يوضح هذا البروتوكول أن الجمع بين معاملة الحمض النووي الريبي الرسول للإحساس مع القياسات في الوقت الفعلي القائمة على المعاوقة لهجرة الخلايا وغزوها يسهل تحديد الجينات التي تحفز هجرة الخلايا السرطانية وغزوها. يتيح نظام تحليل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة المراقبة الكمية والمستمرة والشاملة لهجرة الخلايا السرطانية عند تغيرات التعبير الجيني. يمكن تحديد الجينات التي تفرط في التعبير عن الأورام وتحفز هجرة الخلايا السرطانية كهدف محتمل لمنع ورم خبيث في علاج السرطان.
للبدء ، أضف 10 ميكرولتر من محلول تفاعل 10x ، و 1.5 ميكرولتر من PNE واحد ، و 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لخطية الحمض النووي للبلازميد مع إنزيم القطع. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 100 ميكرولتر. امزجه عن طريق النقر عليه وتدويره لأسفل قبل احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة سلزية طوال الليل.
مرة أخرى ، قم بتدويره وأضف خمسة ميكرولترات من 10٪ SDS ، وميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل ملليلتر من بروتين درجة RNA K إلى خليط التفاعل قبل خلطه وتدويره لأسفل. بعد 30 دقيقة من الحضانة عند 50 درجة مئوية ، أضف ميكرولتر لكل منهما 10x من المخزن المؤقت للنسخ ، و ATP ، و GTP ، و UTP ، و CTP ، و T7 ، وميكروغرام واحد من الحمض النووي الخطي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق لتخليق الحمض النووي الريبي بوساطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. أضف الماء الخالي من النيوكلياز ليصل حجم التفاعل إلى 20 ميكرولتر.
بعد الدوران لأسفل ، احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة سلزية لمدة ساعتين لتخليق الحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، قم بتدويره وأضف ميكرولترا واحدا من الحمض النووي وانقر قبل 15 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية لإزالة قالب الحمض النووي. ابدأ ترسيب كلوريد الليثيوم للحمض النووي الريبوزي بإضافة 10 ميكرولترات من 7.5 مولار كلوريد الليثيوم إلى خليط التفاعل.
بعد النقر والدوران لأسفل ، احتضان خليط التفاعل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 دقيقة. لتغطية الحرارة ، قم بتسخين عينة الحمض النووي الريبي عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ضعها على الجليد للتبريد. بعد ذلك ، أضف مكونات تفاعل السد واخلطها عن طريق النقر.
أدر الخليط واحتضانه عند 37 درجة سلزية لمدة ساعة واحدة. بالنسبة لمخلفات poly-A ، قم بتدوير العينة لأسفل وأضف مكونات تفاعل المخلفات poly-A. ثم اضغط على خليط التفاعل ثم أدره لأسفل واحتضنه عند 37 درجة سلزية لمدة ساعتين.
لترسيب كلوريد الليثيوم والقياس الكمي للحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي ، أضف 50 ميكرولترا من 7.5 مولار كلوريد الليثيوم وقم بإجراء ترسيب كلوريد الليثيوم. قم بإزالة حصة من مخزون جل ECM من الفريزر واحتفظ بها على الجليد. قم بتخفيف 10 ملليغرام لكل لتر من جل ECM إلى تركيز العمل عن طريق خلط 990 ميكرولتر من DMEM مع 10 ميكرولتر من هلام ECM في أنبوب طرد مركزي صغير.
تخلط عن طريق ماصة لطيفة. أضف 60 ميكرولترا من جل ECM المخفف إلى كل بئر من الآبار ال 16 في الغرفة العلوية للوحة CIM. ضع الحجرة العلوية للوحة CIM مع غطاء اللوحة على ورقة بلاستيكية واقية داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع ساعات تقريبا لتشكيل طبقة هلام.
للتثقيب الكهربائي ، أضف ملليلتر واحد من DPBS إلى تعليق الخلايا السرطانية في كل أنبوب. اضغط على تعليق الخلية وقم بتدويره لأسفل ثلاث مرات لمدة 10 ثوان. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة.
أضف 110 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق R إلى حبيبات الخلية للحصول على 0.1 مليون خلية في 10 ميكرولتر. أضف mRNA الاصطناعي إلى حبيبات الخلية للحصول على تركيز 0.2 إلى 20 نانوجرام لكل ميكرولتر اعتمادا على مستوى التعبير المطلوب. امزج وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق عن طريق النقر.
بعد ذلك ، قم بالكهرباء 10 ميكرولتر من تعليق الخلية بنظام التثقيب الكهربائي عند 1،350 فولت لمدة 10 مللي ثانية مع ثلاث نبضات في كل مرة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بنقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد يحتوي على 1.1 ملليلتر من DMEM يحتوي على 0.5٪ FBS. افتح برنامج التحليل بالنقر المزدوج على أيقونة برنامج تحليل الخلايا في الوقت الفعلي.
بعد فتح خيار إعداد نمط التجربة التلقائي، حدد خيار تشغيل ثلاث تجارب بشكل منفصل. افتح كل مهد بالنقر فوق علامة تبويب الرقم. بعد ذلك، انقر على علامة التبويب ملاحظات التجربة.
