وقدم التمويل لهذا العمل من خلال جمعية القلب الأمريكية (16SDG29870005) وولاية كارولينا الشمالية الدولة الجامعة للبحث والابتكار التمويل الأولى.

1-يوم 1: الخلية وإعداد كاشف ملاحظة: ينبغي أن يقوم جميع إعداد الخلية وكاشف في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء لمنع تلوث العينات.
<ol><li>بتصفية الحار دولبيكو &#39; s النسر التعديل &#39; s المتوسطة (دميم)، المصل البقري الجنين (FBS)، ل الجلوتامين، والبنسلين/ستربتوميسين في حمام مائي 37 درجة مئوية.</li>
	<li>إعداد المواليد البشرية عن طريق الجلد تنتجها الخلايا الليفية (هدفن) وسائط الإعلام باستكمال استعد دميم مع 10% FBS والبنسلين/ستربتوميسين 1% 1% لتر-الجلوتامين.</li>
	<li>ذوبان قنينة مجمدة هدفنس والطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 200 x ز لإزالة المتوسطة للواسمات. ريسوسبيند الخلايا في استعداد هدفن الوسائط في كثافة 1 × 10 6 خلايا/مل والبذور في قارورة ثقافة T-75.</li>
	<li>قارورة مكان في حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO 2) للسماح بانتشار الخلايا.</li>
	<li>"هدفن تخزين" الوسائط في 4 ° C.</li>
	<li>إعداد الكواشف للمحترفين ومكافحة migratory حسب الحاجة.</li>
</ol> 2. يوم 3: إعداد كروي <ol><li>القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.</li>
	<li>عندما تصل الخلايا إلى 80% كونفلوينسي، نضح وسائط الإعلام، وإضافة 5 مل من 0.25% يدتا التربسين. قارورة مخزن في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من سطح قارورة كاملة-</li>
	<li>إضافة 5 مل من وسائل الإعلام المعالجون بقارورة لتحييد التربسين.</li>
	<li>في أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط 10 ميكروليتر تريبان الأزرق و 10 ميكروليتر من تعليق خلية.</li>
	<li>أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية الأصلي لمدة 8 دقائق في 200 غ. س</li>
	<li>بينما هو يجري فصل تعليق خلية، إضافة 10 ميكروليتر من تعليق خلية تريبان الأزرق إلى هيموسيتوميتير وإجراء حساب خلية.</li>
	<li>عقب الطرد المركزي، نضح وسائل الإعلام دون إزاحة بيليه الخلية. ريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 1.25 × 10 5 خلايا/مل.</li>
	<li>إضافة 5 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) إلى الجزء السفلي من 10 سم طبق بيتري الحفاظ على بيئة المائية خلال النمو كروي.</li>
	<li>عكس غطاء طبق بيتري. إضافة عدة قطرات ميكروليتر 20 من تعليق خلية على السطح الداخلي للغطاء طبق بيتري.</li>
	<li>بسرعة عكس الغطاء مرة أخرى ووضعه مرة أخرى على الجزء السفلي من الطبق، مع الحرص على عدم إزاحة قطرات معلقة. ويبين الشكل 1 معلقة بنجاح تشكيل قطرات.</li>
	<li>بعناية وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية وتسمح الماغنيسيوم تنمو في شنقاً إسقاط ثقافة لمدة 72 h.</li>
</ol> 3. يوم 6: تضمين الماغنيسيوم في مصفوفة 3D <ol><li>القيام بما يلي في غطاء ثقافة لمنع تلوث العينات.</li>
	<li>لتشكيل أول طبقة فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة من حجم كاف لإضافة 100 ميكروليتر الحل تجلط الواحد جيدا للعديد من الآبار كالمطلوبة (كروي 1 كل بئر). وتتألف من 10% 10 X HEPES المخزن المؤقت جلطات بحجم (250 ملم حبيس، 1500 ملم كلوريد الصوديوم، كاكل 50 مم 2، الرقم الهيدروجيني 7.4) والفيبرينوجين البشرية 2 مغ/مل U/mL 0.1 البشرية ثرومبين ألفا. ما تبقى حجم جلطة تتكون من الماء عالي النقاوة.
	<ol><li>ثرومبين إضافة آخر وبسرعة إضافة الحل إلى الآبار المرغوبة في لوحة 48-جيدا من أجل منع الجلطات مبلمرة قبل إضافتها إلى الآبار.</li>
	</ol></li> <li>بلطف يهز/والاستفادة من لوحة جيدا لضمان أن فيبرينوجين جلطة الخليط هو دهان الكامل جيدا، ثم ضع لوحة جيدا في الحاضنة ح 1 للسماح للطبقة السفلي تجلط بلمرة. لا تهز لوحة جيدا ما يكفي من الثابت للحث على تشكيل فقاعة؛ لوحة الصخور ببساطة حسب الضرورة حتى يتم المغلفة بأكملها شكل جيد. إذا استخدمت وحدات تخزين أكبر من جلطة، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية.</li>
	<li>نقل الماغنيسيوم إلى طبقة فيبرينوجين-
	لوحة <ol><li>إزالة جيدا وطبق بتري يحتوي على الماغنيسيوم في الشنق إسقاط ثقافة من الحاضنة ودراسة الماغنيسيوم تحت مجهر. ثم ضع الطبق إلى هود الثقافة-</li>
		<li>بعناية عكس غطاء صحن بيتري للسماح بالوصول إلى الشنق إسقاط الثقافات.</li>
		<li>بعناية باستخدام إبرة ز 21 المرفقة بحقنه 1 مل، نقل قطره واحدة من غطاء مقلوب داخل المركز من كل جيدا، مع الحرص على عدم ثقب طبقة فيبرينوجين مبلمرة طلاء أسفل البئر. فعالية نقل القطرة، سحب ببطء الانخفاض في الإبرة. وقف سحب المكبس مرة أخرى في أقرب وقت إسقاط كامل داخل الإبرة؛ سحب القطرة بعيداً جداً قد يعرض فقاعات الهواء، والتي يمكن أن تعطل نقل كروي فعالة أو تصوير اللاحقة-</li>
		<li>دراسة لوحة جيدا تحت مجهر للتأكد من أن الماغنيسيوم قد تحول بشكل صحيح في آبار كل المطلوب.</li>
	</ol></li> <li>لتشكيل الطبقة الثانية فيبرينوجين، إنشاء حل جلطة آخر باستخدام إعداد نفس النحو الوارد أعلاه لإنشاء طبقة فيبرينوجين الأولى (الخطوة 3، 2). "الماصة؛" 100 ميكروليتر إلى كل قطره المحتوية على كروي بعناية ودراسة تحت مجهر مرة أخرى للتأكد من أن الماغنيسيوم لا تزال على حالها، ولا تم دفعها على حواف الآبار-</li>
	<li>إرجاع لوحة جيدا للحاضنة والسماح للطبقة الثانية بلمرة حاء – 1</li>
</ol> 4. يوم 6: إضافة برو المهاجرة أو العوامل المثبطة <ol><li>وسائل الإعلام "هدفن الحارة" إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>الخطوات التالية في غطاء لمنع التلوث.</li>
	<li>إعداد الوسائط لكل مجموعة بما في ذلك تركيزات ملائمة لوكلاء برو-migratory المضادة تقييم-</li>
	<li>إزالة لوحة جيدا من الحاضنة ومكان في غطاء ثقافة-</li>
	<li>ميكروليتر 500 إضافة وسائط القياسية لكل بئر من السيطرة على المجموعة كروي و 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام المثبطة لكل بئر فريق كروي تثبيط الهجرة 500 ميكروليتر من وسائل الإعلام الموالية المهاجرة لكل بئر فريق كروي تعزيز الهجرة-</li>
	<li>إرجاع لوحة جيدا للحاضنة.</li>
	<li>تغير وسائل الإعلام كل حاء 48</li>
