وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R37 R01 GM064625 AI34867 وإلى NWA نشكر الدكتور R. Tweten من جامعة أوكلاهوما للتعبير البلازميد سلوفاكيا.

1. النسخي إسكات ASM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 1.5 × 10 5 خلايا هيلا في 2 مل من وسائط النمو DMEM (DMEM الجلوكوز عالية مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، 1٪ بنسلفانيا-بكتيريا) على الأطباق 35 ملم أسفل الزجاج (ماتيك) و احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، نضح قبالة سائط النمو واستبدالها 2 مل DMEM انخفاض مصل المتوسطة (DMEM مع 4٪ FBS)، لا يقل عن 1 ساعة قبل إضافة الخليط ترنسفكأيشن سيرنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 4 أنابيب لسيرنا خليط بنسبة ضئيلة ترنسفكأيشن. في أنابيب A و C، إضافة 250 ميكرولتر Optimem خفض المصل و 4 ميكرولتر Lipofectamine RNAiMax، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب B، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من التحكم في المحتوى GC المتوسطة بنسبة ضئيلة (التحكم سيرنا)، في 35 مم طبق ليتم transfected. في أنبوب D، إضافة 250 ميكرولتر من Optimem خفض المصل و 8 ميكرولتر (160 pmoles) من SMPD1 بنسبة ضئيلة (siASM)، في 35 مم طبق رس يتم transfected. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين أنابيب A و B لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن للتحكم سيرنا، وأنابيب C و D لASM سيرنا. احتضان ردود الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عنصر تحكم سيرنا وسيرنا ASM مخاليط رد فعل ترنسفكأيشن ببطء، قطرة قطرة، في أطباق 35 ملم الزجاج السفلي منها واحتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2. في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، نضح بلطف وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائط النمو DMEM الطازجة. لكفاءة ضربة قاضية ASM، الأطباق ينبغي حضنت أخرى في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 31 ساعة (ما مجموعه 55 ساعة) قبل التصوير الحي. </li></ol> 2. إعداد الكواشف لايف المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل المؤتلف تشكيل المسام السم ستربتوليزين O (سلوفاكيا) بتركيز 100 نانوغرام / ميكرولتر في برنامج تلفزيوني 1X الباردة دون كا 2 + 2 + والمغنيسيوم. وسلوفاكيا المستخدمة في هذه المقايسات هو constitutivelذ متحولة السيستين النشطة التي لا يتطلب الحد من وكلاء للنشاط، شريطة التفضل الدكتور رود Tweten، جامعة ولاية أوكلاهوما. وأعرب عن السم في E. القولونية BL21 DE3 وتنقيته في ظل ظروف الأم، كما هو موضح سابقا 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد محلول المخزون FM1-43: في resuspend FM1-43 مسحوق مجفف بالتجميد في DMSO لإيجاد حل 25 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ج: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة مع كا 2 + إلى تركيز النهائي من 4 ميكرومتر (وهناك حاجة إلى 1.5 مل لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد لحين الحاجة إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل B: تمييع الحل الأسهم FM1-43 في DMEM الباردة دون كا 2 + و 10 ملي EGTA (كا 2 + خالية من DMEM) إلى التركيز النهائي من 4 ميكرومتر (1.5 مل المطلوبة لكل طبق ماتيك) وتخزينها على الجليد حتى الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل دافئ (37 درجة مئوية) 1 مل aliquots من الحل والحل A B في أنابيب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على حلول الجليد من DMEM مع كا 2 +، C و2 + خالية من DMEM. </li></ol> 3. التصوير خلية حية من FM1-43 تدفق في سلوفاكيا المعالجة وغير المعالجة الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء متوسطة الحجم حاوية معدنية الضحلة مع الثلج المجروش، عكس ذلك في وعاء زجاجي كبير مع الثلج، والجليد إضافة إضافية ولم يتبق سوى السطح السفلي من الحاويات المعدنية