1. مطحنة لتشغيل الكشف عن مدى اصابته في عضلة المجموعات ماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء زاوية السطح مفرغه لاستخدامها خلال بروتوكول قيد التشغيل. عموما ، وهو مستوى شقة أو زاوية ما بين 7 درجات و 15 DEGREES ° هبوطا أو صعودا يستخدم. بعض المطاحن في الجهاز وضبط جزء لا يتجزأ من الصعود بينما يحتاج البعض الآخر إلى أن تكون مرتفعة في حلقة مفرغة من خلال وسائل أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وسادة أو علبة زرقاء المختبر تحت مفرغه قبل وضع الحيوانات في حلقة مفرغة لجمع النفايات من أي حيوان خلال بروتوكول قيد التشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يكون قبل تشغيل تأقلم الفئران لبيئة المطحنه. هذا ينطوي على وضع الحيوانات في حلقة مفرغة لمدة 15 دقيقة مع شبكة الربط الكهربائي وإيقاف المحرك محرك حزام على حزام ولكن لا تتحرك (أي مع سرعة تعيين في 0 م / ث). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الشبكة الكهربائية المحفزة. يمكن عادة كثافة وتواتر النبضات المستخدمة يمكن السيطرة على المطاحن ولكن يختلف من مصنع واحد لآخر. عموما ، لا يلزم لتحفيز أقصى كثافة الفئران لتشغيل بينما تردد عال (على الأقل مرة كل ثانيتين) وتحسين الامتثال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل حزام مفرغه لبدء تشغيل البروتوكول. وينبغي أن تستخدم لسرعة الأولية من حوالي 5 متر / دقيقة لفترة الاحماء للفئران. ويمكن تسريع سرعة مفرغه ببطء ، وعادة بإضافة 1-2 متر / دقيقة عن كل دقيقة بعد بداية حلقة مفرغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحسين الامتثال للحيوانات في معظم البروتوكولات من خلال إجراء سلسلة من المديين القصير (5 دقائق) في سرعة الاحماء لمدة 3 إلى 10 أيام قبل أن يبدأ التشغيل التجريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرين الإرهاق الحاد سوف تنطوي عادة على زيادة سرعة مفرغه مع مرور الوقت حتى السرعة القصوى (عادة &lt;30 م / م) تحقيق والمحافظة عليها حتى الفئران تظهر علامات الإرهاق. معايير للحكم على استنفاد تختلف ولكنها تشمل عموما ماوس انفاق أكثر من نصف الوقت على الشبكة الكهربائية أو 5 ثوان على التوالي على الشبكة الكهربائية من دون العودة إلى السطح مفرغه. ويمكن بعد استنفاد ماوس الفردية يمكن إزالته من مفرغه ويمكن تسجيل الوقت الكلي للتشغيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تغيير زاوية مفرغه يمكن استخدامها في تجارب تشغيل الحادة لزيادة ممارسة تحميل (مع زاوية صعودا) أو للحث على انكماش غريب الأطوار الضارة (مع زاوية انحدار أ) التي تمزق الأغشية sarcolemmal من ألياف العضلات 1. يمكن حقن صبغة زرقاء ايفانز في الحيوانات قبل هذه الإجراءات لاستخدامها بوصفها صبغة النسيجي لتحديد الألياف العضلية التالفة 2،3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدريب على التحمل تشغيل بروتوكولات توفير تحميل ممارسة للحيوان على مدى فترة طويلة من الزمن (تصل إلى أشهر) من أجل إنتاج إعادة عرض للعضلات أو نظام القلب والأوعية الدموية. الاحماء الإجراء هو نفسه على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 1.5) إلا أن السرعة القصوى هي بشكل عام أقل وأوقات تشغيل يمكن طويلة جدا (&gt; 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أن تعاد بعد الانتهاء من تشغيل الفئران لأقفاصها. المطاحن تصبح عادة قذرة للغاية في حين أن الفئران التي تعمل بنظام التشغيل ، ولا سيما عبر بروتوكولات طويلة. فمن الضروري لتنظيف مطحنة ، وعادة مع رذاذ الايثانول 70 ٪ ، وبعد كل استخدام. </li></ol> 2. تحويلة فيفو الفحص القدرة إصلاح غشاء من ألياف العضلات المعزولة في أعقاب الأضرار التي ليزر الأشعة فوق البنفسجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح خارج الطبقة السطحية للعضلات المثنية (FDB) القصيرة من سفح الماوس. الأول ، وقطع الجلد من فتح الوحيد في خط الوسط مع الحرص على عدم تلف العضلات تحتها ، ثم جعل التخفيضات الأفقي وإزالة الجلد. ويمكن رؤية وتر العضلة بيضاء مسطحة FDB (وتر الدانية) تعلق على عظم العقبي. بصراحة منفصلة وتر بواسطة ملقط وقطع الوتر الى