ويود الكاتب أن أشكر الدكتور Dongxuan جيا للمساعدة التقنية. وكانت بعض الصور التي تظهر في هذه المقالة بالتعاون مع الدكتور س. شتاينبرغ مالكولم ، قسم علم الأحياء الجزيئي في جامعة برينستون. فإن المؤلف أود أيضا أن أشكر وزارة الدفاع لسرطان البروستاتا برنامج بحوث (منح PC - 030482 - 991552 والكمبيوتر) ولجنة التحقيق الوطنية / المعاهد الوطنية للصحة (منحة R01CA118755) على دعمهم السخي.

1. إعداد تعليق خلية واحدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن تنمو الثقافات الخلية تمسكا التقاء 90 ٪ ، يجب شطف monolayers عندها مرتين مع برنامج تلفزيوني. بعد افراغ جيدا ، إضافة 2 ملل (لوحات 100 ملم) من 0.05 ٪ التربسين EDTA - 1 ملم ، واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا. وقف trypsinization بإضافة 2 ملل من المتوسط ​​الشامل واستخدامها بلطف ماصة 5 مل لمتمزج الخليط حتى الخلايا في التعليق. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 ميكرولتر بمخزون الدناز 10 ملغ / مل ، واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. دوامة لفترة وجيزة وأجهزة الطرد المركزي في 200 XG لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف بيليه وتغسل مع 1 مل كامل نسيج ثقافة المتوسط. أكرر ، ثم الخلايا في resuspend 2 ملل من اكتمال النسيج المتوسط ​​الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ، أو الآلي لمكافحة الخلية وضبط تركيز الخلايا إلى 2.5 × 10 6 / مل. لهذه التظاهرة تم استخدام خلية مكافحة TC10 BioRad الآلي. </li></ol> 2. تشكيل قطرات الشنق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء من طبق نسيج الثقافة 60 مم ومكان 5 مليليتر من برنامج تلفزيوني في قاع الطبق. هذا سوف يكون بمثابة غرفة الترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس غطاء واستخدام pipettor 20 ميكرولتر إيداع 10 قطرات ميكرولتر على الجزء السفلي من الغطاء. تأكد من أن يتم وضع قطرات بعيدا بما فيه الكفاية بحيث لا يمس. فمن الممكن لوضع ما لا يقل عن 20 نقطة في الطبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقلب الغطاء على PBS غرفة مليئة القاع واحتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C / 5 ٪ / 2 الرطوبة 95 ٪ ، ومراقبة قطرات اليومية واحتضان حتى أوراق الخلية أو المجاميع شكلت. ويمكن استخدام مجهر ستيريو تشكيل لتقييم مجموع المباراتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة شكل صفائح ، ويمكن تحويلها إلى شاكر الزجاج جولة القاع القوارير التي تحتوي على 3 ملل المتوسطة كاملة والمحتضنة في حمام مائي تهتز عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 حتى شكل الأجسام الشبه الكروية. </li></ol> 3. تلاحظ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على حجم الخلية ، قد تحتاج إلى تركيز حتى يتم تعديل أو إلى أسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن تكون ملطخة غشاء الخلايا مع الإقحام الأصباغ الفلورية