بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA051008 وT32 CA009686 (ATR).

1. توليد الأجسام الشبه الكروية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وحيدة الخلية تعليق لتعليق الثقافات قطرة فصل الثقافات الخلايا السرطانية ملتصقة من ~ 70٪ التقاء باستخدام PBS غسل تليها التعرض إلى 0.05٪ التربسين-EDTA الحل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد الحل التربسين مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وعدد الخلايا باستخدام قسامة لتعليق الخلية. ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة الخلية معينا سوف تعتمد على خط الخلية التي يجري اختبارها. اتبع توصيات سائل الإعلام ATCC، حيث وسائل الإعلام ثقافة الخلية عادة DMEM + 10٪ FBS. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات في جدول المواد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء تخفيف للسماح لزرع البذور من 500-1،000 الخلايا في 20 قطرة ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صحن 10 سم وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى أسفل. ملاحظة: هذه الخطوة تحمي قطرات شنقا من التبخر. من حيث التكلفة أقل &quot;الصف البكتريولوجية&quot; أطباق يمكن استخدامها في مكان من الأطباق الصف زراعة الخلايا، وكذلك الخلايا لا تابعالتصرف سطح الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماصة متعدد القنوات لنقل 20 قطرات ميكرولتر من تعليق خلية المخفف إلى السطح الداخلي للغطاء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 40 قطرات (5 صفوف من 8 قطرات) على غطاء صحن 10 سم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس الغطاء ومكان على طبق الثقافة. احتضان الثقافات قطرة شنقا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتوليد الأجسام الشبه الكروية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوجه الغطاء في اثقة، الطريقة التي تسيطر عليها حتى الان. ملاحظة: للقلب غطاء سريعة جدا أو بطيئة جدا قد يسبب قطرات للتحول. بعض خطوط الخلايا قد شكل الكروية في 48 ساعة أو أقل، في حين أن البعض الآخر قد يتطلب أكثر من 72 ساعة لإنتاج الركام المدمجة. </li></ol></li></ol> 2. تضمين من الأجسام الشبه الكروية في مصفوفة 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من النمو انخفاض عامل الطابق السفلي المواد غشاء عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل تضمين الكروية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: آبار طبقة مع ECM مقدما لمنع التفاعل كروي محتمل مع cultu الأنسجةإعادة السطح. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 200 ميكرولتر من ECM لكل بئر في لوحة 24-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إمالة لوحة للتأكد من أن ECM يغطي السطح جيدا بأكمله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ECM الزائد مع الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة حتى آبار جافة: 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكروية عن طريق إمالة غطاء صحن زراعة الأنسجة وتجمع وسائل الإعلام. نقل وسائل الإعلام مع الكروية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سماح 10 دقيقة للالكروية ليستقر على الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. وينبغي أن يكون الكروية مرئية بالعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج 100 ميكرولتر من المواد الغشاء القاعدي مع 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) النوع الأول من الكولاجين في أنبوب قبل المبردة منفصل. نضع الخليط في 4 درجات مئوية لمنع أي هلام من ترسيخ قبل الأوان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نصائح الماصة قبل المبردة إذا نقل كميات صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم الرعاية عندماخلط المواد الغشاء القاعدي والكولاجين النوع الأول لمنع تشكيل فقاعة الهواء. ملاحظة: فقاعات الهواء قد تعيق التصوير في وقت لاحق في البروتوكول إذا أصبحت جزءا لا يتجزأ من هلام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح الكروية من 40 ميكرولتر الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge، ويتحد مع المواد الغشاء القاعدي / النوع الأول الكولاجين الخليط. كن حذرا لمنع تشكيل فقاعة الهواء عند خلط. ملاحظة: محلول يحتوي على 100 ميكرولتر المواد الغشاء القاعدي، 100 نوع ميكرولتر أنا الكولاجين، و 40 ميكرولتر من الكروية سيخلق ما يكفي من المواد لمدة 4 الثقافات 3D مستقلة. يمكن زيادتها هذا أعلى أو لأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 40 قطرات ميكرولتر من مزيج لزج في مراكز الآبار على طبق من ذهب 24-جيدا. يحافظ على لوحة لمنع خليط من الوقوع في جانب البئر. ملاحظة: A عمود واحد على لوحة 24-جيدا - يوصى لكل حالة لفحصها - 4 آبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة الباحثالزراعة العضوية 37 ° C الحاضنة وترك دون عائق لمدة 30 دقيقة. إن ثقافة 3D تتبلمر خلال هذه الفترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغرق ببطء الثقافات 3D في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن وسائل الإعلام دافئة عند إضافته إلى الآبار لزيادة تعزيز هلام البلمرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطوة حاسمة: إضافة بلطف وسائل الإعلام على ثقافات 3D. يمكن pipetting لوسائل الإعلام بسرعة كبيرة جدا في الآبار يؤدي إلى مفرزة من الثقافات 3D من سطح زراعة الأنسجة. </li></ol></li></ol> 3. رصد وتحليل كروي الغزو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غزو ​​صورة من الكروية في مصفوفة 3D المحيطة في نقطة زمنية قررت من قبل المحقق. الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب مع عدسة الهدف 20X. ملاحظة: تختلف مثالية نقاط الوقت اعتمادا على خط الخلية التي يجري اختبارها. وسوف تبدأ خطوط الخلايا أكثر الغازية الخروج بهم من الكروية بعد وقت قصير من الطلاء، وبالتالي تأخذ صورة أوليةالصورة في غضون بضع ساعات بعد الطلاء. عموما، يتم أخذ الصور في 0 ساعة (بعد الطلاء)، 24 ساعة، و 48 ساعة. الغزو يخلص عادة 24 إلى 48 ساعة بعد الطلاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Quantitate القدرة الغازية باستخدام برمجيات تحليل الصور مثل صورة J. