نود أن نشكر هارون Selya للمناقشة مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI29575 ، CA108835 ، AI077097 لشبيبة ، ومنحة رائدة من جامعة جونز هوبكنز ومعهد أبحاث الملاريا في وزارة الدفاع لمنح PC 040972 MO

1. القرارات ، HLA - A2 - الإيج تستند aAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد عقيمة العازلة بورات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذوب في الماء حمض البوريك لجعل 0.1M. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصفية من خلال تصفية وتعقيم 0.22μm المحل في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد عقيمة العازلة اغسل الخرزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ 956ml PBS ث / س المغنيسيوم أو الكالسيوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30ml الإنسان AB المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة EDTA 2mm والتركيز النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1gsodium أزيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من خلال فلتر تصفية العقيمة 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ 1ml من الخرز Invitrogen إبوكسي M - 450 من الأوراق المالية ، وحوالي 400 مليون الخرز (يمكن عدها الخرز التي عدادة الكريات) ، ووضع في قارورة معقمة المسمار ، والزجاج العلوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة ضد المغناطيس Dynal MPC - 1 ، في حين أن حبات تلتزم جانب القارورة ، إزالة طاف بواسطة الطموح. تغسل حبات مرة واحدة مع من 1ml العازلة بورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في خليط من بورات 1ml العازلة و 20 ميكروغرام من HLA - A2 - الإيج ديمر و 20 ميكروغرام من خريطة موقع CD28 مكافحة الإنسان (استنساخ 9.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتين لاقتران حبة : ضع قارورة من الزجاج على المدورة وتناوب على 4 ساعات لمدة 24 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب في MPC - 1 المغناطيس وإزالة كافة العازلة بورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرتين مع 1ml العازلة اغسل الخرزة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان حبات في 1ml العازلة اغسل الخرزة ، وتناوب على 4 ساعات لمدة 24 درجة مئوية. لأن حبة العازلة اغسل يحتوي المصل AB الإنسان ، فإنه سيتم منع كل موقع بروتين ملزمة المتبقية على الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف من قارورة زجاجية ، مع استبدال 1ml جديدة عازلة اغسل الخرزة. </li></ol> 2. مراقبة جودة التحميل aAPC والببتيد والتخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ~ 5 × 10 5 حبات لFACS 100μl غسل الأنابيب العازلة في نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وصمة عار مع 1μl من الماوس مكافحة IgG1 - PE (التعرف على جزء من القطعة Fc HLA - A2 - IG) و1μl من الماوس مكافحة IgG2a - FITC (الاعتراف الجزء التيسير المضادة للCD28 ماب). بعد تلطيخ لمدة 20 دقيقة في FACS غسل العازلة ، ويغسل مرة أخرى وقراءة النتيجة مباشرة تلطيخ تدفق عداد الكريات (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الببتيد على حبات : تغسل حبات مرتين في قنينة زجاجية معقمة 1ml مع برنامج تلفزيوني. Resuspend 1ml العقيمة مع برنامج تلفزيوني ثم تضاف 10μl من الببتيد CMV (1mg/ml) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد حبات بواسطة عدادة الكريات ، والتسمية القارورة مع التاريخ والتركيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aAPC جاهزة للاستعمال بعد 3 أيام على الأقل حضانة الببتيد في 4 درجات مئوية ، لإتاحة الوقت الكافي للملزمة على الببتيد في ديمر HLA - A2 - الإيج. ويمكن تخزين حبات عند 4 درجة مئوية ، ويظل ساريا لمدة لا تقل عن 6 أشهر. </li></ol> 3. CTL عزلة الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ~ 100ML من الدم المحيطي جديدة من المانحين HLA - A2 صحية إيجابية إلى 10 دينار بحريني أنابيب الصوديوم Vacutainer الهيبارين. استخدام إبرة عيار 21 أو أكبر لمنع انحلال الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 300xg لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبقة البلازما بعناية من قبل كبار الطموح. يمكن استخدام البلازما وتكملة لمستنبت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال البلازما التي تم جمعها مع برنامج تلفزيوني العقيمة ونقل الدم في قارورة معقمة أو ثقافة T75 50ml أنابيب مخروطية. مزج الدم مع PBS جيدا pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يتم جمع كل الدم ، وإعداد أربعة أنابيب إضافية 50ml 15ml المخروطية وإضافة لFicoll - Paque