وأيد هذا العمل بسخاء من أموال من أطفال مؤسسة السرطان (بالتيمور، MD)، براندون لي كارينغتون مؤسسة (سيلفر سبرينغ، MD)، وزارة الدفاع (W81XWH-10-1-0137) والمعاهد الوطنية للصحة (R01CA108641). ونود أن نشكر الدكتور انطون Wellstein وأعضاء مختبره لتبادل خبراتهم ومساعدتنا على تحسين الأساليب المعروضة.

1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع محطة xCELLigence في الحاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلايا HUVEC مرور منخفض، ويفضل أن لا يزيد عن مرور 6. أيضا، تأكد من أن الخلايا ليست أكثر من 75٪ متموجة في وقت الحصاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الخلايا HUVEC في EGM-2 وسائل الإعلام تشكيل مع عدة EGM-2 رصاصة (ونزا العلوم البيولوجية) التي تحتوي على عوامل النمو، وملاحق و 5٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب إزالة كل آثار التربسين من الايقاف الخلية بواسطة الخلايا في 200xg الغزل، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وإعادة التعليق عليها لكثافة الخلية المشار إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف xCELLigence E-لوحة 16 مع 0.1٪ الجيلاتين لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل لوحة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100μL المعاد EGM-2 وسائل الإعلام. إجراء قراءة فارغة على نظام xCELLigence لقياس الخلفيةمقاومة في غياب الخلايا. </li></ol> 2. توليد HUVEC أحادي الطبقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد قارورة شبه متموجة من الخلايا HUVEC من قبل trypsinization. Resuspend الخلايا في المعاد EGM-2 وسائط إلى كثافة النهائي من 2.5 × 10 5 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل بئر من خلفية معايرة E-لوحة تحتوي على 100μL EGM-2 وسائل الإعلام، إضافة 100μL من تعليق الخلية HUVEC (2.5 × 10 4 خلايا HUVEC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت فورا E-بلايت في الصك xCELLigence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> برنامج xCELLigence برنامج لأداء قراءات مقاومة في 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا البطانية تنمو لمدة 18-21 ساعة حتى تشكيل أحادي الطبقة، كما يتضح من تسطيح مؤشر الخلية (الشكل 2). </li></ol> 3. بالإضافة إلى ذلك بغزو الخلايا وتطبيع البيانات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد شكلت HUVEC أحادي الطبقة مستقرة، والخلايا السرطانية عن طريق الحصاد trypsinization و resuspend إلى أوكار النهائيإيتي من 1 × 10 5 خلية / مل في وسائل الإعلام المستخدمة لزراعة الخلايا السرطانية (مثل RPMI أو وسائل الإعلام التي تحتوي على DMEM FBS 10٪) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءات مقاومة قفة على البرنامج xCELLigence وإزالة E-لوحة من المحطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة EGM-2 وسائل الإعلام بواسطة الشفط. إضافة 100μL من التعليق الخلية السرطانية التي تحتوي على 1 × 10 