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الغزو والمسافة خلية من على حافة كروي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة رسم مستقيم بمناسبة دائرة نصف قطرها و / أو المسافة الغازية القصوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;تحليل&quot; في القائمة العلوية، ثم انقر فوق &quot;القياس&quot; لعرض قياس الطول. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل الغزو كما إجمالي المساحة الغازية خارج كروي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أداة رسم حر لتتبع حدود كروي و / أو المساحة الإجمالية الغازية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر على زر &quot;تحليل&quot; في القائمة العلوية، ثم انقر فوق &quot;القياس&quot; لعرض قياس المنطقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج المساعد مثل أدوات إدارة ROI لخلق قياسات كومة من الصور. </li></ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites.">Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).</li><li>Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue-specific+signaling+and+organ+function+in+three+dimensions.">Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions.</a> J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).</li><li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D.">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), (2007).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J Vis Exp. 51, (2011).</li><li>Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+preparation+from+hanging+drops:+characterization+of+a+model+of+brain+tumor+invasion.">Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion.</a> J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).</li><li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays.">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. 88, (2014).</li><li>Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+matrix+metalloproteinase-9+(MMP-9)+via+a+converging+plasmin/stromelysin-1+cascade+enhances+tumor+cell+invasion.">Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion.</a> J Bio Chem. 274 (19), .</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+Basement+membrane+matrix+with+biological+activity.">Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li><li>Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+integrin+&#945;6&#946;1+in+metastatic+breast+carcinoma+cells+assessed+by+expression+of+a+dominant-negative+receptor.">Function of the integrin &#945;6&#946;1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor.</a> Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), (2010).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cot&#233;, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), (2006).</li><li>Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion.">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), (2006).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Brenner, W., Gro&#223;, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Th&#252;roff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+inhibition+of+renal+cancer+cell+invasion+mediated+by+fibronectin,+collagen+IV+and+laminin.">Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin.</a> Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).</li><li>Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+promotes+motility+in+human+breast+cancer+cells+regardless+of+their+E-cadherin+expression.">N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression.</a> J Cell Biol. 147 (3), .</li><li>Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+invasion+in+breast+cancer+requires+a+conserved+basal+epithelial+program.">Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program.</a> Cell. 155 (7), (2013).</li><li>Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+I+but+not+Matrigel+matrices+provide+an+MMP-dependent+barrier+to+ovarian+cancer+cell+penetration.">Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration.</a> BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).</li><li>Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+ductal+elongation+and+myoepithelial+migration+are+regulated+by+the+composition+of+the+extracellular+matrix.">Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix.</a> J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).</li><li>Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+circulating+metastatic+cells+produced+in+orthotopic+but+not+ectopic+prostate+cancer+models.">Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models.</a> Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

