فإن الكتاب أود أن أشكر Neurotar المحدودة للمساعدة التقنية، ومؤسسة CIMO وFGSN للحصول على الدعم المالي.

وقد تمت الموافقة على الإجراءات التي تجرى على الحيوانات من قبل المجلس الوطني تجربة الحيوانية وفنلندا. 1. إعداد الحيوان للتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس بواسطة intraperitional (IP) حقن الكيتامين (0.08 ملغ من وزن الجسم) وزيلازين (0.01 ملغ من وزن الجسم). تحقق التخدير مع الخلفية العاكسة قرصة أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج عيون الحيوان في قطرات العين (Viscotears) لحماية العينين من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس على وسادة التدفئة (سوبر تك) عند 37 درجة مئوية لمنع انخفاض حرارة الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف لوحة القدم المعين للتصوير مع الايثانول 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الماء على الجلد من لوحة القدم للاقتران الغمر بين الجلد والزجاج غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مواد التعبئة والتغليف البلاستيكية تحت مخلب هند أن يتم وضع إطار حلقة معدنية مع طبقة الغطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط سمك مواد التعبئة والتغليف البلاستيكية لشد الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الماء على الزجاج غطاءق للالغمر بين الزجاج غطاء والهدف. </li></ol> 2. المعادن التبعي إعداد الدائري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحقيق الاستقرار في الجلد الاستفادة من المعادن التبعي. نستخدم المجتمع تصميم المحمية التبعي الجناحين اثنين مع حلقة معدنية (تقدمة من Neurotar المحدودة، فنلندا). ملء المحاقن مع superglue، وضع قطرة صغيرة من superglue من خلال الإبرة على الحلبة ونشر برفق الغراء لتغطية موحدة من سطح الحلبة. فمن الأهمية بمكان لوضع الحد الأدنى من الغراء ما هو مطلوب فقط لتغطية موحدة، لأن كمية مفرطة من الغراء قد يقلل من مجال النظر وعرقلة التصوير لاحقة. ملاحظة: بدلا من مزيج من قضيب معدني (من تحت) وشريحة زجاجية قياسية المجهر (كغطاء) يمكن أن تستخدم لشد البشرة وضمان اقتران البصرية السليم للجمعية 14. ويمكن استخدام اثنين من ورقة مقاطع لإصلاح مخلب بين الزجاج والمعدن شريط السطحية (الشكل 4 </sترونج&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية حلقة مع غطاء المجهر الشريحة (5 مم، الميكروسكوب الالكتروني العلوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسمار على عصابة التبعي للقضيب معدني جامد التي montaged على المسرح المجهر الآلية. </li></ol> 3. التصوير الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة استخدام thy1-YFP-H الفئران، واختيار الجزء الأزرق من مضان مصباح الأطياف لتصور الألياف العصبية. العثور على الأعصاب من الاهتمام في وضع epifluorescence والتركيز على ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكتب إحداثيات مكان للتصوير الطولي. استخدام وسادة الرسغ كنقطة مرجعية. خلال جلسات التصوير التالي، كشف أول لوحة الرسغي ثم تجد نفس المنبع الألياف العصبية الكبيرة والعودة باستخدام الإحداثيات المحفوظة. من الضروري وضع وسادة القدم في نفس اتجاه عمودي على قضيب معدني للحفاظ على نفس النظام المرجعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على وضع اثنين من الفوتون. للفئران thy1-YFP-H، وهي مناسبة لاستخدام الطول الموجي 950 نانومتر من أشعة الليزرلتصور الألياف العصبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد طول الموجة الليزر والانبعاثات قنوات (450-480 نانومتر للكشف عن الجيل الثاني التوافقي، 520-550 نانومتر لتصوير الأعصاب YFP المسمى و580-630 نانومتر للكشف عن مضان YFP وتألق ذاتي من الشعر)، وتبدأ مع منخفضة الطاقة ليزر (3-5٪) لمنع photodamage والتبييض. الجهد نموذجي على أنابيب مضخم هو 600-700 V لهذا النوع من التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين دقة المطلوبة (512 X 512 أو 640 × 640 للمناسبات قياسات سريعة، 800 × 800 أو 1،024 X 1،024 للتصوير الصرفي)، خطوة محورية (1-3 ميكرون)، وسمك من العينة وفترات زمنية (1-10 دقيقة). الوقت هو التعرض بالترتيب من 1 ميللي ثانية لكل بكسل واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة أول الحدود العليا والسفلى من حجم التصوير في البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على كومة صورة مرجعية للمرجع قبل الآفة. عند الحاجة، فمن الممكن لتسجيل خط الأساس خلال عدة دقائق. </li><li&gt; بشكل متكرر (على الأقل كل 10-15 دقيقة) تحقق معدل التنفس الحيوان وردود الفعل، عند الحاجة تطبيق مبلغ إضافي من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير نظيفة لوحة بمنديل ووضع الماوس في مربع الانتعاش في 36 درجة مئوية حتى يصبح مستيقظا تماما. ملاحظة: عادة، ومدة دورة التصوير واحد جنبا إلى جنب مع الليزر التي يسببها الآفة (انظر أدناه) لا يتجاوز 1 ساعة. نوصي التحقق من أن الحيوان هو إفقاد إحساس عميق كل 10-15 دقيقة. هذا لا ينبغي أن تتداخل مع التصوير في حد ذاته ولكن ينبغي النظر في حين من المقرر إجراء التجارب. مدة تأثير جرعة الكيتامين / xylazyne واحدة حوالي 30 إلى 40 دقيقة، وبالتالي فإننا نوصي لتطبيق إضافي ¼ إلى ½ الجرعة بعد 25-30 دقيقة. ملاحظة: يجب أن يعتبر كذلك عندما التجريب تخطط أن وتيرة جلسات التصوير للحيوان الفردية يجب أن لا تتجاوز 1 في جلسة 2 أيام لتجنب الآثار السلبية لإعادةpetitive التخدير. </li></ol> 4. الآفة الليزر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحصول على إشارة الصورة المكدس، استخدام بروتوكول تبيض لجعل آفة الصغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة قوة الليزر إلى 100٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة وقت التعرض ل100-1،000 ميللي ثانية في المنطقة ذات الاهتمام (100-1،000x أكثر من في حالة التصوير قياسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخطط المنطقة لالآفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الآفة عن طريق التحول على التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى وضع التصوير العادي وتواصل مع تسجيلات مرور الزمن. </li></ol> 5. تجهيز وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما unmixing الطيفي باستخدام Unmixing المساعد في ImageJ 8 (يواكيم والتر، <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/spectral-unmixing.html</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة المكدس وتقسيم القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على منطقة خالية من الأعصاب أو الشعر لقياسات الخلفية. وضع المنطقة سو الفائدة في هذا المجال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخطط بعناية من جانب الشعر حيث هو التمييز بوضوح بين الأعصاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوط العريضة للالعصبية في جزء من الصورة حيث هو منفصل عن الشعر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ unmixing المصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق قياس مصفوفة unmixing لكومة كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ مداخن صورة جديدة معالجتها في شكل *. TIF. </li></ol>