4 خلايا. عموما، وهي نسبة 1:2.5 الخلايا السرطانية: الخلايا البطانية المصنف، يعمل على نحو أفضل للمقايسة. ومع ذلك، فإن النسبة يمكن أن يكون الأمثل لخطوط الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة E على نظام xCELLigence في الحاضنة ومواصلة مقاومة قراءات في 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن رصد الغزو في الوقت الحقيقي خلال الساعات القادمة 6-12 بأنه انخفاض في مؤشر الخلية بسبب تراجع من التقاطعات البطانية والاختراق عن طريق غزو الخلايا السرطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيع النتائج إلى وقت بالإضافة إلى ذلك بغزو الخلايا السرطانية. البرنامج xCELLigence تصاريح التطبيع إلى أي نقطة زمنية والنتائجويمكن الاطلاع مباشرة في إطار البرنامج. </li></ol> 4. ممثل النتائج: ويرد مثال لغزو أحادي الطبقة HUVEC من قبل خلايا المنتشر وغير المنتشر في الشكل 3. K7M2 هو خط خلية عظمية النقيلي. هذه الخلايا التعبير عن مستويات عالية من هيكل الخلية رابط ezrin البروتين، والتي تمثل خصائص الغازية من هذا الخط الخلية 13،14. عندما يتم الطعن HUVEC الخلايا مع خلايا K7M2، أن هناك انخفاضا في المقاومة الكهربائية في غضون 6 ساعات. هذا الانخفاض في المقاومة الكهربائية يمثل غزو أحادي الطبقة HUVEC من قبل خلايا الورم الغازية. الخلية خط K12، من ناحية أخرى، ويعرب عن مستويات أقل بكثير من ezrin وبالتالي هو أقل النقيلي 13. تحدي أحادي الطبقة HUVEC مع K12 الخلايا يؤدي إلى انخفاض حاد في أقل قدر من المقاومة لهذه الخلايا غير قادرة على الانضمام إلى غزو أو من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 3). <imgSRC = &quot;/ files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg&quot; بديل = &quot;الشكل 1&quot; /&gt; الشكل 1. رسم تخطيطي للعملية تدفق العمل لغزو الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم. ومطلي الخلايا HUVEC على الجيلاتين المغلفة لوحات E وسمح لتشكيل أحادي الطبقة متموجة. تضاف الخلايا الخبيثة بمجرد تشكيل أحادي الطبقة ويتم رصد الغزو في الوقت الحقيقي كما يغير مؤشر الخلية بسبب غزو أحادي الطبقة البطانية. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. تشكيل أحادي الطبقة HUVEC. التغييرات في مؤشر الخلية كخلايا HUVEC نعلق على وتنتشر على أقطاب الذهب الجيلاتين المغلفة. ويمثل تشكيل أحادي الطبقة متموجة من استقرار مؤشر الخلية بعد 18 ساعة. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="الشكل (3)"/> الشكل (3). غزو ​​الخلايا HUVEC من قبل K7M2 وK12 خلايا عظمية. وحدث انخفاض حاد في سليحدث L-مؤشر في غضون ساعات قليلة لإدخال الخلايا K7M2 النقيلي للغاية. K12 الخلايا، من ناحية أخرى، هي أقل النقيلي وغير قادرين على اختراق أحادي الطبقة البطانية بكفاءة كما K7M2 الخلايا. ويمثل هذا انخفاضا أقل من قبل حاد في مؤشر الخلية عندما يتم الطعن في أحادي الطبقة HUVEC مع K12 الخلايا. مراقبة يمثل مقاومة من أحادي الطبقة HUVEC في غياب الخلايا السرطانية. وقد أجريت تجارب في ثلاث نسخ.