قيمت هذه الدراسة أداء لجنة من خطوط الخلايا السرطانية في مقايسة غزو كروي (الجدول 1). عموما، نجد أن تتعزز تشكيل كروي في المزيد من خطوط الخلايا الظهارية المظهر، حيث وجود تقاطعات خلية خلية يشجع على تشكيل بنية تشبه كروي. خطوط الخلايا المعروفة التي خضعت لالانتقالي?...

ثبت أن الحركة الخلايا السرطانية هي التنبؤية المحتملة المتنقل، بالنظر إلى أن مثل هذا السلوك يسهل الغزو من خلال الغشاء القاعدي والدخول في الدورة الدموية 1. وقد ركزت معظم البحوث على الحركة على كيفية سلوك الخلايا في ثنائي الأبعاد (2D) الإعداد، على الرغم من أنه أصبح من المسلم به على نطاق واسع أن حركة الخلايا في ثلاثية الأبعاد (3D) المصفوفة هي أكثر تمثيلا لكيف يمكن لهذه الخلايا نفسها سوف فعلا تتصرف في الجسم الحي 2. وتستخدم نظم الاستزراع 3D على نحو متزايد لدراسة السلوكيات الخلوية التي تتراوح من مورفولوجيا الخلايا، لحركية النمو وحساسية العقاقير 3. وقد أدى الرغبة في رصد سرطان غزو الخلايا في إطار محيط 3D لتوليف التقنيات المحددة سابقا التي تنطوي على جيل من المجاميع خلية 3D (الكروية) عن طريق أسلوب ثقافة الإفلات شنقا 4، تليها تضمين هذه الأجسام الشبه الكروية إلى خارج الخلية 3D مصفوفة (ECM) تتألف من الكولاجين والغشاء القاعدي المواد 5. ويسعى هذا الأسلوب إلى تحسين هذه التقنيات المحددة سابقا من خلال توفير نهج مبسط التي يمكن استخدامها بسهولة لمقارنة الغزو في إطار مجموعة من الظروف التجريبية. الطرق التقليدية أكثر لتقييم حركية الخلية في المختبر هي فحص الجرح الصفر وفحص transwell 6. الفحص السابق يصور حركية الخلية في وضع 2D، وبالتالي فهي مستقلة عن مجموعة متنوعة من الميزات الهامة في الجسم الحي الغزو، مثل نشاط الأنزيم البروتيني 7. مقايسة transwell يمكن غزو الخلايا نموذج أفضل عندما تكون مغلفة يدرج بشكل جيد مع ركائز ECM، ولكن فقط معلمة واحدة، أي ظهور الخلايا على العكس سطح غشاء يقاس، والعديد من الفروق الدقيقة من غزو الخلايا وبالتالي لا يمكن ملاحظتها بسهولة. وعلى النقيض من هذه التقنيات، وفحص الخلايا السرطانية غزو كروي (الشكل 1 &lt;/ قوي&gt;) يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من غزو الخلايا في إعداد هذا ليس من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة فقط، ولكن أيضا يسمح الميزات الهامة خلية خط محدد لأن تصور، مثل هجرة الخلايا الفردية مقابل الجماعية 8. هذا الأسلوب يتيح أيضا مزايا أكثر من فحوصات النمو الثقافة 3D القياسية. توليد المجاميع الخلوية عبر طريقة انخفاض شنقا يحد في البداية حركة الخلية، بحيث يتم تحفيز الخلايا لغزو بعد رفع هذا القيد. وعلاوة على ذلك، حالما يتم رفع هذا القيد، والخروج خلية تسير في اتجاه موحد ويمكن بعد ذلك quantitated