قبل تشكيل قطرة شنقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن أن يكون اثنان أنواع مختلفة من الخلايا الملون تفاضلي والمختلط في نسبة (أو غيرها) 01:01 قبل تشكيل قطرات شنقا. يمكن أن تكون هذه الخلايا السرطانية واللحمية والأنسجة الجنينية ، أو الخلايا المعدلة وراثيا لجعل التواقيع لاصقة معينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن فصل الخلايا من الأطباق باستخدام زراعة الأنسجة التربسين 0.05 ٪ / 2 ملي الكالسيوم للحفاظ على وظيفة كادهيرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على التجربة ، يمكن إما أن يكون ورقة قياس الأحجام ، أو يمكن استخدامها لاختبار الركام أو ميكانيكية أو البيوكيميائية للتحليل الجزيئي. </li></ol> 4. ممثل النتائج : ورقة أو تشكيل كروي يحدث عادة في غضون 24 ساعة ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول اعتمادا على نوع من الخلايا. الشكل 1 يمثل الصور الملتقطة بعد 18 ساعة من الحضانة من دون علاج خلايا سرطان البروستاتا (MLL) MAT - LyLu شنقا في ثقافة الإفلات (الشكل 1A) أو الخلايا المعالجة مع 25 ميكرومتر المانع PD98059 مجاهدي خلق. علما بأن نتائج العلاج مكي في الضغط واضح في ورقة الخلية. ويمكن قياس الضغط عن طريق قياس حجم 10-20 (أو أكثر) شنقا قطرات ومقارنة بين متوسط ​​حجم مجموعات العلاج. عادة ما نقوم بتحليل الصور باستخدام البرمجيات التي ImageJ thresholding كل صورة ثم تحويل الصور إلى الوضع الثنائي ، وعندها نطبق تحليل للكشف عن الجسيمات صورة المنطقة في إجمالي بكسل. ويمكن بعد هذا يمكن تحويلها بسهولة إلى ميكرون مربع. يمثل الشكل 2 مقارنة لحجم الخلايا غير المعالجة وMLL مكي المعاملة. كما لوحظ ، مكي العلاج يقلل بشكل ملحوظ مقارنة حجم ورقة من خلال اختبار - T الطالب (ف &lt;0.0001). لإجراء هذه المقارنة ، تم قياس 10 المجاميع لكل من الخلايا غير المعالجة والمعالجة. الشكل 3 يمثل كروي الفرخ الكبد الجنينية التي تشكلت بعد 24 ساعة معلقة في ثقافة الإفلات و 2 يوما في حمام شاكر. يمكن أيضا فحص قطرة شنقا يمكن تعديلها لتشمل اكثر من نوع من الخلايا للكشف عن المواقع المكانية المعتمدة. على سبيل المثال ، يمكن عزل الخلايا الجنينية الفرخ الكبد ، ملطخة صبغة الأغشية الفلورية الإقحام وخلطها مع خلايا القلب الجنينية الفرخ التي تم ملطخة علامة الفلورسنت مختلفة. ويبين الشكل 4A أنه بدلا من المتبقية مختلطة ، والكبد والقلب والخلايا تميل إلى &quot;خارج الفرز&quot; من جهة اخرى واحدة واعتماد المجال داخل واحد في مجال التكوين في خلايا القلب والتي يلفها من قبل خلايا الكبد. ويمكن تفسير هذا الاختلاف في التكوين عن طريق الالتصاق بين الخلايا بين خلايا الكبد والقلب. وتقنن هذا المفهوم في الالتصاق التفاضلية الفرضية التي تم استخدامها لتفسير سلوك الخلية الفرز بين الأنسجة الجنينية الجرثومية للطبقة البرمائيات 3 و 4 أجنة مكتملة العظام ، لتنظيم خلايا البنكرياس جزيرة لخلية (5) والفرز بين سكان الخلية متطابقتين طن كل احترام الآخرين من التعبير