وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الألمانية للبحوث (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) وKFO 146 (MF)، وزارة الدفاع وزارة الدفاع من PC منحة 040972 (MO) والمعهد الوطني للصحة منح RO1 CA108835 ، RO1 Ai44129 (JPS)

1. الجيل من HLA-A2 مكتب المفتش العام وبناء KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العازلة بورات العقيمة. جعل 0.1 M الحل من حمض البوريك في الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.0. تصفية العقيمة (0.22 ميكرون) العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عقيمة غسل العازلة حبة. استخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بدون المغنيسيوم والكالسيوم. إضافة البشرية AB المصل لمدة 3٪ تركيز النهائي. إضافة حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA) لمدة 2 ملي التركيز النهائي. إضافة أزيد الصوديوم (نان 3) ل0.01٪ تركيز النهائي. تصفية العقيمة (0.22 ميكرون) العازلة وتخزينها في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 250 ميكرولتر من الخرز الايبوكسي (حوالي 100 × 10 6 حبات) من الأوراق المالية إلى العقيمة، رأس المسمار قارورة زجاجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من العازلة بورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة زجاجية على المغناطيس والسماح حبات تلتزم لمدة 2 دقيقة. نضح العازلة وإزالة الزجاج قنينة من المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات مرة واحدة مع 1 مل العازلة بورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 550 ميكرولتر من 0.018 ميكروغرام/ مل HLA-A2 مكتب المفتش العام و 3.64 ميكروغرام / مل المضادة للبشرية CD95 ماب (استنساخ CH11) وتخلط بلطف عن طريق هز. (يرجى الاطلاع على قسم المناقشة للحصول على معلومات إضافية.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان قارورة زجاجية على نهاية محور دوار على النهاية، في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الخرز في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قنينة زجاجية على مغناطيس لمدة 2 دقيقة ونضح &quot;KaAPC حل تحميل&quot;. إزالة الزجاج قنينة من المغناطيس، إضافة 1 مل من حبة غسل العازلة و resuspend بعناية من قبل تهتز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.10 مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان قارورة زجاجية على محور دوار عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في 1 مل غسل العازلة حبة. عند هذه النقطة، سيتم حظر جميع المواقع المتبقية البروتين ملزمة البشري المصل AB الواردة في غسل العازلة حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار الخرز في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان زجاج القارورة على مغناطيس لمدة 2 دقيقة وعازلة نضح غسل حبة. إزالة الزجاج قنينة من المغناطيس واستبدال الحل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. </li></ol> 2. مراقبة الجودة، الببتيد تحميل، Wالترميد والتخزين، واستقرار KaAPC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1.5 × 10 5 KaAPC في أنبوب FACS وتغسل مع 1 مل FACS غسل العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخرز resuspend في 100 ميكرولتر FACS غسل العازلة وإضافة 1 ميكرولتر من مكافحة فأر IgG1 PE (للكشف عن الجزء التيسير من HLA-A2 مكتب المفتش العام) و 1 ميكرولتر من مكافحة فأر الغلوبولين المناعي FITC (استنساخ R6-60.2، للكشف من ماب CD95 مكافحة الإنسان). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتغسل مع 1 مل FACS غسل العازلة، وresuspend في 250 ميكرولتر FACS غسل العازلة وقراءة تلطيخ التدفق الخلوي. </li></ol><img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> وقد تم تنفيذ الشكل 1. صمة عار QC دفعة KaAPC التي كما جاء في القسم بروتوكول تلطيخ كما هو موضح في قسم البروتوكول تم الكشف 2. HLA-A2-الإيج باستخدام الماوس مكافحة IgG1 PE MAB، بينما الإنسان ومكافحة CD95 تم الكشف عن (مكافحة فاس) مع المضادة للماوس-الغلوبولين المناعي FITC ماب (انظر بروتوكول حد ذاتهction 2.2) (الخط الأزرق). وتمثل الرسوم البيانية شغل الخرز فارغة سوداء ملطخة مكافحة فأر IgG1-PE ماب أو مكافحة فأر-الغلوبولين المناعي FITC MAB، على التوالي. أرقام في الزاوية اليمنى العليا تشير إلى شدة الفلورسنت متوسط ​​(MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنقل الببتيد تحميل 20 × 10 6 KaAPC في قارورة زجاجية معقمة جديدة، ضع على مغناطيس لمدة 2 دقيقة، نضح PBS و resuspend الخرز في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني جديد مع 5 ميكروغرام الببتيد (نضع في اعتبارنا، سوف الببتيدات فقط HLA-A2 مقيدة ربط على ديمر!). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مخزن تحميل KaAPC في 4 درجات مئوية حتى استخدامها، لمدة 3 أيام على الأقل للسماح كافية تحميل الببتيد على ديمر HLA-A2 مكتب المفتش العام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة قبل الاستخدام، وغسل الببتيد تحميل KaAPC كما هو مبين في 1.14. كرر هذه الخطوة على الأقل 6X. ملاحظة: هذا هو خطوة حاسمة لضمان الببتيد الحر لديه رس تتم إزالتها بالكامل لتجنب قتل كاذبة النتائج الإيجابية؛ وقد تبين الببتيد الحرة المتبقية للحث على موت الخلايا المبرمج في مستضد محددة الثقافات الخلايا T 9. استبعاد تأثير الببتيد القابلة للذوبان، تشغيل عينات السيطرة طاف من الببتيد تحميل وغسلها KaAPC (انظر 3.8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخرز باستخدام عدادة الكريات وتسمية مع التاريخ واسم الببتيد والتركيز. ملاحظة: محملة KaAPC تبقى ظيفية في 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل. بعد شهر واحد، وإعادة التحميل مع نفس الببتيد KaAPC يسمح لاستخدامها لمدة تصل إلى سنة واحدة. </li></ol> 3. KaAPC في المختبر قتل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام المشارك الثقافة. إعداد الكامل المتوسطة RPMI تستكمل مع 3٪ T عامل نمو الخلايا (صنع في المختبر 6) و 3٪ المانحة البلازما ذاتي. إذا المانحة البلازما الذاتي غير متوفر، استخدام الحرارة المعطل AB المصل البشري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد AnnexinV ملزمة إعداد العازلة. حل 8.12 غرام كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) و 0.12 جم أحسبكلوريد البوتاسيوم (CaCl 2) في 990 مل DDH 2 O.Add 10 مل 1M HEPES العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد خلايا T مستضد محددة الإنسان. (للحصول على بروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع على نشرة السابق 7 الاصطناعية باستخدام مستضد تقديم الخلايا (AAPC)). ضمان خصوصية الببتيد هي على الأقل&gt; 75٪ على النحو الذي يحدده تلطيخ tetramer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة احتضان 2 × 10 5 خلايا T مستضد محدد / جيد (في 96 جولة جيدا أسفل اللوحة) في 200 ميكرولتر من شارك في مستنبت في نسبة 1: 1 مع KaAPC لمدة 48 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة C و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحصاد ونقل في أنبوب FACS. تغسل مع 1 مل AnnexinV العازلة ملزمة، تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طاف resuspend في 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة AnnexinV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات وصمة عار مع 1 ميكرولتر AnnexinV FITC و 5 ميكرولتر 7-AAD لمدة 10-15 دقيقة في RT، ويغسل مع 1 مل AnnexinV العازلة ملزمة. تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق، وتجاهل طافد resuspend في 250 ميكرولتر العازلة ملزمة AnnexinV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة عينات فورا على تدفق عداد الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير العينات التالية لتحديد قتل مستضد معين عن طريق KaAPC: خلايا T فقط؛ خلايا T + ذوبان مكافحة CD95. خلايا T + تفريغ KaAPC. خلايا T + الببتيد غير تحميل KaAPC وما شابه ذلك. خلايا T + الببتيد تحميل KaAPC وما شابه ذلك. الخلايا التائية + طاف من الببتيد تحميل KaAPC وما شابه ذلك. </li></ol><img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> . الشكل 2. KaAPC قتل مقايسة الببتيد تحميل KaAPC او الخرز التحكم (HLA-A2-الإيج حبات فقط) تم تربيتها لمدة 48 ساعة عند نسبة 1: 1 مع CMVpp65 خلايا T معينة (~ 80٪)، حصادها والملون لاحقا مع AnnexinV ويوديد propidium (PI) لتحديد الخلايا التي التدفق الخلوي (انظر القسم بروتوكول 3،3-3،7). &quot;وما شابه ذلك&quot; يشير إلى حبات محملة CMVpp65 و &quot;غير المشابهة&quot; ليكونإعلانات محملة مارت-1 الببتيد. الأرقام تشير إلى النسبة المئوية للخلايا T قابلة للحياة في الربع السفلي الأيسر من كل مؤامرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأداء تتقاطع-التجارب، توليد خلايا T مستضد معين من اثنين من خصوصيات مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك تقييم مستضد معين من استنزاف قدراتهم في KaAPC مع تحليل المتزامن للقضاء مستضد معين من خلايا T في غير متجانسة السكان الخلية T. (للحصول على بروتوكول مفصلة يرجى الاطلاع شوتس وآخرون 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS MF وليس لديهم ما يكشف. بموجب اتفاقية الترخيص بين NexImmune وجامعة جونز هوبكنز، الدكاترة. يحق Schneck وOelke لأسهم الملكية التي تلقتها الجامعة على مبيعات المنتجات AAPC الموضحة في هذه المقالة. كما أنها تملك NexImmune الأسهم، والذي يخضع لبعض القيود في ظل سياسة الجامعة. الدكتور Schneck هو عضو في شركة &quot;ليالي مجلس الإدارة والمجلس الاستشاري العلمي. تدار شروط هذا الترتيب من قبل جامعة جونز هوبكنز وفقا لتعارضها مع سياسات الفائدة.