مريح. المواد ECM الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا السرطانية الكروية المقايسات Matrigel والنوع الأول الكولاجين، حيث كل عنصر من هذه العناصر أدوارا هامة ومميزة في التأثير على سلوك النقيلي. Matrigel هو خليط يفرز من البروتينات التي تنتجها الخلايا ساركوما Engelbreth-هولم سرب الماوس، وأثرت في basemeبروتينات الغشاء الإقليم الشمالي مثل laminin، entactin، والنوع الرابع الكولاجين 9. لهذا السبب Matrigel يشار من الآن فصاعدا باسم &quot;المواد الغشاء القاعدي&quot;. وتوفر هذه المواد الغشاء القاعدي بروابط الأساسية اللازمة لإنتغرين التصاق خلال السرطان غزو الخلايا 10 بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى التي تمارس مجموعة من الآثار على سلوك الخلية 11. في المقابل، النوع الأول الكولاجين، الذي أعد عادة من هضم الحمض الأوتار والهياكل الكولاجينية الكثيفة، 12، هو مادة مصفوفة أبسط من ذلك بكثير التي هي بمثابة العنصر الهيكلي الرئيسي للأنسجة وسدى دعم الأنسجة والأعضاء الضام في الجسم. وقد ثبت أن الخصائص الفيزيائية للالكولاجين يمكن أن تنظم عددا من ملامح الحركة الخلية؛ على سبيل المثال، في محاذاة الألياف الكولاجين في واجهة للورم انسجة تسمح الخلايا السرطانية للهجرة في وقت لاحق على طول تلك الألياف عند غزو في سدى 13. في مقايسة المقدمة هنا، سواء النوع الأول الكولاجين ويتم استخدام المواد الغشاء القاعدي وسيلة لدراسة سرطان 3D خلية سدى التفاعلات. تأثير تثبيط أو تنشيط مسارات التي تتحكم يمكن رصدها الغزو بعد أن تم جزءا لا يتجزأ من الخلايا في مصفوفة 3D. يمكن سابقة التجهيز الخلايا أثناء النمو في قطرات شنقا أو عند نقله الى ثقافة 3D، اعتمادا على ما إذا كان سوف تكون هناك حاجة إلى علاج طويل لتعديل الغزو. لعلاج أقصر، فمن المستحسن أن العقار أن تكون مختلطة مع تعليق كروي بعد جمع، وكذلك وسائل الإعلام التي ستحيط الثقافات 3D، لتسهيل التعرض الكافي للخلايا المخدرات. المقبل، خلايا انسجة طبيعية أو المرتبطة الورم يمكن ممزوجة مع مواد مصفوفة لتقييم دورها في تحوير غزو الخلايا السرطانية، أو لتحديد كيفية يشير التأثيرات سلوك الخلية نظير الصماوي وautocrine. وقد أظهرت هذه الفكرة في الدراسة حيث coculture من العقيدعلى السرطانية والخلايا البطانية في قطرات شنقا أدى إلى شبكة الأوعية الدموية داخل الكروية 14. وأخيرا، يمكن أيضا مكونات ECM يمكن تغييرها، كما يتأثر غزو الخلايا السرطانية عن طريق ركائز مختلفة 15. وبالتالي فإن الطريقة المعروضة أدناه إطارا لتقييم غزو الخلايا السرطانية في إطار مجموعة من الشروط. بشكل عام تبين أن ليس جميع خطوط الخلايا خلق الكروية في قطرات شنقا وخطوط الخلايا الظهارية المظهر عادة تشكل مجالات العادية.