حدد المجلد واحفظ البيانات عن طريق إدخال اسم التجربة. انقر فوق علامة تبويب التخطيط وحدد أربعة آبار في وقت واحد لإعداد الآبار الرباعية المكررة لكل حالة معالجة. أدخل معلومات العينة وانقر على تطبيق.
انقر فوق علامة التبويب الجدول الزمني ، ثم أضف خطوة لإعداد وضع الخطوتين لقياسات مقاومة الخلية. ثم انقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الأولى. انقر فوق إضافة خطوة مرة أخرى وأدخل 10 دقائق للفاصل الزمني و 48 ساعة لمدة الهجرة والغزو.
ثم ، انقر فوق تطبيق لإعداد الخطوة الثانية. قبل ساعة واحدة من قياس مقاومة الخلية ، أضف 160 ميكرولترا من DMEM تحتوي على مصل 10٪ أو جاذبات كيميائية أخرى إلى آبار الغرفة السفلية للوحة CIM. قم بتجميع الغرفة العلوية التي تحتوي على الآبار المطلية بهلام ECM للغزو أو الآبار غير المطلية للهجرة مع الغرفة السفلية.
لفحص هجرة الخلايا ، أضف 50 ميكرولترا من وسط المصل المنخفض إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM. ضع لوحة CIM ومهد النظام في حاضنة CO2. انقر فوق علامة تبويب الرسالة.
بمجرد أن يكون الاتصال على ما يرام ، يتم عرض الرسالة ، تكون لوحة CIM جاهزة للتجربة. احتضان لوحة CIM المجمعة مسبقا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 إلى 60 دقيقة قبل تحليل الخلية في الوقت الفعلي لتأقلم لوحة CIM مع حالة الثقافة. لقراءة خط الأساس ، انقر فوق زر البدء لكل مهد.
عند ظهور نافذة حفظ باسم، احفظ الملف التجريبي لتنفيذ القراءة الأساسية. بالنسبة لمقاعد الخلايا ، قم بإزالة لوحة CIM من المهد وضعها في خزانة السلامة البيولوجية على حامل اللوحة. ثم أضف 100 ميكرولتر من الخلايا الكهربائية التي تحتوي على 100،000 خلية إلى آبار الغرفة العلوية للوحة CIM ، واترك لوحة CIM تحت خزانة السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
قم بقياس مقاومة الخلية عن طريق تحريك لوحة CIM المجمعة بالكامل إلى المهد المعني. ابدأ قياس مقاومة الخلية للخطوة الثانية بالنقر فوق زر بدء المهد وفي علامة تبويب الرسم. ثم انقر فوق الزر "إضافة الكل" وحدد مربعات المتوسط والانحراف المعياري لتصور البيانات في الوقت الفعلي.
أدى التثقيب الكهربائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U 118 mg بتركيزات متفاوتة من الكراك الاصطناعي mRNA واحد إلى زيادة تعتمد على التركيز في بروتين الكراك الموسوم بعلامة واحد بعد يوم واحد من النقل. أدى 0.2 واثنين نانوجرام لكل ميكرولتر mRNA إلى تعبير غير قابل للكشف أو متواضع عن بروتين الكراك الخارجي واحد. أدى 20 نانوجرام لكل ميكرولتر mRNA إلى مستوى تعبير أعلى من بروتين الكراك الداخلي واحد.
أشار فحص هجرة الخلايا إلى أن التثقيب الكهربائي كان 0.2 أو نانوجرام لكل ميكرولتر صدع واحد mRNA لم يؤثر بشكل كبير على هجرة الخلايا. ومع ذلك ، أدى التثقيب الكهربائي مع 20 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي الريبوزي المرسال إلى تحفيز واضح لهجرة الخلايا مع هجرة المزيد من الخلايا بين ساعتين و 13 ساعة مما يكشف أن هجرة خلايا الورم الأرومي الدبقي قد حفزتها الزيادة في مستوى بروتين الكراك واحد. أدى التثقيب الكهربائي باستخدام الكراك الصناعي L mRNA إلى تعبير قوي عن بروتين الكراك L الموسوم بالعلم بعد يوم واحد من النقل.
تباطأ غزو الخلايا الضابطة مع زيادة تركيز بروتين ECM. أظهر الكراك L فوق الخلايا المعبرة انخفاضا يعتمد على تركيز هلام ECM في غزو الخلايا. أشارت المقارنة بين التحكم والكراك L على خلايا التعبير بتركيزات مختلفة من هلام ECM إلى أن الإفراط في التعبير عن الكراك L يحفز بشكل عام غزو الخلايا من خلال طبقة هلام ECM.
أشارت النتائج أيضا إلى أن مجموعتي الخلايا تأثرتا بشكل مختلف بزيادة تركيز هلام ECM في نقاط زمنية مختلفة. يجب إعادة تعليق الخلايا بسرعة ورفق وبشكل كامل في التثقيب الكهربائي للأشخاص في الفقاعة R المعاد تعليقها لأن الحضانة الطويلة للخلايا في الفقاعة R المعاد تعليقها تجعل الخلايا غير صحية. يمكن عزل الخلايا السرطانية المهاجرة السريعة والبطيئة لتوصيف الاختلافات بين مجموعتي الخلايا.