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هي ضمان نسبة مناسبة من إشارة 1 (الببتيد MHC) وإشارة 2 (مكافحة فاس MAB). وقد أجرينا تجارب المعايرة مكثفة لتحديد النسبة المثالية للإشارة 1 و 2؛ أصبح واضحا أن اختلافات طفيفة بسبب الاختلافات في ديمر HLA-A2 الإيج أو تركيزات مضادات فاس ماب يمكن أن تتداخل مع وظائف KaAPC. وبالتالي، ينبغي دائما التحقق من تركيز كل من إشارات، وينبغي في كثير من الأحيان يتم اختبار جودة كل من البروتينات حتى لو كان أمر بذلك من مصدر تجاري. وعلاوة على ذلك، ينبغي دائما أن تحدد التركيزات من قبل نفس الفحص وفحوصات الكشف مختلفة قد يؤدي إلى تركيزات مختلفة. ويمكن أيضا ظائف HLA-A2-الإيج تنخفض قيمتها بسبب refolding ناقصة و / أو غير فعالة الببتيد تحميل. وعلاوة على ذلك يمكن تجميع الجزيئات ديمر بدرجات مختلفة، والتي يمكن أن تؤثر على النشاط الوظيفي للبروتين. ولذلك، فإن ACTUكمية من آل ديمر حاجة للجيل من KaAPC ظيفية ومحددة قد تختلف. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن مجموعة مثالية للموت حمل إشارة مكافحة فاس ماب على KaAPC هو ضيق للغاية. في أيدينا كميات أكبر 3.64 ميكروغرام / مل تؤدي إلى القتل غير محدد من فاس خلايا T إيجابي في حين أدت كميات أقل من 3.64 ميكروغرام / مل في انخفاض النشاط القتل، حسب الجرعة. في حين أن هذه الشروط تبدو ضيقة جدا، والانتباه إلى هذه التفاصيل يؤدي إلى جيل من KaAPC ظيفية ومحددة. في حين أن النمط الظاهري KaAPC الحالي وظيفية لاستنفاد خلايا T مستضد معين تفعيلها، التجارب الأولية التي تستهدف خلايا T مستضد معين ساذجة أو يستريح أظهر أي تحريض كبير من الخلايا مستضد معين كما خفضت هؤلاء السكان فاس التعبير. وبالتالي، يمكن للمرء أن يتصور مضيفا إشارة شارك في تنشيطية على KaAPC للحث على تنظيم ما يصل من فاس على يستريح خلايا T لجعل تحويلها<html> إلى هدف لKaAPC. في حين أن هذا أمر ممكن كل ثلاث إشارات سيتعين معاير بعناية لضمان KaAPC النمط الظاهري وظيفية. ضبط منصة حبة لمصفوفة قابلة للتحلل حيويا أو تعزيز وتطبيق KaAPC في الجسم الحي. مؤخرا، شن آخرون قد ذكرت ناجحة في استخدام الجسم الحي من KaAPC استخدام الخرز 5 ميكرون لاتكس مترافق لمكافحة فاس (استنساخ Jo2) ومكافحة صاحب / H2-K ب -TRP2 11. لقد كنا قادرين على إظهار أن المفهوم العام من الخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية (AAPC) يمكن نقلها بنجاح من ميكرون الحجم لجزيئات بحجم نانومتر 12 و يتأثر هذه الوظيفة بواسطة الجسيمات الهندسة 13. وهكذا، من خلال تغيير حجم و / أو شكل KaAPC المستقبل تصاميم واحدة قد تكون قادرة على التأثير على وظيفة في الجسم الحي وتوزيع الحيوي، والذي يمكن أن يكون المفتاح لنجاح العلاج من أمراض المناعة الذاتية الخاصة بالأعضاء. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC تغلب على أوجه القصور الرئيسية لاستراتيجيات استنزاف خلية مقرها باعتبارها سهلة الاستخدام &quot;من على الرف&quot; والوقت ونهج فعالة من حيث التكلفة تعمل بشكل مستقل عن حالة المانحة وما قبل المعالجة. KaAPC ليست أهداف الذاتي أو نظير الصماوي إشارات القتل ويست حساسة إلى وظائف المستجيب لحل الخلايا من CTL. سوف KaAPC تتطلب التعرف على المستضد مرض ذات الصلة والتي تعتمد على نوع HLA معين. في حين أن العديد من المستضدات حاليا مناسبة HLA-A2 مقيدة لمرض السكري نوع 1، وقد تم تحديد GvHD ومضاعفات التصلب 2، وتطوير الطبقة HLA إضافية I ديمر الجزيئات فضلا عن تحديد المستمر للمستضدات ذات الصلة المناعة الذاتية الجديدة زيادة وتوسيع انطباق KaAPC. وعلاوة على ذلك يمكن للمرء التفكير في استخدام KaAPC التي تستهدف الحواتم مختلفة لاستهداف مستضدات متعددة في نفس الوقت. باختصار، KaAPC تمثل تكنولوجيا منصة مرنة لفريق tigen محددة استنزاف الخلايا التائية. تمكن طبيعتها &quot;مثل ليغو&quot; إدراج إشارات جديدة مثل إشارات المشارك المحفزة أو المثبطة إضافية مثل PD1 أو TRAIL على مختلف المصفوفات التي يمكن توسيع وتعزيز اللاحقة في التجارب المختبرية وتطبيق الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لتوليد KaAPC، ونهج حبة الأولى استنادا للقضاء على خلايا T مستضد معين من الخلايا T مخاليط مع خصوصيات مختلفة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3. KaAPC القضاء على CTL بطريقة محددة مستضد PKH26 المسمى تنشيط فاس + CTL المستجيب الذاكرة وPKH67 المسمى CTL CMVpp65 محددة من نفس الجهات المانحة كانت مختلطة إلى 1: نسبة 1 وشارك في تربيتها مع CMVpp65 KaAPC لمدة 48 ساعة. وعولج الثقافات التحكم مع تفريغ KaAPC، أو 1 ميكروغرام / ملمن ذوبان مكافحة فاس-ماب (استنساخ CH11). تم تحديد فقدان الحد الادنى من خلايا قابلة للحياة في غير المعالجة CTL الثقافات المختلطة (T المزيج). وأظهرت بيانات نظام مراقبة الأصول الميدانية الأصلية لكل السكان CTL من مزيج T. تم إجراء تحليل الخلايا كما نشرت سابقا النابضة منفصل على كل السكان الخلية T 10. أرقام صورت في الأرباع اليسرى العليا تمثل٪ من مجموع الخلايا. ويستمد هذا الرقم يوضح من تجربة تمثيلية واحدة من ثلاث تجارب مستقلة. وقد نشر هذا البحث في الأصل في الدم. . شوتس، C. وآخرون القاتل الخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية: استراتيجية جديدة لحذف خلايا T معينة الدم. 2008؛ 111، 3546-52. جميع الحقوق محفوظة للجمعية الأمريكية لأمراض الدم. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