المكشوفة. وضع منشفة ورقية مبللة في القاع المعدن يتعرض للسماح لنقل حتى الحرارية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ واحدة تحكم سيرنا المعاملة طبق ماتيك (نموذج 1) ووضعه على منشفة ورقية رطبة باردة. نضح بلطف من جميع وسائل الإعلام وغسل 3X مع البرد كا 2 + خالية من DMEM. بعد غسل الماضي، ونضح من جميع وسائل الإعلام في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصورة الخلايا المرتبطة FM1-43 في الخلايا مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 1) في وجود كا 2 +، إضافة 180 ميكرولتر من الحل الباردة B إلى ساترة الزجاج وسط الطبق 35 ملم أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقيقة على الجليد (الجدول 1). </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الطبق ماتيك على مرحلة المجهر متحد البؤر تسخينها إلى 37 درجة مئوية، وغرفة مجهزة البيئية (التي تحافظ على درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون مستويات 2). العثور على مجال الخلايا التي سيتم تصويرها يبحث من خلال 1.3 الهدف 40X NA (نيكون). إذا كانت متوفرة، بدوره على PerfectFocus أو جهاز مماثل لتصحيح الانحراف الحراري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من prewarmed الحل A بلطف إلى جانب 35 ملم صحن واستبدال غطاء غرفة البيئية (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور لمدة 4 دقائق في 1 الإطار كل 3 ثانية باستخدام برامج التصوير المناسبة (Volocity في نظام الغزل متحد البؤر المجهري القرص UltraView فوكس بيركن إلمر). ويتم إنجاز الإثارة من FM1-43 مع خط ليزر 488 نانومتر باستخدام فلتر مزدوج اللون مع تمريرة الفرقة 488 نانومتر، ويتحقق من خلال التمييز الانبعاثات استخدام فلتر 527 (W55) الانبعاثات. يتم تعيين مستويات الطاقة ليزر وحساسية الكاميرا لتحقيق التعرض صورة 100 ميللي ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 3،2-3،6 لكشف FM1-43 في التحكم في الخلايا سيرنا المعاملة مع عدم وجود إصابة سلوفاكيا (نموذج 2) في غياب كا 2 +، إلا أنه في الخطوة 3.5 B الحل ينبغي أن تضاف (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس تدفق FM1-43 في الخلايا تحكم سيرنا المعاملة أصيب سلوفاكيا إما في وجود (نموذج 3) أو عدم وجود كا 2 + (نموذج 4)، إضافة 180 ميكرولتر من محلول B الباردة التي تحتوي على سلوفاكيا لساترة الزجاج وسط 35 ملم صحن أسفل الزجاج واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد كما في الخطوة 3.3. كرر الخطوات من 3.2 خلال 3.6؛ ضبط مضيفا الحل إما A أو B في الحل خطوة 3.5 (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد دور ASM في البلازما إصلاح الغشاء، كرر الخطوات من 3،2-3،6 باستخدام الخلايا المعالجة سيرنا ASM لجميع الظروف (عينات 5-8) (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد دور sphingomyelinase المؤتلف خارج الخلية (SM) علىحركية إصلاح غشاء البلازما (التي تعكسها وتثبيط في FM1-43 التدفق) (عينات 9-10)، يضاف SM (0-50 μU) إما الحل أو الحل A B في الخطوة 3.5 ثم تضاف إلى الخلايا خلال الخلية الحية التصوير في إجمالي حجم 1 مل (الجدول 1). </li></ol> 4. الكمي للFM1-43 تدفق إلى خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم الحصول على الأفلام، وقياس كثافة مضان الخلايا من FM1-43 باستخدام برمجيات تحليل الصور (Volocity جناح، PERKINELMER). رسم المنطقة من اهتمام في المنطقة عصاري خلوي من كل خلية في الميدان وتطبيق أدوات البرمجيات لتحديد متوسط ​​FM1-43 كثافة مضان في جميع إطارات من الفيديو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضبط الاختلافات في الأولي FM1-43 تلطيخ، يتم التعبير عن البيانات لكل الفيديو وأضعاف الزيادة في كثافة مضان بمرور الوقت، وخططوا لكل حالة مختلفة. الزيادة أضعاف في مضان من كل فرد في timepointيتم احتساب الخليوي كما F T / F 0، حيث F T هو مضان يعني في timepoint محددة، وF 0 هو مضان يعني في ر = 0 (الأرقام 1-2). </li></ol>

