עבודה זו נתמכה בנדיבות על ידי כספים מהקרן לילדים סרטן (בולטימור, MD), ברנדון לי קרינגטון קרן (סילבר ספרינג, מרילנד), DOD (W81XWH-10-1-0137) ו-NIH (R01CA108641). ברצוננו להודות לד&quot;ר אנטון Wellstein וחברי המעבדה שלו לשיתוף הניסיון שלהם ועוזר לנו לייעל את השיטות שהוצגו.

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע את כל השלבים בתנאים סטריליים במכסת מנוע בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת xCELLigence ממוקמת 37 מעלות צלזיוס חממה בנוכחות של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתאי HUVEC מעבר נמוכים, רצוי לא יותר מ 6 מעבר. כמו כן, ודא כי התאים הם לא יותר מ 75% ומחוברות בזמן קציר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי HUVEC גדלים בתקשורת EGM-2 מחדש עם ערכת EGM-2 כדור (Lonza Biosciences) המכילה גורמי גדילה, תוספי מזון ו5% בסרום שור העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל העקבות של טריפסין יש להסיר מהשעיות תא על ידי תאים מסתובבים ב200xg, שטיפת פעם עם PBS, וresuspending לצפיפות תאים מצוינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> xCELLigence מעיל E-צלחת 16 עם 0.1% ג&#39;לטין במשך שעה 1 ב 37 ° C או הלילה ב 4 ° C. לשטוף צלחת עם PBS ולהוסיף EGM-2 המשוחזרת 100μL תקשורת. לבצע קריאה ריקה במערכת xCELLigence למדוד רקעעכבה בהעדר תאים. </li></ol> 2. יצירת HUVEC monolayer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר בקבוק תת ומחוברות של תאי HUVEC ידי trypsinization. תאי Resuspend בEGM-2 מדיה המשוחזרת לצפיפות סופית של 2.5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היטב בכל רקע מכויל דואר צלחת המכיל EGM-2 מדיה 100μL, להוסיף 100μL של ההשעיה תא HUVEC (2.5 10 4 תאי HUVEC X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להתקין דואר פלייט במכשיר xCELLigence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכנת xCELLigence תכנית לבצע קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן לתאי אנדותל לגדול במשך 18-21 שעות עד שהם יוצרים monolayer, כפי שמעיד על ידי השטחה של מדד תא (איור 2). </li></ol> 3. תוספת של פולשים לתאים ונורמליזצית נתונים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שmonolayer HUVEC יציב יצרה, תאים סרטניים על ידי קציר trypsinization וresuspend למאורות סופייםity של 1 x 10 5 תאים / מ&quot;ל בתקשורת משמשת לגידול תאים סרטניים (כמו RPMI או מדיה DMEM המכיל 10% FBS) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קריאות עכבת הפסקה על תוכנת xCELLigence ולהסיר דואר פלייט מהתחנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת EGM-2 על ידי שאיפה. הוסף 100μL של השעיה תא גידול המכילה 1 x 10 4 תאים. באופן כללי, יחס 1:2.5 של תאים סרטניים: בתאי אנדותל זורעים, עובד הכי טוב עבור assay. עם זאת, היחס יכול להיות מותאם לשורות תאים בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את דואר הצלחת על מערכת xCELLigence בחממה ולהמשיך קריאות עכבה במרווחים של 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלישה יכולה להיות במעקב בזמן אמת על 6-12 שעות הקרובות כמו ירידה במדד תא בשל הנסיגה של הצמתים אנדותל וחדיר של פולשים לתאים סרטניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את התוצאות לזמן של תוספת של פולשים לתאים סרטניים. התוכנה מאפשרת xCELLigence נורמליזציה לכל נקודת זמן ותוצאותניתן לצפות ישירות בחלון התוכנה. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמה לפלישת monolayer HUVEC ידי תאים גרורתי ולא גרורתי מוצגת באיור 3. K7M2 הוא שורת תאי אוסטאוסרקומה גרורתי. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של חלבון ezrin מקשר cytoskeletal, המהווה את המאפיינים פולשני של קו תא זה 13,14. כאשר תאי HUVEC מאותגרים עם K7M2 תאים, יש ירידה בהתנגדות חשמלית בתוך 6 שעות. ירידה זו בהתנגדות חשמלית מייצגת את הפלישה לmonolayer HUVEC על ידי תאי הגידול הפולשים. תא אונליין K12, לעומת זאת, מבטא רמות נמוכות יותר של ezrin וכתוצאה מכך היא פחות גרורתי 13. מאתגר את monolayer HUVEC עם תוצאות K12 תאים בירידה תלולה פחות בהתנגדות כמו התאים אינם מסוגלים לדבוק או לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 3). <imgsrc = גובה &quot;/ files/ftp_upload/2792/2792fig1.jpg&quot; = &quot;איור 1&quot; /&gt; איור 1. תרשים סכמטי של תהליך זרימת עבודה לפלישה של תאי האנדותל ידי תאי גידול. תאי HUVEC הם מצופים ב E-צלחות מצופים ג&#39;לטין ואפשרו ליצירת monolayer מחוברות. תאים ממאירים מתווספים פעם monolayer יצרה ופלישה מנוטרת בזמן אמת כמדד התא משתנה עקב פלישה של monolayer אנדותל. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. היווצרות monolayer HUVEC. שינויים במדד תא כתאי HUVEC לצרף ולהתפשט על אלקטרודות זהב ג&#39;לטין מצופות. היווצרות monolayer ומחוברת מיוצגת על ידי התייצבות במדד תא לאחר 18 שעות. <img src="/files/ftp_upload/2792/2792fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. פלישה של תאי HUVEC ידי K7M2 וK12 תאי אוסטאוסרקומה. ירידה חדה בcelL-מדד מתרחש בתוך כמה שעות של ההקדמה של K7M2 תאים גרורתי מאוד. K12 תאים, לעומת זאת, הם פחות גרורתי ולא מצליחין לחדור monolayer האנדותל בצורה יעילה ככל K7M2 תאים. זה מיוצג על ידי ירידה פחות חדה במדד תא כאשר monolayer HUVEC הוא קרא תיגר עם K12 תאים. שליטה מייצגת עכבה של monolayer HUVEC בהיעדרם של תאים סרטניים. ניסויים בוצעו בשלושה עותקים.

