وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة RO1 HL81248.

1. ثقافة خلايا الشريان الأورطي البقري غشائي (BAEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتم اتباع تقنيات التعقيم المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وسط المياه، وحمام دافئ بدون المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية. </li></ol> ملاحظة: المتوسط ​​ويتكون من الفينول المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر الحر (DMEM) مع 4،5 غ / ل D-جلوكوز، 4 مم L-الجلوتامين، 1٪ غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 2.5 ملغم / لتر عامل نمو بطانة. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا التي تحتوي على قارورة T75 من الحاضنة وتنظيف سطح القارورة مع الايثانول 70٪ قبل وضعه داخل غطاء محرك السيارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متوسط ​​العمر باستخدام الشافطة وتغسل مرتين مع 5 مل من Dulbecco للفوسفات المالحة العازلة (DPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 2 مل من التربسين والانتظار لمدة 4-5 دقيقة للخلايا لفصل اثناء تفقده دوريا تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 3 مل من المتوسط ​​وخلط مرارا باستخدام ماصة للر منفصلةانه الخلايا وخلق تعليق حتى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 5 مل من المتوسط ​​مع التربسين إلى أنبوب 15 مل و الطرد المركزي في 121 غ لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف باستخدام الشافطة. أضف 5 مل من DPBS وتخلط جيدا. الطرد المركزي في 121g لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف وإعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق إضافة 6 مل من المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على طبق من 6 أيضا، إضافة 1 مل من تعليق إلى خلية كل جيدا ثم يضاف 1 مل من المتوسط. مزيج وقف استخدام ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية لوحة واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li></ol> 2A. الكشف عن خلية لا مع BAEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتم اتباع تقنيات التعقيم المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة ونضح وسيلة من البئر الأولى. غسل الخلايا مرتين مع DPBS 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 210 من 1.9 ملي مول كبريتات الحديد heptahydrate (II) (4 FeSO 0.7 H 2 O، وإعداد حديثا عن طريق إذابة 0.8 ملليغرام في1 DPBS مل مع CaCl 2 و MgCl 2) وميكرولتر 210 من الأمونيوم ن ميثيل مد glucamine dithiocarbamate (مليون جالون يوميا، وإعداد حديثا عن طريق إذابة 2،7 ملغ في 500 DPBS ميكرولتر مع CaCl 2 و MgCl 2) باستخدام نسبة من 1:07 (ملاحظة: تم عرض هذه النسبة حيث يتم استخدام فائض مليون جالون يوميا يعملون تقليديا في إعداد الحديد 2 +-MGD مجمع يرجع ذلك إلى حقيقة أن العائد على الحديد 3 + إلى أقصى حد ممكن، مليون جالون يوميا في وجود فائض مليون جالون يوميا وإضافة أسكوربات في حل لتحقيق الاستقرار في الحديد 2 +-مليون جالون يوميا وليس من الضروري منذ 3 NO-FE يتم خفض التطور الطبيعي +-MGD شكلت لكشف EPR NO-FE-2 + مليون جالون يوميا من قبل أسكوربات، هيدروكينون، أو السيستين مع كفاءة تحويل تصل إلى 99.9٪ .. وتدور diamagnetic منخفض دولة من الحديد 2 + يسمح للكشف عن 15 باستخدام خلية شقة أو الأنابيب الشعرية من دون الحاجة إلى جهاز درجة حرارة منخفضة) NO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة مما أدى إلى تعليق جيد وإضافة 4،6 μلتر من ionophore الكالسيوم (كاي) (أعدت من حل سهم من 1.9 ملي مول عن طريق إذابة 1 ملغ في DMSO مل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الحل مرة أخرى، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة من أجل السماح للمزيد من الحد من الحديد-NO-3 + مليون جالون يوميا للكشف EPR NO-FE-2 + مليون جالون يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وطاف (425 ميكرولتر) في أنبوب إيبندورف ونقل إلى زنزانة EPR شقة (أو إلى أنبوب شعري 50 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلمات اكتساب EPR هي: الميكروويف تردد: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3427 G؛ تعديل السعة: 6.0 G، عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 1 × 10 5؛ الميكروويف الطاقة: 10 ميغاواط، العدد الكلي للفحوصات: 121؛ وقت الاجتياح: 10 ثانية، ومرة ثابت: 20 مللي ثانية (ملاحظة: منذ المعلمات تختلف من صك واحد والظروف التجريبية إلى آخر، لذلك، فقط وسط الميدان والتردد والسعة التشكيل هي أهم المعايير للنظر فيها.