</ol> 5. 6-9 أيام: التقييم للهجرة الخلية وانتشار الماغنيسيوم <ol><li>الصورة باستخدام الفحص المجهري برايتفيلد فورا بعد إضافة الوسائط (ح 0) وبعد ذلك كل 24 ساعة ل h. 72 اختياري: عند كل نقطة من الزمن، تأخذ صورة z-كومة من أجل تحديد ما إذا كان يتم حدوث الهجرة في الطائرات خارج مجال التركيز الرئيسي. في تجربتنا لا يحدث هذا؛ ومع ذلك، أنها مفيدة لضمان هذا هو الحال في كل تجربة.</li>
	<li>"استخدام إيماجيج" لتحديد الخلية ثمرة في كل بئر من خلال تحليل الزيادة المئوية في المجال لكل كروي بتتبع الحدود خلية لكل كروي عند كل نقطة الزمنية المتعاقبة واستخدام &#34; التدبير &#34; الدالة للحصول على المجال.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chester, D., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+biophysical+properties+of+provisional+matrix+proteins+in+wound+repair.">The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair.</a> Matrix Biol. , (2016).</li><li>Martin, P., Leibovich, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+cells+during+wound+repair:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly.</a> Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).</li><li>Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+between+chemotaxis+and+contact+inhibition+of+locomotion+determines+exploratory+cell+migration.">Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration.</a> Nat Commun. 6, 6619 (2015).</li><li>Ngalim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creating+Adhesive+and+Soluble+Gradients+for+Imaging+Cell+Migration+with+Fluorescence+Microscopy.">Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Charras, G., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+influences+of+the+extracellular+environment+on+cell+migration.">Physical influences of the extracellular environment on cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).</li><li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblasts+Lead+the+Way:+A+Unified+View+of+3D+Cell+Motility.">Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).</li><li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration.">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).</li><li>Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-Engineered+Models+for+the+Study+of+Cutaneous+Wound-Healing.">Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing.</a> Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).</li><li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration.">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).</li><li>Fraley, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinctive+role+for+focal+adhesion+proteins+in+three-dimensional+cell+motility.">A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility.</a> Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).</li><li>Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Z&#228;nker, K. S., Dittmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Migration+within+a+Three-dimensional+Collagen+Matrix.">Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix.</a> J Vis Exp. (92), (2014).</li><li>Jonkman, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li><li>Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Three-Dimensional+Wound+Healing+Model.">A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model.</a> J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).</li><li>Ross, R., Benditt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+collagen+formation.">Wound healing and collagen formation.</a> The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).</li><li>Sproul, E. P., Argraves, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytokine+axis+regulates+elastin+formation+and+degradation.">A cytokine axis regulates elastin formation and degradation.</a> Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).</li><li>Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+signaling+in+wound+repair.">Elastin signaling in wound repair.</a> Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).</li><li>Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Matrix+and+Dermal+Fibroblast+Function+in+the+Healing+Wound.">Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound.</a> Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).</li><li>Cox, S., Cole, M., Tawil, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+Human+Dermal+Fibroblasts+in+Three-Dimensional+Fibrin+Clots:+Dependence+on+Fibrinogen+and+Thrombin+Concentration.">Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration.</a> Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).</li><li>Brown, A. C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin-based+biomaterials:+Modulation+of+macroscopic+properties+through+rational+design+at+the+molecular+level.">Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).</li><li>Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+anti-inflammatory+mesenchymal+stem/precursor+cells+(MSCs)+through+sphere+formation+using+hanging+drop+culture+technique.">Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).</li><li>Bainbridge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+and+the+role+of+fibroblasts.">Wound healing and the role of fibroblasts.</a> J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح هذا البروتوكول لدراسة الهجرة الخلية في التئام المرتبطة ECMs من خلال في المختبر نموذج الثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة في التنفيذ السليم لهذا الإجراء هو التنمية السليمة الماغنيسيوم تنتجها الخلايا الليفية؛ تركيز خلية أثناء إعداد الأمثل لتعطي بتركيز أولية من الخلايا 2,500 والإفلات، مما ي?...