<ol>
	<li>Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sensory+transduction+in+the+skin.">Mechanisms of sensory transduction in the skin.</a> Nature. 445, 858-865 (2007).</li><li>Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+epidermal+nerves+in+diabetic+neuropathy.">Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy.</a> Neurology. 47, 1042-1048 (1996).</li><li>Wu, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morton's+interdigital+neuroma:+a+clinical+review+of+its+etiology,+treatment,+and+results.">Morton's interdigital neuroma: a clinical review of its etiology, treatment, and results.</a> J. Foot Ankle Surg. 35, 112-119 (1996).</li><li>Lauria, G., Lombardi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+biopsy:+a+new+tool+for+diagnosing+peripheral+neuropathy.">Skin biopsy: a new tool for diagnosing peripheral neuropathy.</a> BMJ. 334, 1159-1162 (2007).</li><li>Cheng, C., Guo, G. F., Martinez, J. A., Singh, V., Zochodne, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+plasticity+of+axons+within+a+cutaneous+milieu.">Dynamic plasticity of axons within a cutaneous milieu.</a> J. Neurosci. 30, 14735-14744 (2010).</li><li>Wang, B., Zinselmeyer, B. H., McDole, J. R., Gieselman, P. A., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+Imaging+of+Leukocyte+Homing+and+Migration+in+vivo.">Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo.</a> J Vis Exp. (46), e2062 (2010).</li><li>Sacconi, L., O'Connor, R. P., Jasaitis, A., Masi, A., Buffelli, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multiphoton+nanosurgery+of+cortical+neurons.">In vivo multiphoton nanosurgery of cortical neurons.</a> J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).</li><li>Robinson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+injury+to+peripheral+nerves.">Traumatic injury to peripheral nerves.</a> Muscle Nerve. 23, 863-873 (2000).</li><li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Marinkovic, P., Reuter, M. S., Brill, M. S., Godinho, L., Kerschensteiner, M., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Amit, S., Yaron, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+systems+for+in+vivo+monitoring+and+microenvironmental+investigations+of+diabetic+neuropathy+in+a+murine+model.">Novel systems for in vivo monitoring and microenvironmental investigations of diabetic neuropathy in a murine model.</a> J Neural Transm. 119, 1317-1325 (2012).</li><li>Yu, H., Fischer, G., Jia, G., Reiser, J., Park, F., Hogan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+gene+transfer+into+the+dorsal+root+ganglion+of+adult+rats.">Lentiviral gene transfer into the dorsal root ganglion of adult rats.</a> Mol Pain. 7, 63 (2011).</li><li>Yuryev, M., Khiroug, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+longitudinal+investigation+of+individual+nerve+endings+in+the+skin+of+anesthetized+mice+using+in+vivo+two-photon+microscopy.">Dynamic longitudinal investigation of individual nerve endings in the skin of anesthetized mice using in vivo two-photon microscopy.</a> J Biomed Opt. 17, 046007 (2012).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

