة معقدة على التوالي، مما أدى إلى انخفاض في OCR إلى الحد الأدنى.
يعكس الفرق بين المستوى الأقصى للتعرف الضوئي على الحروف والقياس الأخير لمستوى OCR القاعدي قدرة احتياطي الميتوكوندريا. في المقايسة معدل الجليكوليك، حقن الروتينون وأنتيميسين A يغلق التنفس الميتوكوندريا ويدفع تحلل أعلى. يتم ضبط تحلل الجليكوليسيس عن طريق حقن 2-deoxy-d-glucose، الذي ينافس الجلوكوز على ربط الهيكسوكيناز، مما يؤدي إلى انخفاض ECAR إلى الحد الأدنى.
الفرق بين المستوى الأقصى للجليكو ECAR في المقياس الأخير لمستوى الجليكو ECAR القاعدي يعكس قدرة احتياطي الجليكوليسيس. لإنتاج بيانات موثوقة، من الضروري الحصول على نوعية جيدة من أقراص لكمة الشبكية والحد من إجمالي وقت التشريح في غضون 1.5 ساعة. بعد التجربة، يمكن للمرء أن يحدد الحمض النووي لمحتوى البروتين من قرص الشبكية في بئر واستخدام ذلك لتطبيع بيانات حصان البحر.
لذلك تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة التنمية والشيخوخة والمرض في شبكية العين. كما تم تحليل تفضيل الأنسجة أو الاعتماد على ركائز الوقود المختلفة مثل الجلوكوز أو الأحماض الدهنية.