موقع قريب من المرفق ، والاستيلاء على وتر مجانا بواسطة ملقط واسحبه برفق حتى لفصل FDB من الأنسجة المحيطة بها ، بينما قطع أي الأنسجة الضامة التي لا تزال تعلق. عند رؤية فرع الأوتار البعيدة إلى الأرقام الفردية قد تكون إزالة FDB بقطع هذه الأوتار حيث وصل إلى أعمق طبقة من العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حزمة العضلات FDB في 1 مل من محلول كولاجيناز قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية في أنبوب 1.5 مل إيبندورف ، الشريط الأنبوب في اتجاه أفقي في المداري 37 درجة مئوية شاكر ويهز بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة 65 دقيقة. قد أوقات حضانة يتعين تعديلها لضمان الهضم كافية ، وهو ما أشار إليه مظهر شاحب اللون والمتوترة في العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية نقل حزمة FDB هضمها في أنبوب الطرد المركزي 1.5 ميكرولتر تحتوي ~ 600 ميكرولتر من 2.5 Tyrode + كا 2 عن طريق طرف ماصة 1 مل مع نهاية تقطع تلك التي يبلغ قطرها كافية للسماح لتمرير حزمة هضمها بسهولة من خلال دون انقطاع. الوجه بلطف أنبوب لتهز فضفاض من ألياف الحزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 30 ميكرولتر ماصة الحافة بحيث دiameter فقط أصغر قليلا من حزمة العضلات (بين 15 -- 20 ميكرون في القطر) استخدم لرسم pipettor برفق في حزمة ماصة ثم دفعها مرة أخرى إلى الحل. كرر هذه العملية حتى الأغلبية من الألياف وفصلها عن حزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج ألياف نأت بشكل جيد من خلال تحويل بلطف الأنبوب ، يأخذ المبلغ المطلوب وإسقاط على طبق زجاج القاع تي الدلتا. فإن حجم تحميل تختلف على أساس الكفاءة من العزلة وعدد من الألياف المفيدة التي هناك حاجة على طبق لوضع بروتوكول خاص. ويمكن تخزين الألياف المتبقية في الأنبوب عند 4 درجة مئوية لمدة 6 ساعات تقريبا لإجراء دراسات إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للطبق على الجلوس دون عائق لمدة 5 دقائق. هذا يسمح للألياف التمسك أسفل الزجاج للطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع صحن زجاج القاع على المجهري مبائر مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. مراقبة الألياف تحت المجهر في مرحلة التكبير&gt; 100X للتحقق من وجود نمط العتابي العادي وعلى التوالي ، ورود مثل الشكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة FM1 - 43 - 64 أو FM4 الأصباغ styrylpyridinium 4 إلى حل نهائي التركيز 2.5 ميكرومتر 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحث على الأضرار التي لحقت الموقف الألياف في إطار التصوير حتى الألياف موجه بزاوية 45 درجة من الأعلى الأيسر من مجال الرؤية إلى أسفل اليمين (الشكل 1). أشرق منطقة بكسل 5x5 (حوالي 0.9μmx0.9μm) من غشاء البلازما باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية (80 ميغاواط أو أكثر ، 351/364 نانومتر) لتعيين القوة القصوى لمدة 5 ثوان. وينبغي تقسيم المنطقة المشع غشاء البلازما ، أي أن نصف مربع 5x5 ينبغي داخل الألياف ، والباقي يجب أن تكون خارج الألياف (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور للدخول في صبغ الألياف على فترات كل 5 ثوان لمدة تصل إلى 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.8 لمدة لا تزيد على 3 في صحن الألياف ، كما سيتم في نهاية المطاف أن تكون صبغة الفلورسنت endocytosed في الألياف وتعقيد أي تحليل البيانات. وينبغي بعد 3 ألياف يتم إعداد طبق جديد من الخطوة 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل البيانات عن طريق حساب التغير في كثافة مضان (ΔF / F 0) بين كل إطار أسر لقياس كمية من دخول صباغة. وهذا يتطلب قياس مضان متوسط ​​مساحة حوالي 200 ميكرون 2 باستخدام برامج التحليل مثل ImageJ المتاحة علانية (http://rsbweb.nih.gov/ij/). للمقارنة بين الألياف ، ينبغي بذل الحساب التالي لكل الإطار : ΔF / F 0 ، حيث 0 هو F مضان يعني في المنطقة ذات الأهمية في الإطار الأول القبض على (ر = 0 ؛ قبل الإصابة) ، وغير ΔF التغيير في مضان من كل إطار لاحقة (FF 0). </li></ol> 3. خلية حية التصوير متحد البؤر لرصد عملية دينامية للإصلاح غشاء الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأدلى Micropipettes من الشعيرات الدموية PYREX. وضعت على شعري مجتذب micropipette وسحبت من قبل برنامج محدد سلفا (الحرارة = 695 ؛ سحب = 50 ؛.