في هذا البروتوكول الفيديو نظهر أسلوب غير الغازية طولية التصوير ثنائي الفوتون من النهايات العصبية واحدة. يتأثر ديناميات innervations الجلد في أمراض مثل الصدفية والاعتلال العصبي المحيطي 2، والإصابات 9. التصوير ثنائي الفوتون...

A correction was made to <a href="/video/51045">In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin</a>.
Leonard Khiroug was removed as an author.

Erratum: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

النهايات العصبية الجلدية تخضع التغيرات الديناميكية في إطار الدول المرضية المختلفة. يمكن أن الألياف العصبية تذهب من خلال عملية انحطاط وتجديد أو إعادة الهيكلة في سياق أمراض مثل اعتلال الأعصاب المحيطية 2 أو مورتون العصب 3. بعد الإصابات، جزءا هاما من النهايات العصبية المحركة في الجلد هو عودة التعصيب من المنطقة المتضررة. ومع ذلك، فإن نهج مشترك للتحقيق في النهايات العصبية هو خارج الحي النسيجية باجتزاء تفتقر إلى المعلومات في الوقت الحقيقي على العمليات الجارية 4. استخدام علامات الفلورسنت المشفرة وراثيا، فمن الممكن لتتبع النهايات العصبية في الجلد من الحيوانات الحية، وبالتالي الحصول على معلومات غنية وبشكل ملحوظ أكثر ملاءمة على التغييرات الهيكلية. التحقيق في النهايات العصبية الجلدية من الممكن استخدام المجهر الفلورسنت التقليدية، ومع ذلك، تناثر الضوء القوي من أنسجة الجلد تقوض بشدة الجودةمن البيانات المستقاة 5. Multiphoton المجهري يسمح اقتناء صور عالية الدقة في الأنسجة نثر بشدة بسبب الجمع غير الخطية للطاقة فوتونات الضوء الإثارة مما أدى إلى انبعاث مضان فقط من النقطة المحورية لهذا الهدف. هذا التأثير يؤدي إلى زيادة قوية في عمق الاختراق وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لقياس في أنسجة الجلد 6. باستخدام نفس الليزر والتصوير، وأنه من الممكن لإنتاج تشريح انتقائية من الألياف العصبية 7. في البروتوكول التالي نقدم لك طريقة التصوير الطولي من النهايات العصبية الجلدية في الجسم الحي في الفئران المعدلة وراثيا مراسل جنبا إلى جنب مع انتقائية الآفة باستخدام الليزر المتاحة تجاريا نظام المجهر multiphoton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1231">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Round cover glass&#160;</td>
			<td style="width:209px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:119px;">72296-05</td>
			<td style="width:687px;">5 mm diameter #1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eye drops Viscotears</td>
			<td style="width:209px;">Novartis</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2mg/g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Superglue Loctite 401</td>
			<td style="width:209px;">Henkel</td>
			<td>135429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ketaminol</td>
			<td style="width:209px;">Intervet</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Ketamine 50 mg/ml, working solution 10 mg/ml (use it 80 &#181;g per gramm of animal weight)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rompun</td>
			<td style="width:209px;">Bayer Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Xylazine 20 mg/ml, working solution 1.25 mg/ml (use it 10 &#181;g per gramm of animal weight)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:687px;">Working solution is a mixture of Ketamine 10 mg/ml and Xylazine 1.25 mg/ml in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol 70%</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Distilled water or Milli-Q water</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Syringes 1ml&#160;</td>
			<td style="width:209px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">30G 1/2&#34; needles</td>
			<td style="width:209px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">304000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic packaging material</td>
			<td style="width:209px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Could be purchaized from general hardware store</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FV-1000MPE microscope</td>
			<td style="width:209px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">FV-1000MPE</td>
			<td>Microscope with motorized stage and rigid metal bar for fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">25X XLPlan objective</td>
			<td style="width:209px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">XLPLN 25XWMP</td>
			<td>Water imersion objective optimized for multiphoton imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mai-Tai DeepSee laser (2W)</td>
			<td style="width:209px;">SpectraPhysics</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Heating pad</td>
			<td style="width:209px;">Supertech</td>
			<td style="width:119px;">TMP-5b</td>
			<td>Heating pad with a temperature controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Metal ring fixator</td>
			<td style="width:209px;">Neurotar Ltd.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:209px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Open source software for image processing and analysis, http://rsbweb.nih.gov/ij/&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Thy1-YFPH mice strain</td>
			<td style="width:209px;">JaxLab</td>
			<td style="width:119px;">003782</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon microscopy of single nerve endings in skin