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الأطياف في درجة حرارة الغرفة والأطياف 2-D وintegتصنيف للحد من الضوضاء في الخلفية والأساس تصحيح باستخدام بروكر معالجة البيانات WinEPR البرامج أو غيرها من برامج معالجة البيانات. لالكمي لتشكيل معقد إضافي، ويمكن بناؤها المؤامرات مستوى شدة تركيز مقابل إشارة (أو منطقة) باستخدام SNAP المانحة NO. </li></ol> 2B. أنوش Uncoupling التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 6 جيدا من الحاضنة ونضح وسيلة من البئر الثانية، وتغسل مرتين مع DPBS 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> واستخدمت الجهات المانحة peroxynitrite، 5-الأمينية-3-(4-morpholinyl) -1،2،3-oxadiazolium كلوريد (SIN-1) إلى فك الارتباط بين أنوش 16. أضف 100 ميكرولتر من 0.5 مم SIN-1 (M ص ز / مول، في الفترة من 10 ملي حل الأوراق المالية الطازجة عن طريق إذابة 1 ملغ SIN-1 في 500 ميكروليتر من PBS مع عدم وجود أيونات الكالسيوم / المغنيسيوم 206.6) DPBS والمخففة إلى 2 مل مع و 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة من الحاضنة وتغسل مرتين مع DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر 210 منمليون جالون يوميا 2.8 مم FeSO 4 0.7 H 2 O وميكرولتر 210 من 19.6 ملي الطازجة وفقا للإجراءات المذكورة أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الحل وإضافة 4.6 ميكرولتر من تساى ملي 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة الحل مرة أخرى، واحتضان على 37 درجة مئوية لمدة 36 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وطاف (425 ميكرولتر) في أنبوب إيبندورف ونقلها إلى خلية شقة EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المعلمات اكتساب EPR هي: الميكروويف تردد: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3427 G؛ تعديل السعة: 6 G؛ عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 1 × 10 5؛ الميكروويف الطاقة: 10 ميغاواط، العدد الكلي للفحوصات: 121؛ وقت الاجتياح: ق (10)؛ والوقت ثابت: MS 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الأطياف وأدمجت أطياف 2-D للحد من الضوضاء في الخلفية والأساس تصحيحها على النحو المذكور أعلاه. </li></ol> 3. الكشف عن O 2 • - من العدلات الأشكال النوى (PMNs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم عزل العدلات من عينة دم الإنسان كما هو موضح سابقا 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل سهم DMPO M 1 * في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ملي diethylenetriamine-pentaacetic حامض (DTPA). DMPO لديه درجة انصهار 25-29 درجة مئوية لذلك هو أكثر ملاءمة لماصة DMPO السائلة (كثافة ~ 1.02 غرام / مل عند 25 درجة مئوية) في لقارورة زجاجية (ملاحظة: لا تستخدم القنينات البلاستيكية لوزنها منذ DMPO نقي يتفاعل مع البلاستيك). ويمكن ذاب المجمدة DMPO عن طريق تشغيل الماء الدافئ إلى قارورة (ملاحظة: لا تقم بتشغيل الماء الساخن كما DMPO قد تتحلل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم لاستخدام عالية النقاء DMPO (&gt; 99٪) منذ بعض الفخاخ تدور متوفرة تجاريا تحتوي على شوائب متوازي المغنطيسية، وبالتالي، فمن الضروري لتشغيل طيف EPR من حل عادل DMPO وحدها (10 ملم في هذه الحالة). فمن الأهمية بمكان أن عدم وجود إشارة الخلفية هو واضح (انظر الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الأوراق المالية (1 ملغ / مل) من phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA) في DMSO. جعل aliquots بواسطة تمييع الحل إلى 10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في (أ) 1.5 