= فيل 55 ؛ الزمن = 250). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكان يعلق على Micropipette micromanipulator 3 (XYZ) المحور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والخلايا التي تحتوي على الحمض النووي transfected البلازميد باستخدام طرق طبيعية على طبق أسفل الزجاج تي الدلتا. وينبغي أن تنتقل إلى وسائل الإعلام 2.5mM كا 2 + Tyrode العازلة قبل بدء التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضعت الأطباق الزجاجية التي تحتوي على خلايا transfected على المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر مع 40X 1.3NA النفط الهدف الغمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم إجراء الحاد الخلية الحية الضرر عن طريق إدراج micropipette في غشاء الخلية وبسرعة ثم التراجع عن micropipette من أصل 3،6 الخلية. تم الحصول على صور متتالية خلية حية في الفترة الفاصلة من 1،54 ق / الإطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لفحص غشاء سابونين يسببها انقطاع ، سابونين 0.005 ٪ (سيغما) في 2.5mM كا 2 + كان perfused Tyrode العازلة من خلال نظام الجاذبية تدفق نضح مخصصة تجميعها 7. معدل نضح حوالي 1 مل / دقيقة ، وينبغي أن توضع غيض نضح مباشرة فوق الخلية التي يجري تصويرها. </li></ol> 4. ممثل النتائج : ويمكن إجراء الفيلم ممثل الماوس تشغيل مفرغه أثناء التصوير. الفيلم سوف توضح انخفاض قدرة تسيير mg53 / -- الفئران بسبب الأضرار التي لحقت الهيكل العظمي والعضلات. مدى الضرر الناجم عن بروتوكول أضرار الأشعة فوق البنفسجية ليزر المفصلة أعلاه يعتمد على قدرة إصلاح غشاء من الألياف تحليلها. وتتأثر هذه القدرة من خلال النمط الوراثي للفأرة الذي كان معزولا من الألياف ، والظروف خارج الخلية ، وأية تعديلات للتعبير البروتين (ترنسفكأيشن أو العدوى). وهناك نوع من الألياف الطبيعية البرية تسمح خفيف إلى معتدل دخول صبغ (الشكل 2A). ألياف العضلات ، المستمدة من / mg53 -- سوف الفئران مع خطر قدرة إصلاح غشاء عرض إدخال أكثر أهمية من الصبغة في الألياف (الشكل 2B). نتائج نموذجية لإصابة microelectrode إزفاء اظهار MG53 المحتوية vesiالجسيمات في موقع الإصابة. transfected 3A الرقم و3B - MG53 تظهر GFP C2C12 myotubes التي تضررت من micropipette الإدراج في غشاء الخلية. في الخلية قبل micropipette الضرر ، ويقع GFP - MG53 على غشاء البلازما على حد سواء والسيتوبلازم 3. بعد اختراق micropipette ، انتقلت GFP - MG53 الحويصلات التي تحتوي على نحو مواقع الضرر (كما يتبين من رأس السهم). الرقم يدل على 3C - MG53 GFP transfected C2C12 myoblasts تعامل مع 0.005 ٪ من سابونين ، والمنظفات التي يمكن أن permeabilize غشاء البلازما. عند معالجة سابونين ، GFP - MG53 translocated من العصارة الخلوية إلى غشاء الخلية. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> يسليدر ، وآخرون. الشكل 1. محاذاة الألياف وإصابة تعريف المنطقة. التوجه السليم للألياف العضلات في عزلة داخل مجال الرؤية وتحديد المنطقة أظهرت إصابة. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> يسليدر ، وآخرون. الشكل 2. الأشعة فوق البنفسجية الضرر الليزر صور FDB. تظهر الألياف الألياف قبل الإصابة (0 ثانية ، يسار) وإصابة آخر في 200 ثانية (يمين). ألياف من نوع ماوس البرية (أ) تبين اصابة طفيفة. ألياف من الفئران مع إصلاح غشاء خطر (ب) إتاحة المزيد من صبغ للدخول. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> يسليدر ، وآخرون. الشكل 3. وMicroelectrode سابونين تلف الخلايا المستزرعة. صور تظهر C2C12 myotubes (أ ، ب) وmyoblast C2C12 (ج) قبل الإصابة (أعلاه) وإصابة آخر (القاع). اصابة الخلايا مع microelectrode (أ ، ب) وتظهر MG53 إزفاء إلى مواقع الإصابة (السهام). خلايا تعامل مع سابونين (ج) تبين MG53 إزفاء إلى غشاء الخلية.