التئام الجروح هو عملية معقدة مما يؤدي إلى استعادة سلامة الأنسجة بعد الإصابة. يتم تقسيم هذه العملية إلى أربع مراحل متداخلة يشملها الأرقاء والتهاب والانتشار ويعيد البناء، التي يتم تنظيمها بكل بمزيج معقد من الرموز القابلة للذوبان والخلية-مصفوفة التفاعلات والاتصالات خلية. 1 , 2 تزامن هذه الرموز يتحكم العديد من الاستجابات الخلوية في التئام الجروح بما في ذلك، الأهم من ذلك، الهجرة الخلية. 3 , 4 الهجرة الخلية عملية ديناميكية للغاية تعتمد على تعمل الخلوية والخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للوسط المصفوفة خارج الخلية. 5 الخلايا باستمرار التحقيق بيئتهم المصفوفة خارج الخلية من خلال مسارات إنتغرين بوساطة؛ تسمح هذه العملية الخلايا بمعنى مجموعة واسعة من خصائص المصفوفة بما في ذلك التضاريس والصلابة، والحبس. ثنائي الأبعاد (2D) تحليل الهجرة خلية يوضح أن الهجرة هو القوة الدافعة وراء تشكيل لاميليبوديا في طليعة من خلال توليد حزم خيوط الأكتين. اللاحقة تشكيل الالتصاقات المحورية في طليعة، في تركيبة مع أكتوميوسين مدفوعة انكماش وتراجع في الحافة، محركات أقراص الخلية إلى الأمام. 6 الهجرة الخلوية "ثلاثي الأبعاد" (3D) حاليا ليست مفهومة جيدا، إلا أن الدراسات الأخيرة تبين بأن الهجرة 3D اختلافاً مما ضوئها وصف الآلية في 2D، والمرجح أن تحركها آليات بديلة. على سبيل المثال، الدراسات الحديثة من بيتري وآخرون. أظهرت أن الخلايا في مصفوفات ثلاثية الأبعاد يمكنك التبديل اعتماداً على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة، بين لاميليبوديوم ولوبوبوديوم مدفوعة آليات الهجرة. 7 نظراً للهجرة الخلية عنصر حاسم للجرح شفاء استجابة، نماذج ثلاثية الأبعاد للهجرة الخلية ذات أهمية حاسمة لفهم الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات المختلفة أثناء التئام الجروح. على الرغم من أن سلوك الخلية المهاجرة على الأسطح 2D ثبت أن تختلف اختلافاً كبيرا من الهجرة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد، الأكثر حداثة في المختبر نماذج الهجرة الخلية خلال الجرح شفاء العملية، بما في ذلك الفحص الصفر الراسخة، الاستفادة من 2D أحادي الطبقة الثقافات. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 فحوصات أكثر وضعت مؤخرا استخدمت مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولكن لا تزال الثقافة الخلايا في أحادي الطبقة على رأس المصفوفة، مما يحد من القدرة على الخص حقاً ثريديمينسيوناليتي البيئة خلية المجراة في. 15
وغرض الأسلوب الموصوفة هنا دراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة الفيزيولوجية، وليس على سطح ثنائي الأبعاد، بغية التوصل إلى فهم أكثر قوة للردود الهجرة المرتبطة بالمنبهات التطبيقية. يسمح هذا الأسلوب للتقييم للهجرة الخلية داخل مصفوفة 3D فيبرينوجين جلطة حضور عوامل تنشيط أو تمنع المسارات المرتبطة بالهجرة الخلية. مصفوفة فيبرينوجين تم اختياره لهذا الأسلوب بسبب اللعب فيبرينوجين دوراً حاسما في المراحل المبكرة من التئام الجروح؛ الإصابات التالية، جلطة فيبرينوجين تتشكل داخل بيئات الجرح لوقف فقدان الدم ويعمل سقالة لتسلل خلية أولية أثناء إصلاح الأنسجة وإعادة عرض. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , بالإضافة إلى ذلك، 20 فيبرينوجين يستخدم سريرياً كتسرب جراحية وتكوين السدود قد تم مرتبطة بالهجرة الخلية، وفي نهاية المطاف نتائج الشفاء. دراسة سابقة أجرتها كوكس وآخرون. التحقيق الهجرة تنتجها الخلايا الليفية بجلطات فيبرينوجين تتألف من فيبرينوجين متفاوتة وتركيزات ثرومبين غرض الاستفادة المثلى من تسرب فيبرينوجين. في هذه الدراسات، وكان كمياً هجرة الخلايا من جلطات فيبرينوجين على الأطباق البلاستيكية. 