1. הליכון ריצה עבור חשיפת היקף לפגיעה בשרירים במודלים של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעו את הזווית של פני הליכון לשימוש במהלך פרוטוקול הריצה. באופן כללי, ברמה שטוחה או זווית בין 7 ° ו 15 DEGREES ° בירידה או בעלייה משמש. הליכונים יש במנגנון נפרד כדי להתאים את שיפוע בעוד שאחרים דורשים הליכון להיות גבוהות באמצעים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים על מגש או משטח המעבדה כחול מתחת ההליכון לפני שהכניס את בעלי החיים ההליכון לאסוף כל פסולת בעלי החיים במהלך פרוטוקול הריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני עכברים ריצה צריך להיות acclimated לסביבה של ההליכון. זו כוללת הצבת חיות הליכון למשך 15 דקות עם רשת החשמל לסירוגין את המנוע כונן חגורה על חגורה אבל לא נעים (כלומר עם מהירות להגדיר 0 m / s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל לרשת החשמל מוטיבציה. עוצמת ותדירות הפולסים משמש בדרך כלל ניתן לשלוט על הליכונים אלא משתנה מיצרן אחד למשנהו. בדרך כלל, העוצמה המקסימלית אינו נדרש להניע העכברים לרוץ זמן בתדירות גבוהה (לפחות פעם אחת כל שתי שניות) יהיה לשפר את התאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את החגורה הליכון להתחיל את הפרוטוקול פועל. המהירות ההתחלתית של כ 5 מטר / דקה אמור לשמש במשך תקופה חימום עבור העכברים. המהירות של ההליכון יכול להיות מואץ באיטיות, בדרך כלל על ידי הוספת 1-2 מטר / דקה עבור כל דקה לאחר תחילתו של ההליכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היענות של בעלי חיים ברוב הפרוטוקולים ניתן לשפר על ידי ביצוע סדרה של ריצות קצרות (5 דקות) במהירות לחמם במשך 3 עד 10 ימים לפני הריצה הניסוי מתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרגיל תשישות חריפה בדרך כלל כרוך להגדיל את המהירות של ההליכון עם הזמן עד למהירות המרבית (בדרך כלל &lt;30 מ &#39;/ מ&#39;) מושגת ומתוחזק עד העכברים להראות סימני תשישות. קריטריונים לשיפוט תשישות להשתנות, אך בדרך כלל כוללים עכבר לבלות יותר ממחצית הזמן על רשת החשמל או 5 שניות רצופות על רשת החשמל מבלי לחזור אל פני השטח הליכון. לאחר עכבר הפרט הוא מותש אותו ניתן להסיר ההליכון ואת הזמן הכולל של ריצה ניתן להקליט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הזווית של ההליכון יכול לשמש בניסויים ריצה חריפה להגדיל את עומס התרגיל (עם זווית בעלייה), או לגרום להתכווצויות אקסצנטרי נזק (עם זווית ירידה) כי לקרוע את הקרומים sarcolemmal של סיבי שריר 1. אוונס כחול צבע יהיה ניתן להזריק לתוך החיות לפני נהלים כאלה לשימוש לצבוע היסטולוגית לזהות סיבי השריר שניזוקו 2,3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימון סיבולת ריצה פרוטוקולים לספק עומס תרגיל החיה על פני תקופה ממושכת (עד חודשים) על מנת לייצר עיצוב מחדש של השריר או מערכת הלב וכלי הדם. חימום הליך זהה לעיל (שלב 1.5) אולם את המהירות המרבית היא בדרך כלל נמוכה יותר פעמים לרוץ יכול להיות ארוך למדי (&gt; 1 שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת ריצה העכברים ניתן להחזיר את הכלובים. הליכונים בדרך כלל להיות מלוכלך למדי ואילו העכברים פועלות, בעיקר על פרוטוקולים ארוך. יש צורך לנקות את ההליכון, בדרך כלל עם תרסיס אתנול 70%, לאחר כל שימוש. </li></ol> 2. Assay Ex Vivo של קיבולת ממברנה תיקון של סיבי שריר מבודדים בעקבות-UV לייזר נזק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השכבה השטחית של השריר digitorum מכופף (FDB) brevis מרגל העכבר. ראשית, לחתוך את עור לפתוח את היחידה על קו החציון תוך הקפדה לא לפגוע בשרירים מתחת, ולאחר מכן לבצע חתכים אופקיים להסיר את העור. הגיד הלבן השטוח של שריר FDB (בגיד הפרוקסימלי) ניתן לראות מחוברת עצם calcaneus. בבוטות