على مدى العقدين الماضيين تم إحراز تقدم كبير في فهم الآليات المسببة للأمراض من أمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك، فإن العلاج الأكثر شيوعا لا تزال تعتمد على الستيرويدات القشرية وكذلك الأدوية المثبطة للمناعة مثل البيورين النظير، وكلاء مؤلكل ومثبطات الكالسينيورين 1. استخدام مثل هذه العقاقير قد تحسنت كثيرا في تشخيص المرضى، إلا أن العلاج لا يقدم علاجا لخلل مناعي الأساسي. وعلاوة على ذلك، والمرضى تصبح عرضة للالتهابات وإلى تطور السرطان. بالتالي الهدف النهائي للعلاج من الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية ورفض طعم خيفي هو خصيصا لاستهداف المرض الوحيد تسبب خلايا T بينما، في الوقت نفسه، وترك الجهاز المناعي المتبقية يمسها والمختصة لمكافحة الاضطرابات المناعية. استخدام الخلايا المقدمة للمستضد (APC) كعلاج لقمع الطرفية استجابات الخلايا T وصفت لأول مرة في اقرب وقتفي 1970s من قبل عدة مجموعات. منذ ذلك الحين تم تطوير الكثير من النهج القائم على الخلية (التي استعرضت في شوتس وآخرون. 2). باستخدام استراتيجيات، معربا عن FASL القاتل-APC كما أظهرت خلايا immunoregulatory نتائج واعدة مشيرا إلى الإمكانات العلاجية لعلاج المناعة الذاتية، ورفض المزروع والالتهابات المزمنة. ومع ذلك، هناك قيود كبيرة مع استخدام استراتيجيات FASL القاتل-APC التي حدت في نهاية المطاف تطبيق سريري لها؛ (ط) جيل أو عزل APC هو الوقت والعمل ومكثفة التكلفة (ب) من المرضى الذين يعانون من قلة الكريات بسبب كبت المناعة توفر كميات محدودة ونوعية الخلايا (الثالث) الطلاء أو تنبيغ APC مع موت الخلايا المبرمج الذي يحفز إشارات مثل نتائج في غاية FASL الظواهر المتغيرة و (iv) القاتل APC-حساسة للالسامة للخلايا وظائف المستجيب للخلايا T بالتالي الحد من قدرتها العلاجية. وبالتالي، فمن الصعب ضمان استنساخه القاتل APC-pheno محددةنوع التي يمكن استخدامها لتعديل مستضد معين من استجابات الخلايا T في الجسم الحي. على أساس عملنا السابق مع FASL معربا عن القاتل-APC 3-5 والخلايا المقدمة للمستضد الاصطناعية (AAPC) 6،7 قمنا بتطوير النهج القائم على حبة (KaAPC) لتثبيط مستضد معين أو القضاء على خلايا T لصناعة السيارات في رد الفعل المختبر. تتكون KaAPC من ديمر HLA-A2 مكتب المفتش العام (إشارة 1) ومكافحة فاس ماب (موت الخلايا المبرمج الذي يحفز إشارة) يجمد تساهميا على سطح من 4.5 ميكرون لاتكس ممغطس حبة. أنها تستنفد خلايا T مستضد معين بطريقة بوساطة فاس / FASL من مزارع الخلايا T من خصوصيات متعددة بطريقة مستضد محددة ومستقلة عن تفعيل يسببها موت الخلايا (AICD) المسار. هو فعل جرعة موت الخلايا المبرمج في الخلايا T تعتمد المستهدفة بسرعة بالفعل بعد 30 دقيقة 8. KaAPC يمكن أن تتولد بسهولة بطريقة تسيطر عليها ضمان محددة قبالة phenot الرف[يب] والتغلب على معظم أوجه القصور في الاستراتيجيات القائمة على الخلايا استنزاف. بالتالي، KaAPC عرض إمكانات كبيرة لعلاج الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية ورفض طعم خيفي، المضي قدما في مجال استراتيجيات العلاج المحددة T الخلية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