20 هنا نقدم أسلوب يسمح للتحديد الكمي لهجرة خلايا داخل بيئة فيبرينوجين 3D. بينما يستخدم الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول تحديداً فيبرينوجين، يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة استخدام مواد بديلة المصفوفة كما هو مطلوب، مثل الكولاجين أو المصفوفات الأخرى 3D. بالإضافة إلى ذلك، نقدم استخدام تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم في هذا التحليل لأن الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في السرير الجرح أمر بالغ الأهمية لتوليف المصفوفة خارج الخلية والأنسجة إصلاح/إعادة عرض. ومع ذلك، هي العَدلات العملية خلال الإصلاح نوع الخلية الأولى ترحيل إلى السرير الجرح، وتليها الضامة. ثم تبدأ الليفية للتسلل البيئة الجرح حوالي 48 ساعة بعد الإصابة الأولية، في بداية المرحلة التكاثري للجرح شفاء العملية. 19 هذا التحليل يمكن تعديلها بسهولة لتضمين العَدلات، الضامة، أو أنواع الخلايا الأخرى لتقييم كيف تؤثر التغييرات في هيكل فيبرينوجين جلطة الهجرة أنواع هذه الخلية. 21
لتنفيذ هذا التحليل، أولاً، تتشكل كروي تنتجها الخلايا الليفية استخدام تعديل التقنيات الموضحة سابقا لزراعة الخلايا الجذعية. 22 كروي تنتجها الخلايا الليفية بعد ذلك نقل إلى مصفوفة فيبرينوجين 3D، وثمرة يمكن ثم بسهولة رصدها وقياسها كمياً على مدى عدة أيام. يأخذ هذا البروتوكول في حساب 3D النظم الفسيولوجية عن طريق تضمين الماغنيسيوم خلية ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة فيبرينوجين، وبالتالي تجنب أوجه القصور في الأهمية الناجمة عن استخدام سطح نمو 2D مع أحادي الطبقة خلية للسلوك النموذجي المهاجرة، في حين لا يزال يسمح لتقييم سلوك الخلية في بيئة عالية التي تسيطر عليها في المختبر .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Materials</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:217px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>VWRL0148-0500</td>
			<td style="width:217px;">DMEM already containing L-glutamine can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>10861-594</td>
			<td style="width:217px;">Dishes of any size can be used for hanging drop culture&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:91px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN1680149</td>
			<td style="width:217px;">Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:267px;">Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL</td>
			<td style="width:91px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Human Dermal Fibroblasts, neonatal</td>
			<td style="width:91px;">Thermo Fisher</td>
			<td>C0045C</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with other cell type of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">21 G x 1 1/2&#39; needle</td>
			<td style="width:91px;">BD&#160;</td>
			<td>305167</td>
			<td>22 G x 1 1/2 needles will also work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">1 mL syringe</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>89174-491</td>
			<td>Syringes of any volume can be used</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)</td>
			<td style="width:91px;">VWR</td>
			<td>82051-004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>FIB 3</td>
			<td style="width:217px;">Can be replaced with matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Human Alpha Thrombin</td>
			<td style="width:91px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td>HT 1002a</td>
			<td style="width:217px;">May not be necessary depending on matrix protein of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Equipment</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BSL2 cell culture hood</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Inverted microscope with 10X objective</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">Centrifuge compatibile with 15 mL tubes</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing cell migration within three-dimensional in vitro wound environments