להפריד את גיד ידי מלקחיים לנתק את גיד קרוב לאתר של הקובץ המצורף, לתפוס את הגיד בחינם על ידי מלקחיים ומושכים אותו בעדינות כדי להפריד את FDB מן הרקמות הסובבות תוך צמצום כל רקמות החיבור שנותרו מחוברים. כאשר אדם רואה סניף גידים דיסטלי של ספרות הפרט FDB ניתן להסיר על ידי חיתוך שבו הגידים האלה להתחבר בשכבה עמוקה יותר של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את צרור שריר FDB ב 1 מ&quot;ל של תמיסת collagenase מראש לחמם 37 מעלות צלזיוס צינור 1.5 Eppendorf מ&quot;ל, קלטת את הצינורית אוריינטציה אופקית 37 ° C מסלולית שייקר ולנער בסל&quot;ד 200 דקות 65. הטיימס של דגירה יכול להיות מותאם על מנת להבטיח עיכול מספיק, אשר מסומן על ידי מראה בלוי צבע חיוור של השריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר את צרור FDB מעוכל לתוך צינור 1.5 צנטריפוגה μl המכיל ~ 600 μl של Tyrode 2.5 + Ca 2 באמצעות טיפ פיפטה 1 מ&quot;ל עם סיום חתך בעל קוטר מספיק כדי לאפשר את צרור מתעכל בקלות לעבור ללא הפרעה. בעדינות להעיף את הצינור כדי לנער את סיבי משוחרר מן הצרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור טיפ 30 פיפטה μL כך דiameter רק במעט יותר מאשר צרור השריר (בין 15-20 מיקרומטר קוטר) השתמש pipettor כדי למשוך בעדינות את הצרור אל פיפטה ואז לדחוף אותו בחזרה לתוך התמיסה.. חזור על תהליך זה עד רוב הסיבים הם משויך מן הצרור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי סיבים משויך בעדינות מפנה את הצינור, לקחת סכום הרצוי ושחרר על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. נפח לטעון תשתנה בהתאם יעילות הבידוד ומספר סיבי שימושי כי יש צורך בצלחת עבור פרוטוקול מסוים. הסיבים הנותרים ניתן לאחסן את הצינור על 4 מעלות צלזיוס למשך כ 6 שעות מחקרים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר את המנה לשבת באין מפריע במשך 5 דקות. זה מאפשר הסיבים לדבוק תחתית הזכוכית של המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת זכוכית על תחתית מיקרוסקופיה confocal מצויד לייזר UV. שים לב סיבים תחת מיקרוסקופ שלב בהגדלה&gt; 100x כדי לבדוק נוכחות של דפוס striation נורמלי מוט ישר, כמו הצורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף FM1-43-64 או FM4 צבעים styrylpyridinium 4 הפתרון לריכוז סופי של 2.5 מיקרומטר 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגרום נזק למצב סיבים אותו בחלון הדמיה כך הסיב מכוונת בזווית 45 ° מן בפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה בצד ימין למטה (איור 1). מקרינים שטח 5x5 פיקסלים (כ 0.9μmx0.9μm) של קרום הפלזמה באמצעות לייזר UV (80 mW או יותר, 351/364 ננומטר) מוגדר כוח מרבי למשך 5 שניות. האזור מוקרן צריך לפצל את הממברנה הפלסמטית, כלומר, מחצית תיבת 5x5 צריך להיות בתוך הסיב, והשאר צריך להיות מחוץ סיבים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של כניסה לתוך צבע הסיב במרווחים של 5 שניות כל אחד לתקופה של עד 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.8 עבור לא יותר מ 3 סיבים לכל מאכל, כמו צבע פלואורסצנטי תהיה בסופו של דבר endocytosed לתוך סיב ו לסבך כל ניתוח הנתונים. לאחר 3 סיבי מאכל חדש צריך להיות מוכן משלב 2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח נתונים על ידי חישוב השינוי בעוצמת הקרינה (ΔF / F 0) בין כל מסגרת שנתפסו כדי למדוד את כמות כניסת לצבוע. זה דורש למדוד את הקרינה בשטח ממוצע של כ 200 מיקרומטר 2 באמצעות תוכנת ניתוח כגון ImageJ זמין בפומבי (http://rsbweb.nih.gov/ij/). לשם השוואה בין הסיבים, החישוב הבא צריך להיעשות עבור כל מסגרת: ΔF / F 0, 0 כאשר F הוא אומר הקרינה באזור של עניין במסגרת כבש ראשון (t = 0; לפני הפציעה), וכן הוא ΔF השינוי הקרינה של כל מסגרת הבאים (FF 0). </li></ol> 3. חיים הדמיה תא Confocal כדי לפקח על תהליך דינמי של תיקון קרום התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipettes נעשו פיירקס נימים. נימי הושם על חולץ micropipette ומשך לפי תוכנית שנקבעה מראש (חום = 695; משוך = 50; לוול ךיב .