המחבר מבקש להודות לד&quot;ר Dongxuan ג&#39;יאה לקבלת סיוע טכני. חלק מן התמונות המופיעות במאמר זה היו בשיתוף עם ד&quot;ר מלקולם ש שטיינברג, המחלקה לביולוגיה מולקולרית, אוניברסיטת פרינסטון. המחבר רוצה גם להודות משרד הביטחון תוכנית סרטן הערמונית מחקר (מענקים-PC ו-PC 030,482 991,552) ו / NCI NIH (מענק R01CA118755) על תמיכתם הנדיבה.

1. הכנת תרחיף תא בודד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתרביות תאים חסיד צריך להיות מבוגר כדי מפגש 90%, monolayers ואז יש לשטוף פעמיים עם PBS. לאחר ניקוז טוב, להוסיף 2 MLS (עבור 100 צלחות מ&quot;מ) של 0.05% טריפסין-1 mM EDTA, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עד תאים לנתק. עצור trypsinization ידי הוספת 2 MLS של המדיום להשלים בעדינות להשתמש פיפטה 5 מ&quot;ל ל triturate את התערובת עד התאים בתרחיף. העברת התאים צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​DNAse מניות דגירה במשך 5 דקות ב RT. וורטקס בקצרה צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף עם גלולה 1 מ&quot;ל להשלים בינוני רקמה תרבות. חזור, ואז התאים resuspend ב 2 MLS של המדיום רקמה שלמה תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות hemacytometer, או נגד תא אוטומטיות ולהתאים הריכוז 2.5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. להדגמה זו מונה TC10 BioRad תא אוטומטי היה בשימוש. </li></ol> 2. כינונה של טיפות תלויות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסה צלחת 60 מ&quot;מ רקמת תרבות מקום 5 MLS של PBS בתחתית הצלחת. זה ישמש חדר הידרציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה להשתמש pipettor 20 μl להפקיד 10 טיפות μl על החלק התחתון של המכסה. ודא כי טיפות ממוקמים מספיק מזה כדי לא לגעת. אפשר במקום לפחות 20 טיפות לכל מנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המכסה על חדר-PBS מלא התחתונה לדגור על 37 ° CO 5 / 2% / 95% לחות, לעקוב אחר טיפות יומי לדגור עד או יריעות התא או אגרגטים יצרו. מיקרוסקופ סטריאופוני ניתן להשתמש כדי להעריך את היווצרות המצרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצורת יריעות, הם יכולים להיות מועברים מסביב לתחתית הכוס שייקר צלוחיות המכילות 3 של ה-MLS בינוני מלא מודגרות באמבט מים רועד ב 37 ° C ו 5% CO 2 עד טופס spheroids. </li></ol> 3. הערות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לגודל התא, ריכוז ייתכן שיהיה צורך להתאים למעלה או למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכולים להיות מוכתמים קרום intercalating צבעי ניאון לפני היווצרות טיפת תלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני סוגי תאים שונים יכול להיות מוכתם דיפרנציאלי מעורב ביחס 1:1 (או אחר) לפני היווצרות של טיפות תלויות. אלו יכולים להיות סרטן סטרומה תאים, רקמות עובריים או תאים מהונדסים גנטית יש חתימות דבק ספציפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים יכולים להיות מנותקת מן הכלים התרבות רקמות באמצעות טריפסין 0.05% / 2 mM סידן כדי לשמור על תפקוד cadherin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם הניסוי, בגדלים גיליון יכול להימדד, או אגרגטים יכול לשמש לבדיקות מכניות או לצורך ניתוח ביוכימי או המולקולרית. </li></ol> 4. נציג תוצאות: גיליון או היווצרות spheroid מתרחשת בדרך כלל תוך 24 שעות, אך עשוי להימשך זמן רב יותר, תלוי בסוג התא. איור 1 מייצג את התמונות שנתפסו לאחר 18 שעות של דגירה של מטופל הערמונית MAT-LyLu סרטן (MLL) התאים תלוי תרבות טיפה (איור 1A) או תאים שטופלו 25 מיקרומטר MEK מעכב PD98059. שים לב כי תוצאות הטיפול ב MEKi דחיסה ניכרת של גיליון התא. דחיסת ניתן לכמת על ידי מדידת גודל של 10-20 (או יותר) תלוי טיפות השוואת הגודל הממוצע בין קבוצות הטיפול. אנחנו בדרך כלל לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ImageJ ידי thresholding כל תמונה אז המרת תמונות מצב בינארי, ואז אנחנו מיישמים ניתוח החלקיקים כדי לחשוף את אזור התמונה הכוללת פיקסלים. לאחר מכן ניתן להמיר בקלות מיקרון מרובע. תרשים 2 מייצג השוואה גודל התאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו. כאמור, הטיפול MEKi מפחית באופן משמעותי את גודל גיליון בהשוואה ידי הסטודנטים של מבחן t (p &lt;0.0001). לשם השוואה זו, 10 מצרפי עבור כל אחד בתאים שלא טופלו ומטופלים נמדדו. איור 3 מייצג כבד עובריים חומוס spheroid נוצרו לאחר 24 שעות תלוי תרבות ירידה ו 2 ימים באמבטיה שייקר. Assay הירידה תלוי גם יכול להיות שונה כדי לכלול יותר מסוג אחד לתא כדי לחשוף את המיקום המרחבי מאומץ. לדוגמה, תאים עובריים חומוס כבד יכול להיות בודד, מוכתמת צבע קרום intercalating פלורסנט מעורבב עם חומוס תאים עובריים לב, כי כבר מוכתם פלורסנט סמן שונים. מראה איור 4A כי במקום הנותרים intermixed, בתאי הכבד והלב נוטים &quot;מחוץ למיין&quot; מתוך אחד אחר ולאמץ כדור, בתוך-a-כדור תצורה בה לתאי לב אפופים בתאי הכבד. תצורה זו ניתן להסביר את ההבדלים בין הידבקות אינטר הכבד ותאי לב. תפיסה זו היא קודיפיקציה של השערה ההפרש הידבקות אשר שימש להסביר תא מיון התנהגות בין רקמות נבט עובריים שכבת דוחי 3 ו 4 teleost עוברים, עבור הארגון איון תא לבלב 5 ועבור התא מיון בין שתי אוכלוסיות תאים זהים in כל הכבוד אחר מאשר עבור רמות ביטוי של אותו סוג של cadherin (6 ואיור 4B). תוצאה זו חשובה במיוחד עבור המדגים כיצד הנדסה הבדל פשוט הידבקות בין אוכלוסיות תאים עלול לגרום לדור של מבנה האיבר, למשל, לבלב 5. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תמונות של תאים מודגרות ב תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות או בהעדר (א) או נוכחות (B) של 25 מיקרומטר של מעכב ה-MEK PD98059. תמונות שנתפסו באמצעות Eclipse Nikon TE 300 מיקרוסקופ epifluorescence ו CoolSnap Photometrics ES מצלמה דיגיטלית. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. כימות הדחיסה MEKi-Induced של עכברוש הערמונית תאים סרטניים MLL. תרבויות ירידה התלויים של תאים MLL מטופלים ו MEKi שטופלו הודגרו במשך 18 שעות ואז גודל מצטבר נקבע כפי שתואר לעיל. ניתוח סטטיסטי של גודל המצרפי היה על ידי סטודנטים של t-test. כוכבית מייצג הבדל משמעותי סטטיסטית בגודל המצרפי (P &lt;0.0001) בין תאים שלא טופלו ו MEKi שטופלו ומציע MEKi טיפול תוצאות אגרגטים קטנים משמעותית וקומפקטי יותר. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Spheroid שהוקמה על ידי דוגרים תאים עובריים חומוס כבד תלוי תרבות ירידה במשך 18 שעות לאחר מכן באינקובטור / רועד באמבטיה במשך 48 שעות. תמונה זו נתפס באמצעות מיקרוסקופ SMZ800 Nikon סטריאו מצלמה Sony CCD שחור. <img src="/files/ftp_upload/2720/2720fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. התלויים בתרבות ירידה מגלה מיון החוצה התנהגות בין סוגי תאים שונים. בפאנל, תאים עובריים חומוס כבד הוכתמו לצבוע intercalating PKH-2 קרום מעורב בשיעורים שווים עם PKH-26 תאים עובריים מוכתם חומוס לב. בלוח ב &#39;, שני N-cadherin-transfected תא L שיבוטים (LN4 ו LN2a), מביע N-CAD על השטח שלהם ביחס של 2.4:1, הוכתמו גם עם צבעי ניאון קרום intercalating PKH-2 ו PKH-26 , (סיגמא אולדריץ &#39;), מעורבות בשיעורים שווים ותרבותיים כמו תלויים 7 טיפות. לאחר 18 שעות בתרבות, סדינים תא הועברו צלוחיות רועד מודגרות לעוד 48 שעות. המצרפים היו קבועים paraformaldehyde 2% פוספט שנאגרו מלוחים וראו עם BioRad MRC600 סריקת מערכת לייזר confocal מיקרוסקופ המחובר למיקרוסקופ Nikon Optiphot-2. סעיפים אופטי מערוצים הן ירוק ואדום נאספו Graphix הסיליקון Crimson עבודה VGX מצויד תמונות ויטל Voxel צפה תוכנה Ultra הדמיה נעשה שימוש כדי להקצות צבע שווא לשני ערוצים למזג את התמונות, חושף את תצורות אנטומי שנוצר. (א) סעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים לב (כאן צבע פסאודו צהוב) על ידי תאים בכבד pseudocolor כחול (מתוך 8). (ב) בסעיף אופטי Confocal באמצעות כיתור הוכחת המצרפי של תאים גבוה N-cadherin להביע (ירוק) על ידי אלה להביע רמות נמוכות יותר של N-cadherin (אדום) (מתוך 6).