العلاج الحالي من الخلايا T بوساطة أمراض المناعة الذاتية وتعتمد في الغالب على استراتيجيات المناعة العالمي، والتي، على المدى الطويل، مصحوبا الآثار الجانبية السلبية مثل انخفاض القدرة على التحكم الالتهابات أو الأورام الخبيثة. لذا، لا بد من وضع تستهدف فقط الخلايا المرض التوسط وترك الجهاز المناعي ثبات نهج جديدة. على مدى العقد الماضي مجموعة متنوعة من استراتيجيات العلاج المناعي الخلايا استنادا إلى تعدل وقد وضعت T خلية بوساطة الاستجابات المناعية. معظم هذه الطرق تعتمد على مستضد تقديم الخلايا يحفز التسامح (APC). ومع ذلك، بالإضافة إلى كونها صعبة ومرهقة من الناحية الفنية، هذه النهج القائم على خلية حساسة للغاية لالسامة للخلايا T استجابات الخلايا، مما يحد من قدرتها العلاجية. هنا نقدم بروتوكول لتوليد خلايا مستضد تقديم الاصطناعي القاتل غير الخلوية (KaAPC)، والذي يسمح للنضوب خلايا T مرضية مع ترك اعادةاملتبقي جهاز المناعة يمسها والوظيفية. KaAPC هو الحل البديل لالمناعي الخلوي التي لديها امكانات لعلاج أمراض المناعة الذاتية والرفض طعم خيفي من خلال تنظيم غير مرغوب فيها استجابات الخلايا التائية بطريقة محددة مستضد.