<table><tbody><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg</td><td>Millipore</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-treated Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>24-well TC-treated Plates</td><td>NEST Biotechnlology</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Inverted Microscope</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3d setting

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

تم اختبار باستخدام مقايسة غزو كروي (الشكل 1)، فريق من خطوط الخلايا السرطانية لقدرتها على تشكيل الأجسام الشبه الكروية، فضلا عن كمية من الخروج خلية عرضت بعد زرع في مصفوفة 3D تتكون من مواد الغشاء القاعدي والنوع الأول الكولاجين (الجدول 1). هذه النتائج تثب?...

Watch this Scientific Journal Video about A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting at JoVE.com

A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential.  Most traditional assays, however, do not examine these ...

a-cancer-cell-spheroid-assay-to-assess-invasion-in-a-3d-setting

Research

JoVE Journal

Medicine

32.5K Views.  Georgetown University. This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored. 

Video: A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Fully Human Tumor-based Matrix in Three-dimensional Spheroid Invasion Assay

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor microenvironment. To obtain more reliable in vitro results, several three-dimensional (3D) cell culture assays have been introduced. These assays allow cancer cells to interact with the extracellular matrix. This interaction affects cell behavior, such as proliferation and invasion, as well as cell morphology. Additionally, this interaction could induce or suppress the expression of several pro- and anti-tumorigenic molecules. Spheroid invasion assay was developed to provide a suitable 3D in vitro method to study cancer cell invasion. Currently, animal-derived matrices, such as mouse sarcoma-derived matrix (MSDM) and rat tail type I collagen, are mainly used in the spheroid invasion assays. Taking into consideration the differences between the human tumor microenvironment and animal-derived matrices, a human myoma-derived matrix (HMDM) was developed from benign uterus leiomyoma tissue. It has been shown that HMDM induces migration and invasion of carcinoma cells better than MSDM. This protocol provided a simple, reproducible, and reliable 3D human tumor-based spheroid invasion assay using the HMDM/fibrin matrix. It also includes detailed instructions on imaging and analysis. The spheroids grow in a U-shaped ultra-low attachment plate within the HMDM/fibrin matrix and invade through it. The invasion is daily imaged, measured, and analyzed using ilastik and Fiji ImageJ software. The assay platform was demonstrated using human laryngeal primary and metastatic squamous cell carcinoma cell lines. However, the protocol is suitable also for other solid cancer cell lines.

Tumor microenvironment is an essential part of cancer growth and invasion. To mimic carcinoma progression, a biologically relevant human matrix is needed. This protocol introduces an improvement for the in vitro three-dimensional spheroid invasion assay by applying a human leiomyoma-based matrix. The protocol also introduces a computer-based cell invasion analysis.

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

Two-dimensional cell culture-based assays are commonly used in in vitro cancer research. However, they lack several basic elements that form the tumor ...

Cancer Research

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

نماذج 3D في بيولوجيا السرطان: ديناميات الغزو في الهيتروسفير

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

تسليط الضوء على المؤلف: فك رموز الحديث المتبادل بين السرطان والخلايا المناعية أثناء تطور سرطان الرأس والرقبة

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

<meta charset="utf8"></head><body>فحص التفاعلات الكروية بين البلاعم والورم في إعداد مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد

A Macrophage-Tumor Spheroid Co-Invasion Assay

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few protocols are available that allow an in vitro approximation of the in vivo situation. Here, we present a novel approach to observing the impact of human macrophages on the invasiveness of cancer cells, using tumor spheroids of H1299 non-small cell lung carcinoma cells embedded in a three-dimensional (3D) collagen I matrix. With this co-cultivation setup, we tested the impact of small interfering RNA (siRNA)-based depletion of regulatory factors in macrophages on the 3D invasion of cancer cells from the tumor spheroid compared to controls. This method allows the determination of different parameters, such as spheroid area or the number of invading cancer cells, and thus, to detect differences in cancer cell invasion. In this article, we present the respective setup, discuss the subsequent analysis, as well as the advantages and potential pitfalls of this method.

<meta charset="utf8"></head><body>اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي

Here, we present a protocol to investigate the interaction of primary human monocyte-derived macrophages with a tumor spheroid in a three-dimensional (3D) collagen I matrix, with the possibility to compare the impact of soluble and physical properties of the microenvironment on cell invasion.

اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي

The interaction of immune and cancer cells and their respective impact on metastasis represents an important aspect of cancer research. So far, only a few ...

خلية السرطان كروي الفحص لتقييم الغزو في إعداد 3D

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

بالبالكامل الإنسان القائم علي الورم مصفوفة في ثلاثه الابعاد كروي الغزو الفحص

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

رصد غزو الخلايا السرطانية والسمية الخلوية للخلايا T-Cell في الثقافة ثلاثية الأبعاد

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

استراتيجية بديلة لتحليل غزو الخلايا في المختبر من الثقافات 3D

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي

اختبار الغزو المشترك للبلاعم والورم الكروي