<ol>
	<li>Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+The+metastasis+cascade.">Cancer. The metastasis cascade.</a> Science. 321, 1785-1787 (2008).</li><li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+metastasis.">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359, 2814-2823 (2008).</li><li>Orr, F. W., Wang, H. H., Lafrenie, R. M., Scherbarth, S., Nance, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+cancer+cells+and+the+endothelium+in+metastasis.">Interactions between cancer cells and the endothelium in metastasis.</a> J Pathol. 190, 310-329 (2000).</li><li>Bacac, M., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+cancer+cell.">Metastatic cancer cell.</a> Annu Rev Pathol. 3, 221-247 (2008).</li><li>Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+signals+from+the+invasive+front.">New signals from the invasive front.</a> Nature. 441, 444-450 (2006).</li><li>Kramer, R. H., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+tumor+cells+with+vascular+endothelial+cell+monolayers:+a+model+for+metastatic+invasion.">Interactions of tumor cells with vascular endothelial cell monolayers: a model for metastatic invasion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76, 5704-5708 (1979).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 3761-3764 (1984).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromotion+of+mammalian+cells+measured+electrically.">Micromotion of mammalian cells measured electrically.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7896-7900 (1991).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 7919-7923 (1992).</li><li>Whipple, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+promotes+tubulin+Detyrosination+and+Microtentacles+that+enhance+endothelial+engagement.">Epithelial-to-mesenchymal transition promotes tubulin Detyrosination and Microtentacles that enhance endothelial engagement.</a> Cancer Res. 70, 8127-8137 (2010).</li><li>Boyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-microelectronic+sensing+technique+for+profiling+cytotoxicity+of+chemicals.">A cell-microelectronic sensing technique for profiling cytotoxicity of chemicals.</a> Anal Chim Acta. 615, 80-87 (2008).</li><li>Khanna, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane-cytoskeleton+linker+ezrin+is+necessary+for+osteosarcoma+metastasis.">The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis.</a> Nat Med. 10, 182-186 (2004).</li><li>Ren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin-cytoskeleton+linker+protein+ezrin+is+regulated+during+osteosarcoma+metastasis+by+PKC.">The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC.</a> Oncogene. 28, 792-802 (2009).</li></ol>

עלות הפרסום לכתב היד הזה היה מספק בנדיבות על ידי חברת רוש מדע יישומי.