أنبوب إيبندورف مل، يعد حل بإجمالي قدره 0.6 مل من خلال اتباع تسلسل إضافة: ~ 10 6 خلية لكل مليلتر من PMN، D-جلوكوز (1 ملغ / مل)، والزلال (1 ملغ / مل)، 10 ملي DMPO و 0.2 ميكروغرام / مل من سلطة النقد الفلسطينية. (ملاحظة: سلطة النقد الفلسطينية هو المنشط جذرية وينبغي أن يضاف الماضي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحل لخلية شقة EPR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> EPR اكتساب المعلمات الشروط هي: تردد الموجات الدقيقة: 9.8 غيغاهرتز، وسط الميدان: 3486 G؛ تعديل السعة: 0.5 G، عرض اكتساح: 100 غرام، كسب المتلقي: 5 × 10 5، العدد الكلي للمسح: 10؛ وقت الاجتياح: 30 ثانية ؛ طاقة الميكروويف: ميغاواط 20؛ والوقت ثابت: MS 81. لالكمي لتشكيل معقد إضافي، ويمكن بناؤها المؤامرات مستوى شدة تركيز مقابل إشارة (أو منطقة) باستخدام nitroxides مستقر مثل سرعة الإيقاع أو 3-الكربوكسيلية حامض PROXYL. </li></ol> * ملاحظة هامة بشأن استخدام DMPO: باستخدام خلية شقة، يمكن للمرء أن يزيد من كثافة الخلايا وبالتالي زيادة إشارةكثافة ناتج إضافة تدور ولكن نصف عمر O 2 • - معقد إضافي من DMPO قصيرة (ر 1/2 ~ 1 دقيقة) الذي يتحلل إلى DMPO-OH. يمكن أن تكون بديلا DMPO باستخدام تركيزات نفسه من EMPO، BMPO أو DEPMPO وهي متوافرة تجاريا لاستقرار معقد إضافي مع زيادة ر 1/2 ~ 8 و 14 دقيقة، على التوالي. 4. ممثل النتائج تم تنفيذ تدور محاصرة من NO جذري باستخدام الحديد 2 +-مليون جالون يوميا. الشكل 2A و 2B لا تظهر أي إشارة EPR من الحديد 2 +-MGD أو خليط من الحديد 2 + مليون جالون يوميا، مع تساى، مشيرا إلى أن عدم وجود إشارة خلفية لا تنبع من هذه الكواشف. BAEC على التحفيز مع تساى النشرات التي لا تتفاعل مع الحديد 2 + مليون جالون يوميا، لتشكل معقد إضافي زيادة ونقصان، NO-FE-2 + مليون جالون يوميا، ويظهر إشارة ثلاثية مميزة مع فائق الدقة تقسيم قيمة (hfsc) ثابت لمجموعة N = 12.66 و مجموعة من العوامل من ز = 2.040. (الشكل 2C). وHFوتم تحديد قيمة SC باستخدام برنامج محاكاة WINSIM التي يمكن تحميلها من برامج معهد علوم الصحة البيئية EPR موقع قاعدة البيانات. وhfsc التجريبية ينسجم مع قيمة الأدب لمجموعة N = 12.70 و ز = 2.041 18 NO الحديد 2 +-MGD معقد إضافي. وبالمثل، خفض تأثير 1-إثم BAEC إنتاج NO نظرا لاينوس uncoupling كما هو مبين في الشكل 2D. وقد استخدم DMPO تدور فخ لO 2 • - كشف. لم DMPO وحدها لا تعطي إشارة كما هو موضح في الشكل 3A مؤكدا أن فخ تدور خالية من الشوائب متوازي المغنطيسية. الشكل 3B هو طيف من DMPO وPMNs فقط، وعلى نحو مماثل، لا يوجد أي إشارة للكشف مما يدل على أن لا يسبب DMPO تفعيل NADPH أوكسيديز الانزيم. الشكل 3C يظهر إشارة المرصودة EPR على تحفيز PMN من قبل سلطة النقد الفلسطينية. تم تحديد القيم hfsc لهذا إشارة إلى أن يكون N = 14.71 G، A &amp;بيتا؛-H = 11،40 G وγ-H = G 1.25، وتتماشى مع قيم الأدب لمجموعة N = 14.3، وهو β-H = 11،7 G وγ H-= 1.3 G (19) لDMPO-O 2 H معقد إضافي. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. الرسم البياني للكشف عن الجذور من العدلات وBAEC باستخدام EPR محاصرة زيادة ونقصان. وكانت (أ) PMNs مختلطة مع DMPO وسلطة النقد الفلسطينية، والخليط الناتج نقلها إلى خلية شقة EPR للحصول على البيانات. (ب) ونمت BAEC على طبق من ذهب، وغسلها مع DPBS. أضيف تدور الحديد فخ (مليون جالون يوميا) 2 جنبا إلى جنب مع كاي. كانت مختلطة حل شامل والمحتضنة. تم نقل هذا الخليط إلى خلية شقة EPR للحصول على البيانات EPR. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الكشف عن شخصية EPR 2. من NO من Bلجنة الطاقة الذرية. (أ) من الطيف الحديد 2 +-مليون جالون يوميا فقط (B) الطيف من الحديد 2 + +-MGD تساى فقط. (C) طيف توأم ثلاثة نتيجة عدم وجود احتباس بواسطة الحديد 2 +-مليون جالون يوميا باستخدام تساى، حفز الخلايا. (D) الطيف تظهر انخفاضا في أي إنتاج بسبب 0.5 مم SIN-1 علاج الخلايا. <img src="/files/ftp_upload/2810/2810fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الكشف عن شخصية EPR 3. من H 2 DMPO-O من العدلات تفعيلها. (أ) من الطيف DMPO 10 ملم فقط. (ب) من الطيف PMN وحدها في ظل وجود DMPO 10 ملم. (ج) من الطيف PMN تفعيلها من خلال سلطة النقد الفلسطينية في ظل وجود DMPO 10 ملم.