<ol>
	<li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle.">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence.">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53,+caveolin-3,+and+dysferlin.">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+of+ischemia/reperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair.">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li><li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice.">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice.">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li><li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

تشغيل مفرغه هي منهجية مفيدة في توفير تحميل ممارسة للحيوانات المعالجة. كمنهجية لقياس وظيفة العضلات أو القدرة على التحمل وهو نهج صاخبة المعروف أن من الصعب تنفيذ بطريقة استنساخه باستمرار 8. عموما ، يمكن استخدام مرات لاستنفاد باعتبارها نقطة النهاية لحسم الخلافات الرئيسية بين المجموعات التجريبية ، مثل تلك التي بين بعض خطوط الماوس خروج المغلوب والفئران البرية نوع 9. التلاعب التجريبية التي تنتج الفرق أكثر دهاء ، مثل بعض التجارب الدوائية ، قد لا حل الخلافات فوق الضوضاء المصاحبة لهذه التقنية. من أجل تحقيق أقصى قدر من استنساخ وحساسية هذه التقنيات من المهم للحفاظ على شروط الدورة إلى الدورة عن كثب. الوقت من اليوم تمارس هذه الحيوانات ، وكذلك الظروف حتى الفترة الحارة المستخدمة ، هي عوامل مهمة ويجب ان تبقى ثابتة من المحاكمة إلى محاكمة. يمكن أن الآثار سلالة يكون له أثر كبير على تصميم بروتوكولات مفرغه كما سلالات معينة من الفئران يمكن تشغيلها لفترة أكثر من ذلك بكثير في حلقة مفرغة من السلالات الأخرى ، وتستجيب بشكل مختلف لممارسة التحمل 10. كمبدأ عام ، فإن العديد من الفئران أن تكون قادرة على تشغيل 200-300 متر الإجمالي في دراسة استنفاد مع التزايد المستمر في سرعة مفرغه (5 م / م الأولية مع سرعة 1 م / م المضافة لكل دقيقة بعد بدء). قد لممارسة التحمل يمكن تشغيل الفئران بين 9-12 م / م لمدة 30 دقيقة 2 أو 3 مرات في الأسبوع. ومع ذلك ، فإن الدراسات الفردية وعادة ما يتطلب بعض التحسين على بروتوكول لمباراة تجريبية الاحتياجات الفردية. وقد تبين أن الإجراء أضرار الأشعة فوق البنفسجية الليزر ليكون وسيلة فعالة لقياس القدرة إصلاح غشاء من ألياف العضلات والهيكل العظمي 3،6،11. واحد عنصرا حيويا لنجاح هذه التجارب لاستخدام الألياف العضلية التي تعرض فقط ، ورود على شكل مستقيم مع ظهور نمط منتظم من التصدعات وغمد الليف العضلي الملساء التي لا تظهر التجاعيد. إذا يتم تحديد ألياف العضلات الأخرى قد يؤدي إلى تلف الغشاء يكون موجودا بالفعل في هذه الألياف وتفسير نتائج هذه التجارب قد تكون معقدة. من المهم أيضا أن تكون على النحو المحدد في اتجاه الألياف وتعريف المنطقة المشع في الشكل 1. هذا يوفر إصابة حجم استنساخه ، مما يسمح بالمقارنة بين الألياف. إذا كانت المنطقة التي تعرف تماما من الاصابة تقع داخل الألياف ، سيتم إنشاء إصابة داخلية بدلا من تعطيل غمد الليف العضلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن القيمة المحسوبة لΔF / F 0 حساس جدا في المنطقة ذات الاهتمام المحدد لقياس يعني مضان. تبلغ مساحتها حوالي 200μm 2 ، والمحاذية للموقع بما في ذلك الإصابات وغير مناسبة. على عكس المنطقة المحددة للإصابة ، يجب أن هذه المنطقة تقع بالكامل داخل الألياف. إذا قمت بتضمين الفضاء خارج الألياف ، فإن منطقة فارغة مما أدى زيادة ΔF / 0 F في الألياف مع إدخال الصبغة قليلا وفي الوقت نفسه تخفيض ΔF / 0 F في الألياف مع النمط الظاهري أكثر شدة. هذا يقلل من حساسية الفحص ، مما يجعل المقارنة بين ألياف أكثر صعوبة. لمقايسة micropipette الضرر ، ينبغي أن الزاوية بين micropipette وعاء زجاجي القاع تكون حوالي 45 درجة من أجل الضرر بفعالية في غشاء الخلية. وقد تم اختيار الخلايا للتلف micropipette يجب أن يرفق بإحكام على الجزء السفلي من الطبق ، وينبغي ألا يتم استخدام خلايا مدورة منذ الأرجح أنها سوف تنفصل بعد micropipette بدس. تجارب permeabilzation سابونين هي أقل تطلبا من الناحية الفنية وأسرع نسبيا مقارنة لأداء micropipette المقايسات الاختراق. ومع ذلك ، هناك العديد من القيود على الضرر سابونين ، بما في ذلك ويمكن استخدام خلية واحدة فقط لكل طبق منذ سابونين ومنتشر وتلف خلايا أخرى في هذا الطبق.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> القوارض مفرغه </td><td> كولومبوس آلات Exer 06/03 أو ما يعادلها </td><td></td></tr><tr><td> 70 ٪ من الإيثانول </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> بما في ذلك أدوات تشريح ملقط غيض غرامة ، ومقص الربيع </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td></td></tr><tr><td> النوع 2 كولاجيناز ملغ / مل لي </td><td> سيغما </td><td></td></tr><tr><td> 0 كا 2 + Tyrode العازلة (كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 5 ملم بوكل ، 10 HEPES ملم ، 2 ملم MgCl 2 ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 290 mosm) </td><td> سيغما </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mM كا 2 + Tyrode العازلة (كلوريد الصوديوم 140 ملم ، 2.5 ملم CaCl 2 ، 5 ملي بوكل ، HEPES 10 ملم ، 2 ملم MgCl 2 ، ودرجة الحموضة 7.2 ، 290 mosm) </td><td> سيغما </td><td></td></tr><tr><td> درجة الحرارة السيطرة المدارية شاكر </td><td> نيو برونزويك أو ما يعادلها </td><td></td></tr><tr><td> دلتا TPG الطبق </td><td> فيشر العلمية </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 مبائر المجهر مع المؤسسة 80 ميغاواط يزر الأشعة فوق البنفسجية أو ما يعادلها مبائر المجهر </td><td> زايس </td><td></td></tr><tr><td> FM1 - ​​43 أو الأصباغ FM4 - 64 </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الشعيرات الدموية الحجم 0،8-1،0 X 100 ملم </td><td> PYREX </td><td> جزء رقم 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipette مجتذب </td><td> سوتر الآلات </td><td> نموذج P - 97 </td></tr><tr><td> 3 محور micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MHW - 3 </td></tr><tr><td> إشعاع ليزر المسح المجهر مبائر 2100 أو ما يعادل المجهر </td><td> BioRad </td><td> MHW - 3 </td></tr><tr><td> سابونين </td><td> سيغما </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