حاليا، معظم نماذج في المختبر لالتئام الجروح، مثل فحوصات الصفر الراسخة، تشمل دراسة إغلاق الخلية الهجرة والجرح على السطوح ثنائية الأبعاد. ومع ذلك، البيئة الفسيولوجية في الجرح الذي في فيفو الشفاء يأخذ مكان ثلاثي الأبعاد بدلاً من الأبعاد. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن سلوك الخلية يختلف إلى حد كبير في الأبعاد مقابل بيئات ثلاثية الأبعاد؛ ولذلك، هناك حاجة للنماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا في المختبر لدراسة سلوك الهجرة الخلية في إغلاق الجرح. الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد التي تعكس بصورة أفضل الظروف الفسيولوجية من فحوصات الصفر ثنائي الأبعاد المحددة سابقا. والغرض من هذا النموذج تقييم ثمرة الخلية عن طريق فحص الهجرة الخلية بعيداً عن جسم كروي مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين حضور عوامل برو أو مكافحة ميجراتوري. باستخدام هذا الأسلوب، ثمرة خلية من جسم كروي في مصفوفة ثلاثية الأبعاد يمكن ملاحظتها وهي قابلة للقياس بسهولة مع مرور الوقت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد وتحليل لمنطقة جسم كروي. يمكن أيضا تقييم تأثير العوامل الكثيرة الارتحال برو و/أو المثبطة على الهجرة الخلية في هذا النظام. يوفر هذا الأسلوب الباحثين مع طريقة بسيطة لتحليل الهجرة الخلية في الجرح ثلاثي الأبعاد المرتبطة المصفوفات في المختبر، مما يزيد من أهمية المختبر في الخلية دراسات مسبقة لاستخدام الحيوانات في فيفو نماذج.