عن مستويات من نفس النوع من كادهيرين (6 و الشكل 4B). هذه النتيجة مهمة خاصة لإظهار كيف فرقا هندسية بسيطة في الالتصاق بين السكان الخلية قد ينتج جيل من هيكل الجهاز ، على سبيل المثال ، جزيرة البنكرياس 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صور من الخلايا المحتضنة في شنقا ثقافة الإفلات لمدة 18 ساعة اما في غياب (A) أو وجود (ب) من 25 ميكرون من مثبط PD98059 مجاهدي خلق. والتقاط الصور باستخدام الكسوف نيكون TE 300 epifluorescence المجهر والكاميرا الرقمية CoolSnap Photometrics ES. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. الكمي لمكي بفعل الضغط من الفئران خلايا البروستات MLL السرطان. وحضنت الثقافات قطرة شنقا من الخلايا غير المعالجة وMLL مكي المعاملة لمدة 18 ساعة عندها تم تحديد الحجم الإجمالي كما هو موضح أعلاه. وكان التحليل الإحصائي للحجم الكلي من قبل الطالب اختبار t. النجمة تمثل فروق ذات دلالة إحصائية في الحجم الكلي (P &lt;0.0001) بين الخلايا غير المعالجة والمعالجة مكي وتشير إلى أن النتائج مكي المعاملة في مجاميع أصغر بكثير وأكثر إحكاما. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3 ألف كروي شكلتها احتضان خلايا الكبد الجنينية في الفرخ شنقا ثقافة الإفلات لمدة 18 ساعة ثم في حاضنة / هز الحمام لمدة 48 ساعة. تم القبض على هذه الصورة باستخدام المجهر نيكون SMZ800 ستيريو وكاميرا سوني اتفاقية مكافحة التصحر الأسود. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. الشنق ثقافة الإفلات يكشف الفرز التدريجي السلوك بين أنواع مختلفة من الخلايا. في لوحة ألف ، تم صبغ الخلايا الجنينية الفرخ الكبد مع صبغة الإقحام PKH - 2 الغشاء ومختلطة في نسب متساوية مع PKH - 26 الخلايا الجنينية الفرخ القلب الملون. B في الفريق ، وكانت ملطخة أيضا اثنين من خلية L - N - كادهيرين transfected استنساخ (LN4 وLN2a) ، معربا عن N - نذل على سطوحها في نسبة 2.4:1 ، مع غشاء الأصباغ الفلورية الإقحام PKH - 2 و 26 PKH (سيغما الدريخ) ، مختلطة بنسب متساوية والمثقف كما شنقا قطرات 7. بعد 18 ساعة في الثقافة ، تم نقل صفائح الخلايا لقوارير تهتز والمحتضنة لمدة 48 ساعة. كانت ثابتة في المجاميع بارافورمالدهيد 2 ٪ في الفوسفات مخزنة المالحة وشوهدت مع BioRad MRC600 نظام ليزر متحد البؤر المسح المجهر المرفقة المجهر Optiphot - 2 نيكون. وقد تم جمع المقاطع البصرية على حد سواء من قنوات خضراء وحمراء وGraphix سيليكون محطة VGX قرمز مجهزة صور الحيوية استخدمت برامج التصوير فوكسل مشاهدة الترا لتعيين لون كاذبة لكلا القنوات ودمج الصور ، وكشف عن التكوينات التشريحية ولدت (A) القسم مبائر البصرية من خلال التظاهر التغليف الكلي لخلايا القلب (هنا في اللون الأصفر الزائفة) بواسطة خلايا الكبد في الزرقاء pseudocolor (من 8). (ب) القسم متحد البؤر البصرية من خلال التظاهر التغليف الكلي لخلايا N - كادهيرين عالية معربا عن (الأخضر) من قبل الذين يعبرون عن مستويات أقل من N - كادهيرين (أحمر) (من 6).