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

يعلن الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

اعتمدت الدراسات السابقة على الإصابة الميكانيكية وإصلاح غشاء البلازما على آليات متنوعة من الخلايا جرح، بدءا من إسقاط الخرز الزجاجي، micropipetting، القص، خدش أو كشط. كانت قراءات من كل هذه المقايسات النوعية بدلا من الكمية، ولم تعطي معلومات دقيقة عن حركية آلية إصلاح. تم قياس ...

وقد كان من المعروف لعدة عقود أن إصلاح غشاء البلازما بعد الإصابة الميكانيكية هو 1،2 كا 2 + التي تعتمد عملية. وأظهرت الدراسات فيما بعد أن كا 2 + تدفق من خلال الجرح يطلق عملية نشطة من إيماس من الحويصلات داخل الخلايا في موقع الإصابة، وهو مطلوب لإعادة عزل 3،4. تم استخدام معدل فقدان صبغة الفلورسنت تحميلها في سيتوبلازم الخلايا لتقييم سرعة إصلاح، وخلص إلى أن اكتمل إعادة عزل داخل &lt;30 ثانية بعد الإصابة 5. واقترحت في البداية نموذجين لشرح متطلبات إيماس في إصلاح غشاء البلازما: 1) نموذج &quot;التصحيح&quot;، مما يوحي بأن كا 2 + تدفق من خلال الآفة يؤدي الانصهار في البداية مثلي النمط من الحويصلات داخل الخلايا، وتشكيل كبير &quot;التصحيح&quot; التي من شأنها أن ثم تطبيقها على غشاء البلازما لختم الجرح 6 و 2) نموذج خفض التوتر، الذي اقترح أن غشاء عديد بواسطة كا 2 + إيماس التي تعتمد في محيط الجرح من شأنه أن يقلل التوتر غشاء البلازما، وتسهيل إعادة إغلاق طبقة ثنائية 7. وقد تعزز دور كا 2 + إيماس أثار في البلازما إصلاح غشاء مزيدا من الدراسات التي تبين أن الجسيمات الحالة تحتوي على جزيء كا 2 + الاستشعار، synaptotagmin السابع، مما يسهل إيماس والبلازما إصلاح غشاء الخلايا المصابة في 8،9،10،11 . ومع ذلك، فقد أشارت الأدلة الإضافية التي إيماس وحده لم يكن كافيا لتعزيز إصلاح غشاء البلازما. بالإضافة إلى الدموع الميكانيكية على غشاء البلازما، وهو شكل المتكرر للإصابة الخلية هو permeabilization بواسطة السموم تشكيل المسام التي تنتجها البكتيريا 12،13 أو 14،15 الخلايا المناعية. على عكس الدموع الميكانيكية والبروتينات المكونة للمسام إدراج نفسها على غشاء البلازما تشكيل مستقرة، المسام مبطنة البروتين الذي لا يمكن أن يتم إغلاقه ببساطة عن طريق تطبيق غشاء &quot;التصحيح&quot; أو احمرارجي التوتر الغشاء. يثير الاهتمام والفضول، وكشفت الدراسات أن خلايا الثدييات لديها آلية فعالة لإصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع البروتينات التي تشكل المسام، وهذه العملية تتطلب أيضا وجود خارج الخلية كا 2 + 12. أثارت هذه النتيجة مسألة ما إذا كان إزالة الغشاء مسام من سطح الخلية أيضا عملية سريعة، كما لوحظ مع الجروح الميكانيكية 5. من المستغرب، كشفت الدراسات التي أجريناها مؤخرا أن إعادة عزل الخلايا permeabilized مع السموم تشكيل المسام لها خصائص مشابهة جدا لإصلاح الجروح الميكانيكية: تتطلب عملية خارج الخلية كا 2 +، وتكتمل في غضون 30 ثانية ~. التحقيق هذه العملية في مزيد من التفاصيل، علمنا مؤخرا أنه بالإضافة إلى كا 2 + إيماس تنظيما من الجسيمات الحالة، ينطوي إصلاح غشاء البلازما شكل السريع لالإلتقام، والتي يتم تشغيلها من قبل الإفراج عن انزيم الليزوزومية sphingomyelinase حمض (ASM) وضروري ليس فقط لعشرإزالة (ه) من المسام عبر الغشاء، ولكن أيضا لإصلاح الجروح الميكانيكية 16. لتحديد حركية إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، في المختبر لدينا نحن تكييفها منهجية التصوير الحية التي كانت تستخدم في السابق لتقييم إعادة إغلاق ألياف العضلات المعزولة بجروح الليزر 17. يعتمد هذا الاختبار على خصائص صبغ محبة للدهون FM1-43، والتي intercalates ثابت في النشرة الخارجي من طبقات ثنائية الدهون وزيادة في كثافة مضان. عندما تعطل البلازما طبقة ثنائية الغشاء مكاسب صبغ خارج الخلية أغشية الخلايا الوصول إلى، وتوفير الفحص الحساسة للكشف عن إصابة غشاء البلازما وإصلاح 18،16،19،20. للتكيف مع هذا الاختبار لتقييم إعادة عزل الخلية بعد permeabilization مع البروتينات المكونة للمسام، ونحن الخلايا ما قبل المحتضنة في 4 درجات مئوية مع السم البكتيري ستربتوليزين O (سلوفاكيا)، الذي يربط لغشاء الكولسترول 21. خلية متزامنويمكن بعد permeabilization أن يتحقق بسهولة عن طريق نقل الخلايا من الجليد لتدفئة المتوسطة في مرحلة المجهر ساخنة، والتي ينشط oligomerization والتغيير في التشكل الذي يؤدي إلى تشكيل المسام عبر الغشاء. ميزة هذا النهج، على المقايسات التي تم نشرها مسبقا باستخدام الليزر جرح، غير أن عددا أكبر من الخلايا يمكن تحليلها في وقت واحد في حقل المجهرية، وتوفير أفضل أخذ العينات من السكان الخلية. نظرا للتشابه بين الآلية عملية إعادة عزل الخلايا ينظر بعد الإصابة الميكانيكية وpermeabilization مع السموم تشكيل المسام، مقايسة وصفنا هنا يوفر طريقة مرنة للغاية وقوية لتشريح العوامل التي تدخل في عملية الأساسية للإصلاح غشاء البلازما. كمثال على ذلك، وتبين لنا أنه من الممكن استخدام هذا الاختبار لتحديد الخطوات كا 2 + التي تعتمد ومستقلة عن عملية الإصلاح.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