بلس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراكب ببطء 30 35ml من خلايا الدم في أعلى Ficoll كل أنبوب. الحفاظ على واجهة متميزة بين Ficoll وخلايا الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 500xg لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تشغيل الفرامل &quot;قبالة&quot; ، والتسارع عند أدنى مستوى ممكن للحفاظ على واجهة واضحة بين الطبقات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة seriological ، نضح بعناية طبقة PBMC وجمع PBMC في أنبوب 50ml جديدة المخروطية. عندما يتم حصاد جميع PBMC إضافة 30ml من برنامج تلفزيوني وتدور 400xg لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف ويغسل مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني 30ml لإزالة كافة Ficoll المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى CD8 + الخلايا التائية العزلة باستخدام Miltenyi الإنسان CD8 + T عدة عزل الخلايا وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. هذه المجموعة يثري عالية لخلايا + CD8 (عادة&gt; 95 ٪) خلال استنزاف CD8 -- الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد CD8 + الخلايا التائية. وينبغي على نقاء المتوقع أن تكون أكبر من 95 ٪. لتأكيد هذا الاستخدام 2x10 5 الخلايا وإجراء تحليل FACS CD4/3/8. يمكن أن تكون إما CTL المتبقية استخدمت على الفور لمستضد معين أو التحفيز aAPC يمكن تجميدها لاستخدامها في المستقبل. </li></ol> 4. وفي المختبر aAPC نظام ثقافة تستند <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لTF (T عامل نمو الخلايا ، التي أدلي بها في مختبر 4) 2X مستنبت : استكمال RPMI المتوسطة بالإضافة إلى الجهات المانحة 5 ٪ ذاتي البلازما و 8 ٪ عامل نمو الخلايا التائية. </li><liيمكن أن تكون بديلا&gt; البلازما ذاتي من قبل الجهات المانحة للحرارة المعطل المصل AB الإنسان. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend 1000000 CTL في 8ml المتوسطة TF الثقافة 2X بالإضافة إلى 8ml المتوسطة RPMI كاملة ، إضافة 1 × 10 6 aAPC ، ومزيج جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pipetter استخدام متعدد القنوات للخلايا على 96 لوحة لوحات جيدا U الثقافة أسفل الأنسجة. (160 ميكرولتر لكل بئر) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 incubater لمدة 7 أيام. تغذية الخلايا في يوم 4 و 80 ميكرولتر / TF 2X جيدا المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا جاهزة للحصاد يوم 7. بعد الحصاد ، ومكان الخلايا ضد المغناطيس وإزالة aAPC القديمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تحديد خصوصية المستضد بواسطة تلطيخ tetramer وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تجرى داخل الخلايا وتلطيخ النمط الظاهري وفقا لتلطيخ خلوى 3 دراستنا السابقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن حصادها مع الخلايا replated aAPC مرة أخرى تحت نفس الظروف. ومن المتوقع أن عدد الخلايا وخصوصية لزيادة المستضد بعد التحفيز المتكرر. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ويرد مثال aAPC بعد الاقتران HLA - A2 الإيج ومكافحة CD28 في الشكل 4. نجاح الاقتران البروتين هو واضح من خلال تحول واضح للتلوين الأجسام المضادة المقابلة. في حين أن تواتر CMV CTL معينة في الدم المحيطي عادة 0.5-1 ٪ ، وبعد اسبوع واحد من aAPC بوساطة التحفيز ، ويمكن الوصول إلى خصوصية 55-93 ٪ (الشكل 2 و 3). ويمكن التوسع في CTL مستضد محددة تكون متغيرة جدا بين مختلف الجهات المانحة ، ولكن النتائج هي استنساخه داخل الجهة المانحة نفسها. بالاستقراء ، ويمكن التوسع في خلايا CMV تكون محددة آلاف أضعاف مقارنة مع مستويات السلائف فيفو السابقين مباشرة (لا تظهر البيانات). جواني تلطيخ خلوى (الشكل 3) يوضح أن هذه CTL الموسعة polyfunctional ، بدلا من استنفاد بعد زراعة الخلايا لفترات طويلة وانتشار كبير. <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. الممثل مخطط تدفق aAPC أساس التوسع فيفو السابقين من CTL الإنسان لالمناعي بالتبني في HSCT خيفي <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. تلطيخ tetramer الممثل نتيجة CTL CMV المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة aAPC بعد أسبوع واحد من الثقافة <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> (كانت خصوصية CMV 61 ٪) الشكل 3. الممثل تلطيخ خلوى الخلايا نتيجة CTL CMV محددة تم إنشاؤها بواسطة aAPC <img src="/files/ftp_upload/2801/2801fig4.jpg" alt="الشكل 4"/> الشكل 4. الممثل نتيجة تلون M - 450 الايبوكسي بعد الاقتران الخرز الملون مع بروتين مضاد الفأر IgG1 - PE ومكافحة الفأر IgG2 - FITC