وتشارك النهايات العصبية في الجلد في العمليات الفسيولوجية مثل الاستشعار 1 وكذلك في العمليات المرضية مثل آلام الأعصاب 2. على المواقع قريبة إلى سطح يسهل التصوير المجهري من النهايات العصبية في الجلد الحية الحيوانية سليمة. باستخدام المجهر multiphoton، فمن الممكن الحصول على الصور الجميلة التغلب على مشكلة تشتت الضوء القوي من أنسجة الجلد. مراسل الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن EYFP تحت سيطرة خاصتك-1 المروج في الخلايا العصبية (بما في ذلك محيط الخلايا العصبية الحسية) مناسبة تماما للدراسات طولية من النهايات العصبية الفردية على مدى فترات طويلة من الزمن تصل إلى عدة أشهر أو حتى مدى الحياة. وعلاوة على ذلك، باستخدام نفس يزر الفيمتو ثانية بالنسبة للتصوير، فمن الممكن أن ينتج آفات انتقائية للغاية من الألياف العصبية للدراسات إعادة الهيكلة الألياف العصبية. هنا، نقدم بروتوكول بسيطة وموثوق بها لmultiphoton طولية في الجسم الحي والتصويرالمجهرية القائم على الليزر على الماوس النهايات العصبية الجلد.

باستخدام تقنية الموضحة فمن الممكن أن تتبع نفس الألياف بعد الآفة ودراسة تدهور النهايات العصبية التالفة (الشكل 1). الاستحواذ على كومة مع سمك 120-150 ميكرون هو عادة المناسبة للتصوير متكرر خلال عدة أيام وذلك للحفاظ على الألياف كله في مجال الرؤية. <p class="jove_content" style="...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin at JoVE.com

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

يتم تقديم بروتوكول للتصوير الطولي دينامية وآفة الليزر الانتقائي من النهايات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا مراسل.

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

in-vivo-two-photon-microscopy-of-single-nerve-endings-in-skin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

10.6K Views.  University of Helsinki.  يتم تقديم بروتوكول للتصوير الطولي دينامية وآفة الليزر الانتقائي من النهايات العصبية في الفئران المعدلة وراثيا مراسل. 