ملامح هذا البروتوكول تشمل جيل متميز من النمط الظاهري KaAPC التي تعرض HLA-A2 مكتب المفتش العام (إشارة 1) ومكافحة فاس ماب (إشارة موت الخلايا المبرمج) في نفس الوقت، والتي بالمقارنة مع النهج القائمة على الخلية لا يتغير عن طريق طلاء أو كفاءات التنبيغ ويمكن التضمين بسهولة أثناء الإنتاج (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، KaAPC، ليست حساسة إلى وظائف المستجيب السامة للخلايا T والخلايا وظائفها لا يعتمد على نوعية الخلايا المقدمة للمستضد ذاتي قبل وبعد التلاعب في المختبر. KaAPC قادرة على استنفاد خلايا T مستضد محددة في المختبر عندما محملة الببتيد وما شابه ذلك، في حين أن غير المشابهة محملة سوف KaAPC لا تستنفد خلايا T (الشكل 2). ولذلك، KaAPC لحث الخلايا التائية الخلايا بطريقة مستضد معين. بعد ذلك، كنا KaAPC لاستنزاف الانتقائي للخلايا T مستضد معين من خليط من مختلف جمعية مهندسي البترول الخلايا التائيةcificities، مما يدل على أنه ليس هناك سوى الحد الأدنى من السمية الخلوية ويتسرب إلى الجار T الخلايا (الشكل 3). وبالتالي، KaAPC تمثل أداة رائعة لفي المختبر مستضد معين نضوب خلايا T مستضد محددة البشرية تفعيلها مع تطبيق السريرية المحتملة لعلاج أمراض المناعة الذاتية والرفض طعم خيفي.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