Assay פלישת HUVEC בזמן אמת הוא שיטה פשוטה, אך רב עוצמה לניטור פלישה. הוא מספק תוצאות בזמן אמת, שהוא יתרון משמעותי על פני שיטות מסורתיות אחרות המסתמכות על ניתוח נקודת סיום. Assay יכול להיות שונה כדי בדיקת סמים, נוגדנים, ligands וחלבונים כמעכבים או stimulators של גרורות. ההשפעה של סוכנים שונים על תא האנדותל / הסרטן צולב שיחה ניתן להעריך גם כן. כאשר מציגים את הסוכנים חיצוניים, כגון גורמי גדילה ותרופות בתקשורת ובתרבות, חשוב לוודא שהם אינם משפיעים על שלמות monolayer HUVEC. שיבוש monolayer HUVEC ניתן לבדוק על ידי החדרת סוכן אקסוגני בהיעדרו של פולשים לתאים, ולהבטיח כי לא יחולו שינוי במדד תא. לפיכך, שליטה ובקרה נאותה צריכה להיכלל כחלק מעיצוב ניסיוני. שונה סלולריים קווים להפגין עקומות תא מדד שונות כפי שהם יוצרים confmonolayer luent. הצורה של העקומה, כמו גם את המקסימום השיג תא מדד, היא סוג תא מסוימת. תאי HUVEC להראות אופייני השטחה של מדד תא חולף 4-6 שעות לאחר זריעה, ואחרי ייצוב נוסף במדד תא גבוה יותר לאחר 16-18 שעות. לפיכך, חשוב לתת לתאים בצורה monolayer ומחוברת ללפחות 18 שעות לפני התוספת של תאים סרטניים. מאז מדד התא תלוי בסביבה יונית בשלבי ביניים אלקטרודה / תא, גורמים שונים, כגון תאי מורפולוגיה ואיכות של הידבקויות תאי תאים להשפיע על תאי המדד, בנוסף לאזור התחתון המכוסה היטב. לכן, הירידה במדד תא, אשר מתרחשת על פלישת תאי גידול, היא פונקציה של מספר גורמים, הכוללים נסיגה של צמתים האנדותל ופלישת תא גידול שלאחר מכן. מכשיר xCELLigence מיוצר בשלוש תצורות שונות: מנתח סלולרי בזמן אמת(RTCA) SP, RTCA MP וRTCA עקורים. מכשיר SP RTCA מחזיק אחד E-96 גם צלחת ואילו מכשיר MP RTCA יכול להכיל עד שישה 96, גם E-צלחות בו זמנית. זה מאפשר להקרנת תפוקה גבוהה של תרופות ותרכובות. את הניסויים במאמר זה מבוצעים באמצעות המכשיר העקורים RTCA, שיכול להחזיק שלוש צלחות E-16-כן. כל תחנת דואר צלחת החזקה יכולה להיות מופעלת באופן עצמאי, המאפשרת למשתמשים מרובים כדי להריץ ניסויים בו זמנית. המכשיר העקורים RTCA יכול לשמש גם כדי ללמוד הגירה באמצעות CIM צלחות. אלה הם 16 צלחות היטב עם תאים עליונים ותחתונים מופרדים בפוליאתילן terephtalate (PET) קרום עם גודל נקבובית החציוני של 8um. החיישנים האלקטרוניים הממוקמים בחלק התחתון של הקרום הנקבובי של החדר העליון. התא התחתון משמש כמאגר לchemoattractant לתאים בחדר העליון. עם זאת, יתרון גדול של assay פלישת HUVEC על CIM הצלחות הוא שפלישת תא גידול בי לשעברזה לא מוגבל על ידי הגודל הנקבובית, כמו פלישת תא אנדותל תלוי בצולבת שיחה בין התאים הסרטניים ואנדותל. Assay פלישת HUVEC יכול גם להתבצע במכשיר Z ECIS, המיוצר על ידי אפלייד ביופיסיקה (טרוי, ניו יורק). מכשיר Z ECIS מנצל טכנולוגיה דומה למכשיר xCELLigence, עם הבדלים בתצורות המערך ואלקטרודה. יש לנו לבצע בהצלחה מבחני פלישת HUVEC באמצעות מערכי ECIS 8-כן. חשוב לציין כי שטח הפנים התחתון גם הוא גדול יותר במערכי ECIS, אשר דורש מספר גדול יותר של תאי האנדותל וגידול להיות מצופה: 2.5 x 10 5 ו 1 x 10 5 תאי בהתאמה.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 	<th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr> 
 <tr>
 	<td>xCELLigence RTCA DP station</td>
 <td>Roche	</td>
 <td>05469759001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>RTCA control unit</td>
 <td>Roche</td>
 <td>05454417001</td>
 <td>Notebook with preinstalled RTCA software</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>E-Plate 16</td>
 <td>Roche</td>
 <td>05469830001</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>HUVEC cells</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-2517</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>EGM-2 media</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-3156</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>EGM-2 bullet kit</td>
 <td>Lonza</td>
 <td>CC-4176</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td>0.1% Gelatin in 
sterile H2O
</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>MCPROTO045</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells

הפצה גרורתי של תאים ממאירים דורשת פירוק של קרום במרתף, התקשרות של תאים סרטניים להאנדותל של כלי דם, נסיגה של צמתים האנדותל וסופו של דבר פלישה והגירה של תאים סרטניים באמצעות שכבת האנדותל כדי להיכנס למחזור הדם כאמצעי תחבורה לאתרים מרוחקים בשורה 1-3. פעם אחת במערכת הדם, תאים סרטניים לדבוק נימי קירות וextravasate לרקמה שמסביב כדי ליצור גידולים גרורות 4,5. הרכיבים השונים של אינטראקציה תא תא האנדותל גידול יכולים להיות משוכפלים במבחנה על ידי מאתגר monolayer של תאים אנושיים טבור וריד אנדותל (HUVEC) עם תאים סרטניים. שבוצעו עם אלקטרונים ומיקרוסקופ שלב בניגוד מחקרים מראים כי ברצף של אירועי מבחנה למדי לייצג את in vivo תהליך גרורתי 6. כאן, אנו מתארים טכניקה מבוססת חשמל, המנטרת את עכבה ומכמתת בזמן אמת על invasיון של תאי האנדותל ידי תאי גידול ממאירים. Giaever וKeese תוארו לראשונה טכניקה למדידת תנודות בעכבה כאשר אוכלוסייה של תאים גדלות על פני השטח של אלקטרודות 7,8. מכשיר xCELLigence, המיוצר על ידי חברת רוש, מנצל טכניקה דומה כדי למדוד שינויים בעכבה חשמלית כתאים לצרף ולהתפשט בצלחת התרבות מכוסות במערך microelectrode זהב המכסה כ -80% משטח בתחתית באר. ככל שתאים לצרף ולהתפשט על פני האלקטרודה, זה מוביל לעלייה בעכבה חשמלית 9-12. העכבה מוצגת כפרמטר נקרא תא מדד חסר ממדים, העומדים ביחס ישר לשטח הכולל של רקמות התרבות היטב כי הוא מכוסה על ידי תאים. לפיכך, ניתן להשתמש בתאי המדד לפקח הידבקות תא, מתפשט, מורפולוגיה וצפיפות תאים. Assay הפלישה מתואר במאמר זה מבוסס על שינוייםבעכבה חשמלית באלקטרודה ביניים / תא, כאוכלוסייה של תאים ממאירים לפלוש דרך monolayer HUVEC (איור 1). שיבוש צמתים אנדותל, ההכחשה של monolayer האנדותל והחלפה על ידי תאים סרטניים יוביל לשינויים גדולים בעכבה. שינויים אלו לתאם ישירות עם הקיבולת פולשנית של תאים סרטניים, כלומר, פלישה על ידי תאים אגרסיביים מאוד להוביל לשינויים גדולים בעכבת תא ולהיפך. טכניקה זו מספקת יתרון כפול על פני שיטות קיימות של מדידת פלישה, כגון וידן הקאמרית ומבחני Matrigel: 1) האינטראקציה תא תא האנדותל גידול מחקה באופן הדוק יותר בתהליך vivo, ו2) הנתונים מתקבל בזמן אמת, זמן, והוא בקלות רבה יותר לכימות, בניגוד לניתוח נקודת סיום לשיטות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells at JoVE.com

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

מאמר זה מתאר<em&gt; במבחנה</em&gt; טכניקה לתאים סרטניים באמצעות ניטור הפולש monolayer של תאי האנדותל. הנתונים שנרכשו בזמן אמת כפונקציה של שינויים בעכבה על פני השטח של אלקטרודות בתחתית היטב.