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices.">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signaling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li><li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-layer+surface+tensions+and+&amp;quot;tissue+affinities&amp;quot;+in+Rana+pipiens+gastrulae:+quantitative+measurements.">Germ-layer surface tensions and &amp;quot;tissue affinities&amp;quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li><li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle.">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing.">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li><li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wound+contraction:+collagen+organization,+fibroblasts,+and+myofibroblasts.">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li><li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li><li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures:+a+different+perspective+in+epithelial+biology.">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li><li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle.">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li><li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells.">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li><li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+structure,+nuclear+organization,+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast.">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li><li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma.">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li><li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد أظهرت الدراسات أن خلايا زراعة في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) تنتج التشكل الخلوية متميزة ويشير عند مقارنة جامدة ثنائي الأبعاد نظام الثقافة (2D) 9. على سبيل المثال ، والهلام الكولاجين الليفية المأهولة تثبت أن الخلايا الليفية في التشكل 3D يختلف تماما عن تلك التي لوحظت ...

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العداد التلقائي الخلية (BioRad TC10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هز حمام ماء مع 2 CO الجملون النموذجي تغطي 3540 (معمل الخط) </li></ul>

a simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids

تاريخيا دراسات خلية خلية والتلاحم ، والتصاق الخلايا التحتية التي أجريت على الثقافات المونولاير ملتصقة على ركائز صلبة. الخلايا داخل الأنسجة ، ولكن عادة ما تكون مغطاة داخل كتلة الأنسجة معبأة بشكل وثيق في الخلايا التي تنشئ صلات حميمة مع الدول المجاورة والقريبة من العديد من المكونات مع المصفوفة خارج الخلية. تبعا لذلك ، وبيئة والكيميائية والفيزيائية التي تعيشها القوات داخل خلايا الأنسجة 3D تختلف اختلافا جوهريا عن تلك التي يعاني منها الخلايا المزروعة في الثقافة أحادي الطبقة. وقد تبين أن تؤثر بشكل ملحوظ هذا التشكل الخلوي والإشارات. وقد وضعت العديد من الطرق لتوليد الخلايا 3D الثقافات بما في ذلك التغليف من الخلايا في المواد الهلامية الكولاجين 1 أو 2 في مادة بيولوجية السقالات. مثل هذه الأساليب ، وإن كان مفيدا ، لا ألخص الحميم المباشر العمارة خلية التصاق خلايا موجودة في الأنسجة الطبيعية. بدلا من ذلك ، كانوا أكثر بشكل وثيق في نظم الثقافة التقريبية التي فرقت فضفاضة داخل الخلايا واحد من المنتجات meshwork 3D ECM. هنا ، نحن تصف طريقة بسيطة في الخلايا التي يتم وضعها في قطرة شنقا الثقافة والمحتضنة في ظل الظروف الفسيولوجية حتى أنها تشكل الأجسام الشبه الكروية 3D الحقيقي في الخلايا التي هي على تماس مباشر مع بعضها البعض ومع مكونات المصفوفة خارج الخلية. الأسلوب لا يتطلب أي معدات متخصصة ويمكن تكييفها لتشمل إضافة أي عامل بيولوجي بكميات صغيرة جدا التي قد تكون ذات فائدة في توضيح الآثار المترتبة على خلية خلية أو تفاعل الخلايا ECM. ويمكن أيضا أن يستخدم الأسلوب إلى الثقافة المشتركة اثنين (أو أكثر) من السكان مختلفة من الخلايا وذلك لإلقاء الضوء على دور التفاعلات خلية خلية أو خلية ECM - في تحديد العلاقات المكانية بين الخلايا. خلية خلية والتلاحم ، والتصاق الخلايا ECM هي حجر الزاوية لدراسات التنمية الجنينية ، والتفاعل خلية الورم الخبيث في غزو انسجة ، التئام الجروح ، والتطبيقات للهندسة الأنسجة. وهذه الطريقة توفر وسيلة بسيطة لتوليد الأنسجة الخلوية مثل الركام لقياس الخصائص أو النشاط الحيوي للتحليل الجزيئية والكيمياء الحيوية في نموذج ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids at JoVE.com

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

وصفنا بسيطة ، طريقة سريعة لتوليد أنسجة 3D مثل الأجسام الشبه الكروية وإمكانية تطبيقها لقياس الاختلافات في خلية خلية التفاعلات.

إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

56.6K Views.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. وصفنا بسيطة ، طريقة سريعة لتوليد أنسجة 3D مثل الأجسام الشبه الكروية وإمكانية تطبيقها لقياس الاختلافات في خلية خلية التفاعلات.

Video: A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

إعداد الفايبرين 3D السقالات لتطبيقات الجذعية زراعة الخلايا

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

جيل واسترداد خلايا β الأجسام الشبه الكروية من الهلاميات المائية PEG-الببتيد الخطوة النمو

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D هيدروجيل السقالات لالمفصلي خلية غضروفية الثقافة والجيل الغضروف

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

الانضباطي الهلاميات المائية من الرئوي خارج الخلية مصفوفة للثقافة خلية 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

بناء ورقة الطبقات الوسيطة من الخلايا الجذعية مع نظام 3D دينامية الثقافة

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

الإنتاج الآلي على نطاق واسع من الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون كروية للطباعة الحيوية 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

توليد البيئات الدقيقة الخلوية متعددة الإشارات عن طريق التنميط الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية لركائز زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

توليد ، فحص عالي الإنتاجية ، وبنوك حيوية للكرويات القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...