إصابة غشاء البلازما هو الحدث بشكل متكرر، والجروح يتعين إصلاحه بسرعة لضمان البقاء على قيد الحياة الخلوية. تدفق كا 2 + هو حدث يشير المفتاح الذي يقوم بتشغيل إصلاح الجروح الميكانيكية على غشاء البلازما داخل ~ 30 ثانية. وكشفت الدراسات الحديثة أن خلايا الثدييات أيضا ختم غشاء البلازما الخاصة بهم بعد permeabilization مع المسام تشكيل السموم في كا 2 + التي تعتمد على عملية ينطوي على إيماس من sphingomyelinase حمض انزيم الليزوزومية تليها المسام الإلتقام. هنا، نحن تصف المنهجية المستخدمة لإثبات أن إعادة عزل الخلايا permeabilized من قبل O السم ستربتوليزين هو أيضا سريع وتعتمد على كا 2 + تدفق. تصميم مقايسة يسمح تزامن هذا الحدث الضرر وقياس الحركية الدقيقة للقدرة الخلايا على استعادة سلامة غشاء البلازما عن طريق التصوير وقياس مدى الذي الصبغة liphophilic FM1-43 تصل إلى أغشية الخلايا. هذا المرض فحص الحيةس يسمح بتقييم الحساسة من قدرة خارجيا أضاف العوامل القابلة للذوبان مثل sphingomyelinase لمنع تدفق FM1-43، مما يعكس قدرة الخلايا على إصلاح غشاء البلازما الخاصة بهم. يسمح هذا الاختبار لنا لإظهار للمرة الأولى التي sphingomyelinase يعمل المصب من كا 2 + إيماس التي تعتمد، منذ بالإضافة خارج الخلية من الانزيم يعزز إعادة عزل الخلايا permeabilized في غياب كا 2 +.

تركيزات منخفضة من البكتيريا البلازما sphingomyelinase (SM) الانقاذ إصلاح الغشاء في الخلايا المنضب في sphingomyelinase حمض الليزوزومية. باستخدام FM1-43 فحص التصوير، وأظهرنا سابقا أن الخلايا ناقصة لASM انزيم الليزوزومية وتعرضت لاصابة في سلوفاكيا وجود ?...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا 2 +، sphingomyelinase والعوامل الأخرى على إصلاح غشاء البلازما.

يعيش التصوير الفحص لتقييم أدوار كا<sup&gt; 2 +</sup&gt; وSphingomyelinase في إصلاح مسام تشكيل الجروح السمية

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

live-imaging-assay-for-assessing-roles-ca2-sphingomyelinase-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

11.6K Views.  University of Maryland.  تصوير حي من الخلايا المعرضة لصبغ محبة للدهون FM1-43 يسمح التحديد الدقيق للحركية التي يتم من خلالها إزالة السموم تشكيل المسام من غشاء البلازما. هذا هو مقايسة الحساسة التي يمكن استخدامها لتقييم متطلبات كا 2 +، sphingomyelinase والعوامل الأخرى على...

Video: Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

لإعداد ذبابة الفاكهة الأجنة لايف التصوير باستخدام بروتوكول إسقاط الشنق

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

تقنيات التصوير كاليفورنيا 2 + في اشارة الى الحيوانات المنوية البشرية

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

يعيش التصوير الكالسيوم الخلية المشتركة مع وساطة سيرنا إسكات الجينات يحدد كا 2 + قنوات تسرب في غشاء ER وآلياتها التنظيمية

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

مقايسة لتقييم سلوك يزدرع الخلوية من اللحمة المتوسطة القحف

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

يعيش التصوير خلية من الأحداث الالتهام الذاتي المبكر: Omegasomes وما بعدها

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...