<ol>
	<li>Walter, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+cellular+immunity+against+cytomegalovirus+in+recipients+of+allogeneic+bone+marrow+by+transfer+of+T-cell+clones+from+the+donor.">Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor.</a> N Engl J Med. 333, 1038-1038 (1995).</li><li>Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+transfer:+a+clinical+path+to+effective+cancer+immunotherapy.">Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 3669-3669 (2008).</li><li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nat Med. 9, 619-619 (2003).</li><li>Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+antigen-presenting+cells:+artificial+solution+for+real+diseases.">Artificial antigen-presenting cells: artificial solution for real diseases.</a> Trends Mol Med. 11, 412-412 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نظام aAPC وصفنا هنا هو وجود نظام فعال للتوسع خارج الجسم الحي من CTL الإنسان ضد مجموعة متنوعة من مولدات المضادات. يجب توخي الحذر خاصة فيما يتعلق بنوعية تصريف البروتين والتوزيع حتى aAPC CTL والثقافة في لوحة 96 - جيدا. باستخدام هذا النهج كنا قادرين على توسيع CTL لأكثر من 8 أسابيع ، حيث نجحنا في توسيع مستضد محددة CTL يصل الى 4 ملايين أضعاف. كانت هناك عدة نظم APC الاصطناعية التي تستخدم خطوط الخلايا أو غيرها من المنصات ديكي 5 ، ولكن وفقا لبيانات نشرت كل نظام ومكانتها الفريدة في ما يتعلق بتوسيع ودعم التطبيقات خصوصية مختلفة. الأهم ، لأن نوعية CTL لا يقل أهمية عن الكمية ، ومن المتوقع أن polyfunctionality من CTL CMV الخاصة التي تم إنشاؤها بواسطة نظامنا للتشاور متفوقة المضادة للفيروسات الكفاءة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> Vacutainer أنبوب (يحتوي على الهيبارين) </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 367874 </td></tr><tr><td> الإنسان CD8 + الخلايا التائية عدة العزلة </td><td> Miltenyi </td><td> 130-094-156 </td></tr><tr><td> Dynabeads M - 450 إبوكسي </td><td> Invitrogen </td><td> 140.11 </td></tr><tr><td> Dynal MPC - 1 المغناطيس </td><td> Invitrogen </td><td> 120 01D </td></tr><tr><td> Ficoll - Paque بلس </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RPMI المتوسط ​​1640 </td><td> Gibco </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> HLA - A2 - X الإيج ديمر </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 551263 </td></tr><tr><td> iTAgMHC tetramer (HLA - A2 - CMV) - PE </td><td> بيكمان كولتر </td><td> T20099 </td></tr><tr><td> الصقر واضحة بشكل جيد 96 - وحة Microtest </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 353077 </td></tr><tr><td> مكافحة الفئران الفأر IgG2a - FITC </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 553390 </td></tr><tr><td> الماعز المضادة للماوس IgG1 - PE </td><td> Invitrogen </td><td> P21129 </td></tr><tr><td> مصل بشري نوع AB </td><td> اتلانتا البيولوجية </td><td> S40110 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8a - FITC </td><td> سيغما الدريخ </td><td> F0772 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية CD8a - APC </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 340684 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية IFNγ - FITC </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 340449 </td></tr><tr><td> الماوس المضادة للبشرية TNFα - PE </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 340512 </td></tr></tbody></table>