<ol>
	<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices.">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li><li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+extracellular+matrix,+scaffolds,+and+signaling:+tissue+architecture+regulates+development,+homeostasis,+and+cancer.">Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 287-309 (2006).</li><li>Davis, G. S., Phillips, H. M., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-layer+surface+tensions+and+&amp;quot;tissue+affinities&amp;quot;+in+Rana+pipiens+gastrulae:+quantitative+measurements.">Germ-layer surface tensions and &amp;quot;tissue affinities&amp;quot; in Rana pipiens gastrulae: quantitative measurements.</a> Dev Biol. 192, 630-644 (1997).</li><li>Schotz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+differences+in+tissue+surface+tension+influence+zebrafish+germ+layer+positioning.">Quantitative differences in tissue surface tension influence zebrafish germ layer positioning.</a> HFSP J. 2, 42-56 (2008).</li><li>Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+surface+tensions+guide+in+vitro+self-assembly+of+rodent+pancreatic+islet+cells.">Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells.</a> Dev Dyn. 236, 2039-2049 (2007).</li><li>Foty, R. A., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differential+adhesion+hypothesis:+a+direct+evaluation.">The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation.</a> Dev Biol. 278, 255-263 (2005).</li><li>Li, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+casein+kinase+2+subunits+in+Chinese+hamster+ovary+and+3T3+L1+cells+provides+information+on+the+role+of+the+enzyme+in+cell+proliferation+and+the+cell+cycle.">Expression of the casein kinase 2 subunits in Chinese hamster ovary and 3T3 L1 cells provides information on the role of the enzyme in cell proliferation and the cell cycle.</a> J Biol Chem. 274, 32988-32996 (1999).</li><li>Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+tensions+of+embryonic+tissues+predict+their+mutual+envelopment+behavior.">Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior.</a> Development. 122, 1611-1620 (1996).</li><li>Wendt, D., Riboldi, S. A., Cioffi, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+and+bottlenecks+of+bioreactors+in+3D+cell+culture+and+tissue+manufacturing.">Potential and bottlenecks of bioreactors in 3D cell culture and tissue manufacturing.</a> Adv Mater. 21, 3352-3367 (2009).</li><li>Berry, D. P., Harding, K. G., Stanton, M. R., Jasani, B., Ehrlich, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+wound+contraction:+collagen+organization,+fibroblasts,+and+myofibroblasts.">Human wound contraction: collagen organization, fibroblasts, and myofibroblasts.</a> Plast Reconstr Surg. 102, 124-131 (1998).</li><li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+biology+in+three-dimensional+collagen+matrices.">Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices.</a> Trends Cell Biol. 13, 264-269 (2003).</li><li>Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+beta1-integrin+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+three-dimensional+basement+membrane+breast+cultures:+a+different+perspective+in+epithelial+biology.">Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14821-14826 (1998).</li><li>Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies.">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li><li>Boudreau, N., Werb, Z., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+apoptosis+by+basement+membrane+requires+three-+dimensional+tissue+organization+and+withdrawal+from+the+cell+cycle.">Suppression of apoptosis by basement membrane requires three- dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 3509-3513 (1996).</li><li>Croix, B., Rak, J. W., Kapitain, S., Sheehan, C., Graham, C. H., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+by+hyaluronidase+of+adhesion-dependent+multicellular+drug+resistance+in+mammary+carcinoma+cells.">Reversal by hyaluronidase of adhesion-dependent multicellular drug resistance in mammary carcinoma cells.</a> J. Nat. Cancer Inst. 88, 1285-1296 (1996).</li><li>Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+structure,+nuclear+organization,+and+gene+expression+in+normal+and+malignant+breast.">Tissue structure, nuclear organization, and gene expression in normal and malignant breast.</a> Cancer Res. 59, 1757-1763 (1999).</li><li>Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+tumor+spheroid+in+a+microgravity+environment+as+a+3D+model+of+melanoma.">Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 45, 523-534 (2009).</li><li>Napolitano, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+three-dimensional+cell+culture+utilizing+micromolded+nonadhesive+hydrogels.">Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels.</a> Biotechniques. 43, 494-496 (2007).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103, 655-663 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מחקרים הראו כי תאי culturing בהקשר תלת ממדי (3D) מייצרת מורפולוגיה הסלולר איתות מובהק בהשוואה מערכת נוקשה (2D) דו מימדי התרבות 9. לדוגמה, פיברובלסטים המאוכלסים ג&#39;ל קולגן להוכיח כי מורפולוגיה פיברובלסטים ב-3D ​​הוא שונה לגמרי מזו שנצפתה 2D 10,11. באופן דומה, תרבות 3D ?...