إصلاح الضرر الحاد إلى غشاء الخلية هي عملية عنصري الفيزيولوجيا الخلوية العادية ، والذي تم ربطه إصلاح خلل الغشاء لكثير من الأمراض التنكسية الإنسان. الاكتشافات الحديثة لMG53 كعنصر أساسي للغشاء آلات إعادة عزل يسمح لفهم أفضل للبيولوجيا الجزيئية الأساسية لإصلاح الأنسجة ، فضلا عن التطبيقات المحتملة متعدية في مجال الطب التجديدي. نحن هنا من التفصيل البروتوكولات التجريبية لاستكشاف في وظائف الجسم الحي من MG53 لاصلاح اصابة في العضلات باستخدام بروتوكولات ممارسة مفرغه على نماذج الماوس ، لاختبار قدرة الغشاء فيفو السابقين إصلاح عن طريق قياس دخول الى صبغ ألياف العضلات المعزولة ، ورصد عملية ديناميكية الاتجار حويصلة MG53 بوساطة إصلاح غشاء الخلية والخلايا المستزرعة في استخدام الخلايا الحية المجهري متحد البؤر.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

الموصوفة هنا البروتوكولات المستخدمة لتصور عملية ديناميكية من MG53 بوساطة غشاء الخلية إصلاح في الحيوانات كلها وعلى المستوى الخلوي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في بيولوجيا الخلايا من إعادة عزل غشاء البلازما والطب التجديدي.