hla-ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human ctl

CTL مع وظيفة المستجيب الأمثل تلعب أدوارا حاسمة في التوسط في الحماية ضد الأمراض المختلفة والخلايا السرطانية. ومع ذلك ، قد يحمل الأفراد المكروية المناعي القمعية ، وعلى النقيض من تفعيل CTL ، زنزاناتهم مستضد ذاتي قد تميل إلى تقديم tolerize أو anergize CTL مستضد معين. نتيجة لذلك ، وإن كانت لا تزال في مرحلة تجريبية ، وقد تطورت على أساس CTL المناعي بالتبني لتصبح واعدة لعلاج لمختلف الأمراض مثل السرطان والالتهابات الفيروس. في التجارب الأولية التي استخدمت في خارج الجسم الموسعة CMV (المضخم للخلايا) CTL محددة للعلاج من عدوى في CMV المناعة خيفي مرضى زرع نخاع العظم. في حين أنه من الشائع أن تهدد الحياة viremia CMV في هؤلاء المرضى ، أي من المرضى الذين يتلقون توسيع CTL تطوير CMV مرض ذات الصلة ، مما يعني ضمنا تأسيس مناعة مضادة للCMV من CTL نقل adoptively 1. وتم أيضا نتائج واعدة لوحظ سرطان الجلد ، ويمكن توسيعه ليشمل أنواع أخرى من السرطان 2. في حين أن هناك العديد من الطرق لتحفيز الجسم الحي السابقين وتوسيع CTL الإنسان ، وتقتصر المناهج الحالية من قيود التكلفة والتقنية. على سبيل المثال ، يعتمد معيار الذهب الحالي على استخدام العاصمة ذاتي. هذا يتطلب من كل مريض على التبرع بعدد كبير من الكريات البيض ، وأيضا مكلفة جدا وشاقة. وعلاوة على ذلك ، فقد كشفت تفاصيلها في توصيف المختبر من العاصمة توسيع CTL أن هذه وظيفة المستجيب الأمثل فقط 3. هنا نقدم كفاءة عالية aAPC نظام قائم للتوسع خارج الجسم الحي من CTL CMV الإنسان محددة لعلاج مناعي بالتبني (الشكل 1). قدمت من قبل اقتران aAPC الخلية الخرز المغناطيسي الحجم مع ديمر HLA - A2 - الإيج الإنسان ومكافحة CD28mAb 4. مرة واحدة مصنوعة aAPC ، يمكن تحميلها مع الببتيدات مختلف المصالح ، ويظل ساريا لمدة شهور. في هذا التقرير ، تم تحميلها aAPC مع الببتيد المهيمنة من CMV ، pp65 (NLVPMVATV). بعد زرع النقي الإنسان CD8 + CTL من متبرع صحية مع aAPC لمدة أسبوع ، ويمكن زيادة CMV CTL محددة بشكل كبير في نوعية ما يصل الى 98 ٪ (الشكل 2) وتضخيمها أكثر من 10000 مرة. إذا كانت مطلوبة أكثر CMV CTL محددة ، ويمكن تحقيق مزيد من التوسع بسهولة عن طريق التحفيز المتكرر مع aAPC. توصيف المظهري وظيفية تظهر هذه الخلايا لديها ذاكرة موسعة المستجيب النمط الظاهري ، وجعل كميات كبيرة من كلا TNFα وIFNγ (الشكل 3).

Watch this Scientific Journal Video about HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL at JoVE.com

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

وصفت طريقة جديدة مستقلة عن العاصمة الاستقراء وتوسيع خلايا محددة مستضد تي. يتم تحميل HLA - A2 الإيج المعتمدة على خلايا مولدة تقديم الاصطناعي (aAPC) مع HLA - A2 الببتيدات يقتصر على توسيع بكفاءة CTL من خصوصية المستضد متنوعة. هذه التكنولوجيا يحمل إمكانات كبيرة للCTL المستندة المناعي بالتبني.

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

hla-ig-based-artificial-antigen-presenting-cells-for-efficient-ex

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

15.3K Views.  Johns Hopkins University. وصفت طريقة جديدة مستقلة عن العاصمة الاستقراء وتوسيع خلايا محددة مستضد تي. يتم تحميل HLA - A2 الإيج المعتمدة على خلايا مولدة تقديم الاصطناعي (aAPC) مع HLA - A2 الببتيدات يقتصر على توسيع بكفاءة CTL من خصوصية المستضد متنوعة. هذه التكنولوجيا يحمل إمكانات كبيرة للCTL المستندة ال...

Video: HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

توسيع فيفو السابقين الخلايا T ورم التفاعل من قبل وسائل 1/Ionomycin Bryostatin وصياغة سلسلة غاما المشتركة السيتوكينات

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

التوسع في الدم المحيطي الإنسان خلايا T γδ باستخدام Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...