= 55; זמן = 250). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micropipette צורפה micromanipulator 3 ציר (xyz). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם transfected עם פלסמיד דנ&quot;א באמצעות שיטות נורמלי על צלחת זכוכית התחתונה דלתא טי. התקשורת צריכה להיות עברה 2.5mm Ca 2 + חיץ Tyrode לפני ניסויים להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זכוכית המכיל תאים transfected הונחו על לייזר סריקת מיקרוסקופ confocal עם 40X אובייקטיבי שמן 1.3NA טבילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נזק חמור לחיות תאים בוצעה על ידי הוספת micropipette לתוך קרום התא, ואז מהר לחזור micropipette מחוץ לתא 3,6. ברציפות תמונות תא חי התקבלו בהפרש של 1.54 s / מסגרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay שיבוש saponin המושרה קרום, saponin 0.005% (Sigma) ב 2.5mm Ca 2 + חיץ Tyrode היה perfused ידי מערכת אישית התאספו הכבידה זרימה זלוף 7. שיעור זלוף הוא כ 1 / ml דקות ועל קצה זלוף צריך להיות ממוקם ישירות מעל התא להיות הדמיה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: הסרט מייצג של ריצה על הליכון העכבר יכול להתבצע במהלך הצילומים. הסרט יהיה להדגים את היכולת לרוץ מופחת של mg53-/ - בעכברים עקב פגיעה בשריר השלד. היקף הנזק שנגרם על ידי פרוטוקול-UV לייזר הנזק כמפורט לעיל תלוי ביכולת לתקן קרום של סיבים ניתחו. יכולת זו מושפעת גנוטיפ של העכבר שממנו סיב בודד, בתנאים תאיים, וכל שינויים בביטוי החלבונים (transfection או זיהום). סיבים נורמלי סוג בר יאפשר קלה עד בינונית כניסה צבען (איור 2 א). סיבי שריר נגזר mg53-/ - עכברים עם יכולת להתפשר תיקון קרום יציג כניסה משמעותית יותר של צבע לתוך הסיב (איור 2b). תוצאות אופייניות של טרנסלוקציה פציעה להראות microelectrode של MG53 המכילים vesicles לאתר פציעה. איור 3 א ו 3 ב מראים GFP-MG53 transfected C2C12 myotubes נפגע על ידי החדרת micropipette לתוך קרום התא. בתא לפני נזק micropipette, GFP-MG53 ממוקם על הממברנה פלזמה וגם בציטופלסמה 3. בעקבות החדירה micropipette, GFP-MG53 שלפוחית ​​המכילה נעו לעבר אתרי נזק (כפי שצוין על ידי ראש חץ). איור 3c מראה GFP-MG53 transfected C2C12 myoblasts שטופלו של 0.005% saponin, חומר ניקוי שיכולים permeabilize הממברנה הפלסמטית. לאחר טיפול saponin, GFP-MG53 translocated מ cytosol אל קרום התא. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="איור 1"/> Weisleder, et al. באיור 1. סיבים יישור האזור הגדרה פציעה. אוריינטציה תקין של סיבי שריר מבודדים בתוך שדה הראייה ואת ההגדרה של האזור הראו פגיעה. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="איור 2"/> Weisleder, et al. איור 2. נזק לייזר UV של FDB. תמונות סיבים להראות סיבים לפני הפציעה (0 שניות, משמאל) על פגיעה פוסט 200 שניות (מימין). סיבים מן העכבר סוג בר (א) להראות פציעה קלה. סיבים מעכברים עם תיקון הממברנה נפגעת (ב) לאפשר לצבוע יותר להיכנס. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="איור 3"/> Weisleder, et al. איור 3. Microelectrode ו saponin נזק תאים בתרבית. תמונות להראות C2C12 myotubes (a, b) ו myoblast C2C12 (ג) לפני הפציעה (לעיל) פגיעה פוסט (התחתון). תאים עם פצועים microelectrode (א, ב) להראות MG53 טרנסלוקציה לאתרים פציעה (חיצים). תאים שטופלו saponin (ג) להראות MG53 טרנסלוקציה על קרום התא.