ثقافة كروي يمكن أن تستخدم لتقييم أثر العوامل المؤيدة والمناهضة الهجرة على الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في المختبر بنجاح يمكن أن تتكون الماغنيسيوم 3D تنتجها الخلايا الليفية عبر الشنق ثقافة الإفلات على مدى فترة 72 ساعة (الشكل 1). وعقب فترة الثقاف?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments at JoVE.com

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

characterizing-cell-migration-within-three-dimensional-vitro-wound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

7.6K Views.  North Carolina State University and The University of North Carolina - Chapel Hill. والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.

Video: Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the central nervous system1,2. These endogenous EFs are generated by cellular regulation of ionic transport combined with the electrical resistance of cells and tissues. It has been reported that applied EF treatment can promote functional repair of spinal cord injuries in animals and humans3,4. In particular, EF-directed cell migration has been demonstrated in a wide variety of cell types5,6, including neural progenitor cells (NPCs)7,8. Application of direct current (DC) EFs is not a commonly available technique in most laboratories. We have described detailed protocols for the application of DC EFs to cell and tissue cultures previously5,11. Here we present a video demonstration of standard methods based on a calculated field strength to set up 2D and 3D environments for NPCs, and to investigate cellular responses to EF stimulation in both single cell growth conditions in 2D, and the organotypic spinal cord slice in 3D. The spinal cordslice is an ideal recipient tissue for studying NPC ex vivo behaviours, post-transplantation, because the cytoarchitectonic tissue organization is well preserved within these cultures9,10. Additionally, this ex vivo model also allows procedures that are not technically feasible to track cells in vivo using time-lapse recording at the single cell level. It is critically essential to evaluate cell behaviours in not only a 2D environment, but also in a 3D organotypic condition which mimicks the in vivo environment. This system will allow high-resolution imaging using cover glass-based dishes in tissue or organ culture with 3D tracking of single cell migration in vitro and ex vivo and can be an intermediate step before moving onto in vivo paradigms.

This protocol demonstrates methods used to establish 2D and 3D environments in custom-designed electrotactic chambers, which can track cells in vivo/ex vivo using time-lapse recording at the single cell level, in order to investigate galvanotaxis/electrotaxis and other cellular responses to direct current (DC) electric fields (EFs).

الكهربائية الميدانية التي تسيطر عليها هجرة إخراج من الخلايا العصبية السلف في البيئات 2D و 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to maintain cellular homeostasis. Puncture injury with glass needles provides a direct method to trigger a rapid epidermal wound response that activates wound transcriptional reporters, which can be visualized by a localized reporter signal in living embryos or larvae. Puncture or laser injury also provides signals that promote the recruitment of hemocytes to the wound site. Surprisingly, severe (through and through) puncture injury in late stage embryos only rarely disrupts normal embryonic development, as greater than 90% of such wounded embryos survive to adulthood when embryos are injected in an oil medium that minimizes immediate leakage of hemolymph from puncture sites. The wound procedure does require micromanipulation of the Drosophila embryos, including manual alignment of the embryos on agar plates and transfer of the aligned embryos to microscope slides. The Drosophila epidermal wound response assay provides a quick system to test the genetic requirements of a variety of biological functions that promote wound healing, as well as a way to screen for potential chemical compounds that promote wound healing. The short life cycle and easy culturing routine make Drosophila a powerful model organism. Drosophila clean wound healing appears to coordinate the epidermal regenerative response, with the innate immune response, in ways that are still under investigation, which provides an excellent system to find conserved regulatory mechanisms common to Drosophila and mammalian epidermal wounding.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

The embryonic epidermis of very late stage Drosophila embryos provides an in vivo system for rapid puncture wound response analysis and can be combined with genetic manipulations or chemical microinjection treatments to advance studies in wound healing for translation into mammalian models.

حقن مكروي الجرح الفحص و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; توطين البشرة الجرح مراسلون الاستجابة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

استزراع خلايا الثدييات في السقالات ببتيد ثلاثي الأبعاد

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

تقييم انتشار Keratinocyte على عمليات ثنائية وثلاثية الأبعاد في النوع الأول من ركائز الكولاجين

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...