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

a-real-time-electrical-impedance-based-technique-to-measure-invasion

Research

JoVE Journal

Medicine

27.2K Views.  Georgetown University. מאמר זה מתאר במבחנה טכניקה לתאים סרטניים באמצעות ניטור הפולש monolayer של תאי האנדותל. הנתונים שנרכשו בזמן אמת כפונקציה של שינויים בעכבה על פני השטח של אלקטרודות בתחתית היטב.

Video: A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

הערכה של ספיגת nanoparticle ב גידולים בזמן אמת באמצעות הדמיה Intravital

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-פוטון הדמיה של הפלישה תאים סרטניים במודל עכבר orthotopic של קרצינומה של תאים קשקשיים אוראלי

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy tissue is the root cause of disease and death. For other cancers (e.g. breast, lung, etc.), it is the process of metastasis, in which tumor cells move from a primary tumor mass, colonize distal sites and ultimately contribute to organ failure, that eventually leads to morbidity and mortality 3. It has been estimated that invasion and metastasis are responsible for 90&#37; of cancer deaths 4. As a result, there has been intense interest in identifying the molecular processes and critical protein mediators of invasion and metastasis for the purposes of improving diagnosis and treatment 5.
A challenge for cancer scientists is to develop invasion assays that sufficiently resemble the in vivo situation to enable accurate disease modeling 6. Two-dimensional cell motility assays are only informative about one aspect of invasion and do not take into account extracellular matrix (ECM) protein remodeling which is also a critical element. Recently, research has refined our understanding of tumor cell invasion and revealed that individual cells may move by elongated or rounded modes 7. In addition, there has been greater appreciation of the contribution of collective invasion, in which cells invade in strands, sheets and clusters, particularly in highly differentiated tumors that maintain epithelial characteristics, to the spread of cancer 8.
We present a refined method 9 for examining the contributions of candidate proteins to collective invasion 10. In particular, by engineering separate pools of cells to express different fluorescent proteins, it is possible to molecularly dissect the activities and proteins required in leading cells versus those required in following cells. The use of RNAi provides the molecular tool to experimentally disassemble the processes involved in individual cell invasion as well as in different positions of collective invasion. In this procedure, mixtures of fluorescently-labeled cells are plated on the bottom of a Transwell insert previously filled with Matrigel ECM protein, then allowed to invade "upwards" through the filter and into the Matrigel. Reconstruction of z-series image stacks, obtained by confocal imaging, into three-dimensional representations allows for visualization of collectively invading strands and analysis of the representation of fluorescently-labeled cells in leading versus following positions.

Models of tumor cell invasion into three-dimensional extracellular matrix better reflect the in vivo situation than two-dimensional motility assays. Using matrix invasion assays combined with confocal imaging of fluorescently-labeled cells, detailed information on invasion modes and the distinct contributions of leading versus following cells can be obtained.

מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity but little is known about their biology. Isolating highly pure human lymphatic endothelial cells (LECs) from diseased and healthy tissue would facilitate studies of the lymphatic endothelium at genetic, molecular and cellular levels. It is anticipated that these investigations may reveal targets for new therapies that may change the clinical management of these conditions. A protocol describing the isolation of human foreskin LECs and lymphatic malformation lymphatic endothelial cells (LM LECs) is presented. To obtain a single cell suspension tissue was minced and enzymatically treated using dispase II and collagenase II. The resulting single cell suspension was then labelled with antibodies to cluster of differentiation (CD) markers CD34, CD31, Vascular Endothelial Growth Factor-3 (VEGFR-3) and PODOPLANIN. Stained viable cells were sorted on a fluorescently activated cell sorter (FACS) to separate the CD34LowCD31PosVEGFR-3PosPODOPLANINPos LM LEC population from other endothelial and non-endothelial cells. The sorted LM LECs were cultured and expanded on fibronectin-coated flasks for further experimental use.

The goal of this protocol is to isolate lymphatic endothelial cells lining human lymphatic malformation cyst-like vessels and foreskins using fluorescence-activated cell sorting (FACS). Subsequent cell culturing and expansion of these cells permits a new level of experimental sophistication for genetic, proteomic, functional and cell differentiation studies.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...