Video: In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

تصوير الأعصاب وظيفية عن طريق الموجات فوق الصوتية تعطيل حاجز الدم في الدماغ والتصوير بالرنين المغناطيسي المنغنيز معززة لل

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

الكمي من الشلل الأوعية الدموية العمارة باستخدام ثنائي الفوتون المجهري في نموذج الفأر من Neuroinflammation التي يسببها فيروس نقص المناعة البشرية

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles in the skin of the mouse pinna. The preparation is simple and relatively fast, reliably yielding extensive regions of multiple labeled units of living nerve terminals to study uptake and release of styryl pyridinium dyes extensively used in studies of vesicle recycling. Subdividing the preparations before labeling allows test vs. control comparisons in the same ear from a single individual. Helpful tips are given for improving the quality of the preparation, the labeling and the imaging parameters. This new system is suitable for assaying pharmacologically and mechanically-induced uptake and release of these vital dyes in lanceolate terminals in both wild-type and genetically modified animals. Examples of modulatory influences on labeling intensity are given.

Optical Monitoring of Living Nerve Terminal Labeling in Hair Follicle Lanceolate Endings of the Ex Vivo Mouse Ear Skin

Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

A novel dissection and recording technique is described for optical monitoring staining and de-staining of lanceolate terminals surrounding hair follicles ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

In Vivo Three-Dimensional Two-Photon Microscopy to Study Conducted Vascular Responses by Local ATP Ejection Using a Glass Micro-Pipette

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the regulation of cerebral blood flow (CBF) is incompletely understood, especially at the capillary level. Two-photon microscopy is a powerful tool widely used to study CBF and its regulation. Currently, this field is limited by the lack of in vivo two-photon microscopy studies examining (1) CBF responses in three-dimensions, (2) conducted vascular responses, and (3) localized interventions within the vascular network. Here, we describe a 3D in vivo method using two-photon microscopy to study conducted vascular responses elicited by&#160;local ejection of ATP with a glass micro-pipette. Our method uses fast and repetitive hyperstack two-photon imaging providing precise diameter measurements by maximal intensity projection of the obtained images. Furthermore, we show that this method can also be used to study 3D astrocytic calcium responses. We also discuss the advantages and limitations of glass micro-pipette insertion and two-photon hyperstack imaging.

We present an optimized local ejection procedure using a glass micro-pipette and a fast two-photon hyperstack imaging method, which allows precise measurement of capillary diameter changes and investigation of its regulation in three dimensions.

في فيفو ثلاثي الأبعاد اثنين فوتون المجهري لدراسة الاستجابات الوعائية التي أجريت من قبل طرد ATP المحلية باستخدام الزجاج الماصة الصغيرة

Maintenance of normal brain function requires a sufficient and efficient supply of oxygen and nutrition by a complex network of vessels. However, the ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. Despite their importance, technologies for tracking neuromodulatory events with cellular resolution are just beginning to emerge. Neuromodulators, such as dopamine, norepinephrine, acetylcholine, and serotonin, trigger intracellular signaling events via their respective G protein-coupled receptors to modulate neuronal excitability, synaptic communications, and other neuronal functions, thereby regulating information processing in the neuronal network. The above mentioned neuromodulators converge onto the cAMP/protein kinase A (PKA) pathway. Therefore, in vivo PKA imaging with single-cell resolution was developed as a readout for neuromodulatory events in a manner analogous to calcium imaging for neuronal electrical activities. Herein, a method is presented to visualize PKA activity at the level of individual neurons in the cortex of head-fixed behaving mice. To do so, an improved A-kinase activity reporter (AKAR), called tAKAR&#945;, is used, which is based on F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). This genetically-encoded PKA sensor is introduced into the motor cortex via in utero electroporation (IUE) of DNA plasmids, or stereotaxic injection of adeno-associated virus (AAV). FRET changes are imaged using two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy (2pFLIM), which offers advantages over ratiometric FRET measurements for quantifying FRET signal in light-scattering brain tissue. To study PKA activities during enforced locomotion, tAKAR&#945; is imaged through a chronic cranial window above the cortex of awake, head-fixed mice, which run or rest on a speed-controlled motorized treadmill. This imaging approach will be applicable to many other brain regions to study corresponding behavior-induced PKA activities and to other FLIM-based sensors for in vivo imaging.

A procedure is presented to visualize protein kinase A activities in head-fixed, behaving mice. An improved A-kinase activity reporter, tAKAR&#945;, is expressed in cortical neurons and made accessible for imaging through a cranial window. Two-photon fluorescence lifetime imaging microscopy is used to visualize PKA activities in vivo during enforced locomotion.

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...