يتم عرض المبادئ التوجيهية لتوليد القاتل الاصطناعي مستضد تقديم الخلايا، KaAPC، أداة فعالة لنضوب في المختبر من خلايا T مستضد معين الإنسان وحل بديل لالمناعي الخلوي لعلاج T-الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية في antigen- الأزياء محدد دون المساس الجهاز المناعي المتبقية.

القاتل مستضد تقديم الخلايا الاصطناعي (KaAPC) للكفاءة<em&gt; في المختبر</em&gt; استنفاد خلايا T الإنسان مستضد محددة

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Views.  Johns Hopkins University.  يتم عرض المبادئ التوجيهية لتوليد القاتل الاصطناعي مستضد تقديم الخلايا، KaAPC، أداة فعالة لنضوب في المختبر من خلايا T مستضد معين الإنسان وحل بديل لالمناعي الخلوي لعلاج T-الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية في antigen- الأزياء محدد دون المسا?...

Video: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

مستضد تقديم الاصطناعي تنشيط الخلية بوساطة (AAPC) والتوسع في الخلايا التائية القاتلة الطبيعية

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

السريرية تطبيق<em&gt; الجمال النائم</em&gt; ومستضد تقديم الخلايا الاصطناعية لتعديل وراثيا خلايا T من دم الحبل السري والمحيطية

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

تطوير التهاب القولون نموذج مدفوعة مستضد لدراسة عرض المستضدات التي كتبها مستضد الخلايا إلى خلايا T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic self-tolerance. Tregs represent about 5 - 10% of the mature CD4+ T cell subpopulation in mice and humans, with about 1 - 2% of those Tregs circulating in the peripheral blood. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be differentiated into functional Tregs, which have a potential to be used for cell-based therapies of autoimmune diseases. Here, we present a method to develop antigen (Ag)-specific Tregs from iPSCs (i.e., iPSC-Tregs). The method is based on incorporating the transcription factor FoxP3 and an Ag-specific T cell receptor (TCR) into iPSCs and then differentiating on OP9 stromal cells expressing Notch ligands delta-like (DL) 1 and DL4. Following in vitro differentiation, the iPSC-Tregs express CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, and Ag-specific TCR and are able to respond to Ag stimulation. This method has been successfully applied to cell-based therapy of autoimmune arthritis in a murine model. Adoptive transfer of these Ag-specific iPSC-Tregs into Ag-induced arthritis (AIA)-bearing mice has the ability to reduce joint inflammation and swelling and to prevent bone loss.

We present here a method to develop functional antigen (Ag)-specific regulatory T cells (Tregs) from induced pluripotent stem cells (iPSCs) for immunotherapy of autoimmune arthritis in a murine model.

تطوير المستمدة الخلية الجذعية خلايا T التنظيمية مستضد محددة ضد المناعة الذاتية

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

القياس الكمي لتكاثر CD4 - T الخاصة بمستضد الإنسانباستخدام Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

توليد عالي الكفاءة من الخلايا T السامة للماوس الأولية الخاصة بالمستضد للاختبار الوظيفي في نموذج مرض السكري المناعي الذاتي

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...