<ol>
	<li>Armstrong, R. B., Ogilvie, R. W., Schwane, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eccentric+exercise-induced+injury+to+rat+skeletal+muscle.">Eccentric exercise-induced injury to rat skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 54, 80-93 (1983).</li><li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo+marker+of+myofibre+damage:+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability.">Evans Blue Dye as an in vivo marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).</li><li>Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+secretory+membrane+with+FM1-43+fluorescence.">Monitoring secretory membrane with FM1-43 fluorescence.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 1-10 (1999).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Cai, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+repair+defects+in+muscular+dystrophy+are+linked+to+altered+interaction+between+MG53,+caveolin-3,+and+dysferlin.">Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin.</a> J Biol Chem. 284, 15894-15902 (2009).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotection+of+ischemia/reperfusion+injury+by+cholesterol-dependent+MG53-mediated+membrane+repair.">Cardioprotection of ischemia/reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair.</a> Circ Res. 107, 76-83 (2010).</li><li>Knab, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeatability+of+exercise+behaviors+in+mice.">Repeatability of exercise behaviors in mice.</a> Physiol Behav. 98, 433-440 (2009).</li><li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice.">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol Genomics. 23, 72-78 (2005).</li><li>Massett, M. P., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+responses+to+exercise+training+in+inbred+and+hybrid+mice.">Strain-dependent differences in responses to exercise training in inbred and hybrid mice.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 288, 1006-1013 (2005).</li><li>Bansal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ריצה הליכון היא מתודולוגיה שימושי על מתן עומס התרגיל של בעלי חיים שטופלו. כפי מתודולוגיה עבור מדידת תפקוד השרירים או יכולת סיבולת היא גישה רועש לשמצה שקשה לבצע באופן עקבי לשחזור 8. באופן כללי, פעמים כדי תשישות יכולה לשמש נקודת הסיום כדי לפתור הבדלים משמעותיים בין קבוצות הניסוי, כגון אלה בין כמה קווי עכבר נוקאאוט ועכברים סוג בר 9. מניפולציות ניסויית המייצרים הבדל דק יותר, כגון כמה ניסויים התרופות, לא יכול לפתור חילוקי מעל הרעש הקשורות טכניקה זו. על מנת למקסם את reproducibility ורגישות של טכניקות אלה חשוב לשמור על תנאים מושב למושב מאוד הדוק. הזמן של היום חיות ימומשו, כמו גם תקופת התנאים להתחמם בשימוש, הם גורמים חשובים וצריכים להישאר עקבי ממשפט למשפט. השפעת מתח יכול להיות השפעה משמעותית על עיצוב של פרוטוקולים הליכון כמו זנים מסוימים של עכברים יכול לרוץ הרבה יותר זמן על ההליכון מאשר זנים אחרים מגיבים באופן שונה תרגיל סיבולת 10. כקו מנחה כללי, עכברים רבים יוכלו לרוץ 200-300 מטר הכולל במחקר תשישות עם עלייה מתמדת במהירות של ההליכון (5 מ &#39;/ מ&#39; מהירות ראשוני עם 1 מ &#39;/ מ&#39; מוסף עבור כל דקה אחרי ההתחלה). עבור תרגיל סיבולת העכברים ניתן לרוץ בין 9-12 מ &#39;/ מ&#39; במשך 30 דקות 2 או 3 פעמים בשבוע. עם זאת, מחקרים בודדים בדרך כלל דורשים אופטימיזציה של פרוטוקול כדי להתאים לצרכים