<ol>
	<li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+The+metastasis+cascade.">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li><li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+metastasis.">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li><li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis.">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li><li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+cancer+cell.">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li><li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+signals+from+the+invasive+front.">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li><li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers:+a+model+for+metastatic+invasion.">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li><li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement.">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li><li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals.">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li><li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC.">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li></ol>

وقدمت تكلفة النشر لهذه المخطوطة التكرم من قبل شركة روش العلوم التطبيقية.

في الوقت الحقيقي HUVEC مقايسة الغزو هو طريقة بسيطة، لكنها قوية لغزو الرصد. أنها توفر النتائج في الوقت الحقيقي، والذي هو تفوقا كبيرا على التقنيات التقليدية الأخرى التي تعتمد على تحليل نقطة النهاية. الفحص يمكن تعديلها لاختبار المخدرات، والأجسام المضادة، والبروتينات يغاندس باسم مثبطات أو التحفيز والتشجيع من ورم خبيث. تأثير عوامل مختلفة على البطانية / سرطان الخلية عبر الحديث يمكن تقييمها كذلك. عند إدخال عوامل خارجية، مثل عوامل النمو والمخدرات في وسائل الإعلام والثقافة، فمن المهم للتأكد من أنها لا تؤثر على سلامة أحادي الطبقة HUVEC. اضطراب أحادي الطبقة HUVEC يمكن اختبارها من خلال إدخال وكيل الخارجية في غياب غزو الخلايا، وضمان أنه لا يوجد أي تغيير في مؤشر الخلية. وبالتالي، ينبغي أن تدرج الضوابط المناسبة كجزء من التصميم التجريبي. خطوط مختلفة من الخلايا تظهر منحنيات مختلفة الخلية مؤشر لأنها تشكل أسيوطأحادي الطبقة luent. شكل منحنى، وكذلك الحد الأقصى خلية مؤشر تحقيقه، هو من نوع خلية معينة. الخلايا HUVEC تظهر عابرة مميزة تسطيح مؤشر الخلية بعد 4-6 ساعات البذر، تليها استقرار آخر في مؤشر الخلية أعلى بعد 16-18 ساعة. وبالتالي، فإنه من المهم للسماح للخلايا تشكيل أحادي الطبقة متموجة لمدة 18 ساعة على الأقل قبل إضافة الخلايا السرطانية. منذ مؤشر الخلية يعتمد على البيئة الأيونية في القطب / الخلية الطور البيني، والعوامل المختلفة مثل خلية التشكل ونوعية التصاقات خلية خلية التأثير على مؤشر الخلية، بالإضافة إلى منطقة أسفل جيدا تغطيتها. وبالتالي، فإن الانخفاض في مؤشر الخلية، والذي يحدث عند غزو الخلايا السرطانية، هي وظيفة من عدة عوامل، والتي تشمل تراجع من التقاطعات البطانية وغزو الخلايا السرطانية لاحقة. يتم تصنيعها الصك xCELLigence في ثلاثة أشكال مختلفة: ريال مدريد محلل خلية الوقت(RTCA) ليرة سورية، RTCA النائب RTCA وموانئ دبي. وRTCA SP صك يحمل واحدة 96-جيدا لوحة E حين أن الصك النائب RTCA يمكن أن تعقد ما يصل إلى ستة 96 جيدا لوحات E في وقت واحد. وهذا يسمح لفحص عالية الإنتاجية من الأدوية والمركبات. يتم تنفيذ التجارب في هذا المقال باستخدام أداة موانئ دبي RTCA، التي يمكن أن تعقد ثلاث 16 جيدا لوحات E. كل محطة عقد E-لوحة يمكن أن تعمل بشكل مستقل، والذي يسمح للمستخدمين متعددة لتشغيل التجارب في وقت واحد. ويمكن أيضا الصك موانئ دبي RTCA أن تستخدم لدراسة الهجرة باستخدام CIM لوحات. هذه هي لوحات 16 بشكل جيد مع الغرف العلوية والسفلية مفصولة البولي إثيلين (PET) الغشاء مع حجم المسام وسيطة من 8um. توجد أجهزة استشعار إلكترونية على الجانب السفلي للغشاء يسهل اختراقها للغرفة العليا. مجلس النواب بمثابة خزان للجاذب كيميائي للخلايا في مجلس الشيوخ. ومع ذلك، فإن الميزة الرئيسية للمقايسة غزو HUVEC خلال لوحات CIM هو أن غزو الخلايا السرطانية في السابق أناليست مقيدة حجم المسام، كما غزو الخلايا البطانية يعتمد على عبر الحديث بين الخلايا السرطانية والخلايا البطانية. ويمكن أيضا فحص غزو HUVEC سيتم تنفيذه على صك Z ECIS، المصنعة من قبل الفيزياء الحيوية التطبيقية (تروي، نيويورك). الصك Z ECIS تستخدم تقنية مماثلة في الصك xCELLigence، مع وجود اختلافات في تكوينات مجموعة والقطب. لقد أجرينا بنجاح فحوصات غزو HUVEC باستخدام صفائف ECIS 8 جيد. ومن المهم أن نلاحظ أن مساحة السطح جيدا أسفل أكبر في صفائف ECIS، الأمر الذي يتطلب عددا أكبر من الخلايا البطانية والورم ليكون مطلي: 2.5 × 10 5 و 1 × 10 5 خلايا على التوالي.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr> 
 <tr>
 	<td>xCELLigence RTCA DP station</td>
 <td>Roche	</td>
 <td>05469759001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>RTCA control unit</td>
 <td>Roche</td>
 <td>05454417001</td>
 <td>Notebook with preinstalled RTCA software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>E-Plate 16</td>
 <td>Roche</td>
 <td>05469830001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>HUVEC cells</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>EGM-2 media</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3156</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>EGM-2 bullet kit</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-4176</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0.1% Gelatin in 
sterile H2O
</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MCPROTO045</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells

نشر المنتشر من الخلايا الخبيثة يتطلب تدهور الغشاء القاعدي، المرفقات من خلايا الورم لبطانة الأوعية الدموية، تراجع من التقاطعات البطانية وأخيرا الغزو والهجرة من الخلايا السرطانية من خلال طبقة البطانية لدخول مجرى الدم كوسيلة من وسائل النقل إلى مواقع بعيدة في البلد المضيف 1-3. مرة واحدة في نظام الدورة الدموية، وسرطان الخلايا الشعرية التمسك الجدران ويتسرب إلى الأنسجة المحيطة بها لتشكيل أورام النقيلي 4،5. يمكن تكرارها مختلف مكونات الورم التفاعل خلية خلية البطاني في المختبر من خلال تحدي أحادي الطبقة من الخلايا البطانية الوريد السري الإنسان (HUVEC) مع الخلايا السرطانية. وتشير الدراسات التي أجريت مع الإلكترون المجهري وعلى النقيض من المرحلة أن في تسلسل المختبر من الأحداث تمثل إلى حد ما في الجسم الحي عملية النقيلي 6. هنا، نحن تصف تقنية الكهربائية مقاومة على أساس ان ترصد والكمي في الوقت الحقيقي invasأيون الخلايا البطانية من قبل خلايا الورم الخبيث. Giaever وفندق Keese وصف لأول مرة تقنية لقياس التقلبات في مقاومة عندما ينمو عدد السكان من الخلايا على سطح الأقطاب 7،8. الصك xCELLigence، المصنعة من قبل شركة روش، ويستخدم تقنية مماثلة لقياس التغيرات في مقاومة الكهربائية والخلايا نعلق وتنتشر في طبق الثقافة مغطاة مجموعة مسرى مكروي الذهب الذي يغطي حوالي 80٪ من المساحة في أسفل البئر. كما خلايا نعلق وتنتشر على سطح القطب، فإنه يؤدي إلى زيادة في مقاومة الكهربائية 9-12. يتم عرض مقاومة كمعلمة يسمى خلية مؤشر أبعاد، وهو يتناسب طرديا مع مساحة إجمالية قدرها الأنسجة الثقافة جيدا أن تغطيها الخلايا. وبالتالي، فإن مؤشر الخلية يمكن أن تستخدم لرصد التصاق الخلية، ونشر، مورفولوجيا وكثافة الخلايا. ويستند مقايسة غزو الموضحة في هذه المقالة على التغييراتفي مقاومة الكهربائية في القطب / الخلية الطور البيني، كما يبلغ عدد سكانها غزو الخلايا الخبيثة من خلال HUVEC أحادي الطبقة (الشكل 1). تعطيل تقاطعات البطانية، تراجع من أحادي الطبقة البطانية واستبدال من قبل الخلايا السرطانية يؤدي إلى تغيرات كبيرة في مقاومة. هذه التغييرات ترتبط مباشرة مع القدرة الغازية من الخلايا السرطانية، أي غزو من قبل خلايا شديدة العدوانية تؤدي إلى تغييرات كبيرة في مقاومة الخلية والعكس بالعكس. توفر هذه التقنية ميزة اثنين أضعاف خلال الأساليب القائمة لقياس الغزو، مثل غرفة بويدن والمقايسات matrigel: 1) البطانية التفاعل خلية خلية للورم يحاكي بشكل وثيق في عملية الجسم الحي، و 2) يتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي، الوقت وأكثر قابلة للقياس بسهولة، خلافا لتحليل نقطة النهاية بالنسبة لطرق أخرى.

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

توضح هذه المقالة<em&gt; في المختبر</em&gt; تقنية لرصد الخلايا السرطانية الغازية من خلال أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. ويتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي بوصفها وظيفة من التغييرات في مقاومة على السطح من الأقطاب الكهربائية في أسفل جيدا.

في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

27.2K Views.  Georgetown University. توضح هذه المقالة في المختبر تقنية لرصد الخلايا السرطانية الغازية من خلال أحادي الطبقة من الخلايا البطانية. ويتم الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي بوصفها وظيفة من التغييرات في مقاومة على السطح من الأقطاب الكهربائية في أسفل جيدا.

Video: A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

تقييم امتصاص الجسيمات النانوية في الأورام في الوقت الحقيقي باستخدام التصوير Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

متعدد الفوتون التصوير من غزو خلايا الورم في الفأر نموذج مثلي الفم سرطان الخلايا الحرشفية

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

النمذجة والتصوير 3 الأبعاد غزو الخلية الجماعية

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

والتعديل<em&gt; في المختبر</em&gt; الغزو الفحص لتحديد الدور المحتمل للالهرمونات، السيتوكينات و / أو عوامل النمو في التوسط السرطان غزو الخلايا

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

تقييم سرطان المبيض كروي مرفق وغزو الخلايا الظهارية في الوقت الحقيقي

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

عزل خلايا الإنسان اللمفاوي البطانية التي كتبها متعدد المعلمة تنشيط الإسفار الفرز خلية

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...