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא דלפק אוטומטי (BioRad TC10) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רועד אמבט מים עם דגם ה-CO 2 גמלון לכסות 3540 (Lab-line) </li></ul>

a simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3d spheroids

מחקרים על לכידות התא התא התא תשתית הידבקות יש היסטורית שבוצעה על תרבויות monolayer חסיד מצעים נוקשה. תאים בתוך הרקמה, עם זאת, הם בדרך כלל עטוף בתוך מסת רקמת וצפופים שבו תאים ליצור חיבורים אינטימיים עם כמעט שכנים רבים עם רכיבים תאי מטריקס. לפיכך, המילייה כימיים כוחות פיזיים שחווים תאים בתוך רקמה 3D שונות באופן מהותי מאלה שחוו התאים גדל בתרבות monolayer. זה הוכח במידה ניכרת השפעה מורפולוגיה איתות הסלולר. כמה שיטות כבר המציאו כדי ליצור תרביות תאים 3D כולל אנקפסולציה של תאים ג&#39;ל קולגן 1 או ביולוגי פיגומים 2. שיטות כאלה, בעוד שימושי, לא לשחזר את האדריכלות אינטימי ישיר תאים תאים הידבקות למצוא רקמות נורמליות. במקום זאת, הם יותר מקרוב מערכות תרבות המשוער שבו תאים בודדים מפוזרים באופן רופף בתוך meshwork 3D של מוצרי ECM. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה שבה תאים ממוקמים תלוי תרבות טיפה מודגרות בתנאים פיסיולוגיים עד שהם יוצרים spheroids 3D אמיתי שבו תאים נמצאים בקשר ישיר אחד עם השני עם רכיבים תאי מטריקס. השיטה אינה דורשת ציוד מיוחד והוא יכול להיות מותאם כוללים תוספת של כל סוכן ביולוגי בכמויות קטנות מאוד, כי יכול להיות עניין הבהרת השפעות על תאים תאים או תאים ECM אינטראקציה. השיטה יכולה לשמש גם לתרבות שיתוף שני (או יותר) אוכלוסיות תאים שונות על מנת להבהיר את התפקיד של אינטראקציות תאים תאים או תאים ECM של ציון יחסים מרחביים בין תאים. Cell-cell לכידות התא ECM הידבקות הם אבני היסוד של מחקרים של אינטראקציה עובריים, התפתחות תאים סרטניים, סטרומה בפלישה ממאיר, ריפוי פצעים, ועבור יישומים הנדסת רקמות. זו שיטה פשוטה תספק אמצעי ליצירת רקמות כמו אגרגטים הסלולר למדידת נכסים biomechanical או לניתוח מולקולרית ביוכימיים במודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids at JoVE.com

A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

Studies of cell-cell cohesion and cell-substratum adhesion have historically been performed on monolayer cultures adherent to rigid substrates. Cells ...

a-simple-hanging-drop-cell-culture-protocol-for-generation-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

56.6K Views.  UMDNJ-Robert Wood Johnson Medical School. אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

Video: A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids

Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

3D Hydrogel פיגומים למפרקים הכונדרוציטים תרבות וסחוס דור

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

בניית גיליון מרובה שכבות תאי גזע Mesenchymal עם מערכת תרבות דינמית תלת-ממד

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

שלושה תלת-ממד של מטריקס-Adipocyte מודל תרבות המודל ללימוד תא מטריקס-מטבולית הסלולר

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We recently published a cost-effective strategy for the massive expansion of hiPSC-CMs in two dimensions (2D). Two major limitations are cell immaturity and a lack of three-dimensional (3D) arrangement and scalability in high-throughput screening (HTS) platforms. To overcome these limitations, the expanded cardiomyocytes form an ideal cell source for the generation of 3D cardiac cell culture and tissue engineering techniques. The latter holds great potential in the cardiovascular field, providing more advanced and physiologically relevant HTS. Here, we describe an HTS-compatible workflow with easy scalability for the generation, maintenance, and optical analysis of cardiac spheroids (CSs) in a 96-well-format. These small CSs are essential to fill the gap present in current in vitro disease models and/or generation for 3D tissue engineering platforms. The CSs present a highly structured morphology, size, and cellular composition. Furthermore, hiPSC-CMs cultured as CSs display increased maturation and several functional features of the human heart, such as spontaneous calcium handling and contractile activity. By automatization of the complete workflow, from the generation of CSs to functional analysis, we increase intra- and inter-batch reproducibility as demonstrated by high-throughput (HT) imaging and calcium handling analysis. The described protocol allows modeling of cardiac diseases and assessing drug/therapeutic effects at the single-cell level within a complex 3D cell environment in a fully automated HTS workflow. In addition, the study describes a straightforward procedure for long-term preservation and biobanking of whole-spheroids, thereby providing researchers the opportunity to create next-generation functional tissue storage. HTS combined with long-term storage will substantially contribute to translational research in a wide range of areas, including drug discovery and testing, regenerative medicine, and the development of personalized therapies.

Presented here is a set of protocols for the generation and cryopreservation of cardiac spheroids (CSs) from human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes cultured in a high-throughput, multidimensional format. This three-dimensional model functions as a robust platform for disease modeling, high-throughput screenings, and maintains its functionality after cryopreservation.

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are of paramount importance for human cardiac disease modeling and therapeutics. We ...