ניסיוניים בודדים. ההליך-UV לייזר נזק הוכח להיות שיטה יעילה למדידת תיקון קרום קיבולת של סיבי שריר השלד 3,6,11. אחת מרכיב חיוני להצלחת ניסויים אלה היא להשתמש בסיבי השריר היחיד להציג מראה ישר, בצורת מוט עם דפוס קבוע של פסי ו sarcolemma חלק שאינו מופיע מקומט. אם סיבי השריר אחרים נבחרו נזק הקרום עשוי להיות כבר נוכח אלה סיבים הפרשנות של תוצאות ניסויים אלה עשוי להיות מסובך. חשוב גם כי הכיוון של הסיבים ואת ההגדרה של האזור מוקרן להיות מוגדרת כ באיור 1. זה מספק פגיעה בגודל לשחזור, ובכך מאפשר השוואה בין הסיבים. אם האזור מוגדר של פגיעה נמצא לחלוטין בתוך הסיב, פגיעה פנימית תיווצר במקום לשבש את sarcolemma. בנוסף, ערך מחושב עבור ΔF / F 0 רגיש מאוד באזור של עניין שנבחרו מדידת הקרינה מתכוון. שטח של כ 200μm 2, סמוך ובכלל במקום הפציעה, הוא המתאים. בניגוד לאזור שהוגדר עבור פציעה, אזור זה צריך לשקר לחלוטין בתוך הסיב. אם תכלול שטח מחוץ סיבים, שטח ריק וכתוצאה מכך יגדל ΔF / F 0 בסיבים עם כניסה לצבוע מעט תוך הפחתת ΔF / F 0 בסיבים עם פנוטיפ חמור יותר. זה מקטין את הרגישות של assay, ובכך השוואה בין סיבי קשה יותר. עבור assay את הנזק micropipette, את הזווית בין micropipette והתחתון צלחת זכוכית צריך להיות כ 45 מעלות על מנת ביעילות נזק של קרום התא. התאים נבחרו נזק micropipette יש לצרף בחוזקה אל החלק התחתון של התבשיל תאים מעוגלים לא אמור לשמש מאז סביר להניח שהם תנתק לאחר micropipette תוקעת. Permeabilzation ניסויים Saponin פחות תובענית מבחינה טכנית יחסית מהר לבצע לעומת micropipette מבחני חדירה. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לנזק saponin, ובכלל זה רק תא אחד יכול לשמש לכל צלחת מאז saponin יהיה מפוזר נזק לתאים אחרים בכלי זה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> מכרסמים הליכון </td><td> קולומבוס מכשירים Exer 3 / 6 או שווה ערך </td><td></td></tr><tr><td> 70% אתנול </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Dissection כלים כולל מלקחיים טיפ יפה, המספריים אביב </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td></td></tr><tr><td> 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase סוג אני </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, KCl 5 mM, HEPES 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm) </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + Tyrode חיץ (140 mM NaCl, 2.5 מ&quot;מ CaCl 2, 5 מ&quot;מ KCl, HEPES 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, pH 7.2, 290 mosm) </td><td> סיגמא </td><td></td></tr><tr><td> טמפרטורה לשליטה מסלולית שייקר </td><td> ניו ברונסוויק או שווה ערך </td><td></td></tr><tr><td> דלתא תבשיל TPG </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM 510 מיקרוסקופ confocal עם לייזר 80 mW Enterprise UV או מיקרוסקופ confocal המקבילה </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43-64 או FM4 צבעים </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> בורוסיליקט נימים גודל 0.8-1.0 X 100 מ&quot;מ </td><td> פיירקס </td><td> חלק מס &#39;9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipette חולץ </td><td> סאטר מכשירים </td><td> דגם P-97 </td></tr><tr><td> 3 ציר micromanipulator </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> 2100 Radiance סריקת לייזר מיקרוסקופ confocal מיקרוסקופ או שווה ערך </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponin </td><td> סיגמא </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualization of mg53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems

תיקון של פגיעה חריפה על קרום התא היא תהליך יסודי של הפיזיולוגיה הסלולר נורמלי, פגום לתיקון קרום נקשר הרבה מחלות אנושיות ניווניות. התגלית האחרונה של MG53 כמרכיב עיקרי של המנגנון פותחת הממברנה מאפשרת הבנה טובה יותר של מולקולרי הביולוגיה הבסיסית של תיקון רקמות, כמו גם עבור יישומים translational פוטנציאליים רפואה רגנרטיבית. כאן אנו בפירוט את פרוטוקולי הניסוי לבחינת תפקוד vivo של MG53 במצב של פציעה בשריר תוך שימוש בפרוטוקולים תרגיל הליכון על מודלים העכבר, לבדיקת vivo לשעבר קרום יכולת לתקן על ידי מדידת ערך צבע לתוך סיבי שריר מבודדים, לניטור תהליך דינמי סחר MG53 בתיווך שלפוחית ​​ואת קרום התא לתקן תאים בתרבית באמצעות מיקרוסקופ תא חי confocal.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems at JoVE.com

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

visualization-mg53-mediated-cell-membrane-repair-using-vivo-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

12.3K Views.  Robert Wood Johnson Medical School. שתוארו כאן הם השתמשו בפרוטוקולים כדי להמחיש את התהליך הדינמי של תיקון MG53 בתיווך קרום התא בבעלי חיים שלם ברמה התאית. שיטות אלה ניתן ליישם כדי לחקור את הביולוגיה של התא פותחת הממברנה הפלסמטית ורפואה רגנרטיבית.

Video: Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

שימוש Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) לפתח כלים לאבחון

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

וידאו ביואינפורמטיקה ניתוח גדילה אנושי בתאי גזע עובריים קולוני

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

חלבון ממברנה Assay Overlay: פרוטוקול בדיקת אינטראקציה בין חלבונים מסיסים ובחלקם לא מסיסים במבחנה</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3' End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes precursor mRNA beyond the end of mature RNAs, and an active process of endonuclease activity is required at a specific site. Cleavage of the precursor RNA normally occurs 10-30 nt downstream from the consensus polyA site (AAUAAA) after the CA dinucleotides. Proteins from the cleavage complex, a multifactorial protein complex of approximately 800 kDa, accomplish this specific nuclease activity. Specific RNA sequences upstream and downstream of the polyA site control the recruitment of the cleavage complex. Immediately after cleavage, pre-mRNAs are polyadenylated by the polyA polymerase (PAP) to produce mature stable RNA messages.
Processing of the 3&#8217; end of an RNA transcript may be studied using cellular nuclear extracts with specific radiolabeled RNA substrates. In sum, a long 32P-labeled uncleaved precursor RNA is incubated with nuclear extracts in vitro, and cleavage is assessed by gel electrophoresis and autoradiography. When proper cleavage occurs, a shorter 5&#8217; cleaved product is detected and quantified. Here, we describe the cleavage assay in detail using, as an example, the 3&#8217; end processing of HIV-1 mRNAs.

Analysis of RNA Processing Reactions Using Cell Free Systems: 3&#039; End Cleavage of Pre-mRNA Substrates in vitro

RNA polymerase II synthesizes a precursor RNA that extends beyond the 3' end of the mature mRNA. The end of the mature RNA is generated cotranscriptionally, at a site dictated by RNA sequences, via the endonuclease activity of the cleavage complex. Here, we detail the method to study cleavage reactions in vitro.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

The 3&#8217; end of mammalian mRNAs is not formed by abrupt termination of transcription by RNA polymerase II (RNPII). Instead, RNPII synthesizes ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.