MG53 تصور بوساطة غشاء الخلية عن طريق إصلاح في الجسم الحي و في المختبر أنظمة

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K Views.  Robert Wood Johnson Medical School. الموصوفة هنا البروتوكولات المستخدمة لتصور عملية ديناميكية من MG53 بوساطة غشاء الخلية إصلاح في الحيوانات كلها وعلى المستوى الخلوي. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحقيق في بيولوجيا الخلايا من إعادة عزل غشاء البلازما والطب التجديدي.

Video: Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

باستخدام مايكرو سيستمز الكهربائية والميكانيكية (ممس) لتطوير أدوات التشخيص

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

الفيديو المعلوماتية الحيوية تحليل النمو البشري الخلية الجذعية الجنينية كولوني

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

الفحص البروتين تراكب الأغشية : بروتوكول لاختبار التفاعل بين البروتينات القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان في المختبر</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

التصوير خلية غشاء من الإصابات والعمليات التحت خلوية المشاركة في اصلاح

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

تحليل الحمض النووي الريبي معالجة ردود الفعل عن طريق خلية نظم الحرة: 3 &#39;نهاية الشق من قبل مرنا ركائز<em&gt; في المختبر</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

في المختبر و في فيفو النهج لتحديد نفاذية الخلايا الظهارية المعوية

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.