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconciling+the+chemistry+and+biology+of+reactive+oxygen+species.">Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species.</a> Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).</li><li>Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol+chemistry+and+specificity+in+redox+signaling.">Thiol chemistry and specificity in redox signaling.</a> Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).</li><li>Clerch, L. B., Massaro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Oxygen, Gene Expression, and Cellular Function. , (1997).</li><li>Gutteridge, J. M. C., Halliwell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidants:+Molecules,+medicines,+and+myths.">Antioxidants: Molecules, medicines, and myths.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 561-564 (2010).</li><li>Sumimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+regulation+and+evolution+of+Nox-family+NADPH+oxidases+that+produce+reactive+oxygen+species.">Structure, regulation and evolution of Nox-family NADPH oxidases that produce reactive oxygen species.</a> FEBS J. 275, 3249-3277 (2008).</li><li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Editor Nitric Oxide: Biology and Pathobiology. , (2009).</li><li>Moreau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alkyl-+and+arylguanidines+on+the+stability+and+reactivity+of+inducible+NOS+heme-dioxygen+complexes.">Differential effects of alkyl- and arylguanidines on the stability and reactivity of inducible NOS heme-dioxygen complexes.</a> Biochemistry. 45, 3988-3999 (2006).</li><li>Vasquez-Vivar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+generation+by+endothelial+nitric+oxide+synthase:+the+influence+of+cofactors.">Superoxide generation by endothelial nitric oxide synthase: the influence of cofactors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 9220-9225 (1998).</li><li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+by+EPR+spin+trapping.">Detection of reactive oxygen and nitrogen species by EPR spin trapping.</a> Antioxid. Redox Signal. 6, 619-629 (2004).</li><li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping+of+superoxide+and+hydroxyl+radical:+practical+aspects.">Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects.</a> Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-16 (1980).</li><li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+(DEPMPO):+a+new+phosphorylated+nitrone+for+the+efficient+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals.">5-Diethoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (DEPMPO): a new phosphorylated nitrone for the efficient in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Chem. Soc., Chem. Commun. , 1793-1794 (1994).</li><li>Olive, G., Mercier, A., Le Moigne, F., Rockenbauer, A., Tordo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide:+Evaluation+of+the+spin+trapping+properties.">2-Ethoxycarbonyl-2-methyl-3,4-dihydro-2H-pyrrole-1-oxide: Evaluation of the spin trapping properties.</a> Free Radical. Biol. Med. 28, 403-408 (2000).</li><li>Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+radical+trapping+and+spin+adduct+decay+of+5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide+(BocMPO):+kinetics+and+theoretical+analysis.">Superoxide radical trapping and spin adduct decay of 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide (BocMPO): kinetics and theoretical analysis.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, 1340-1344 (2002).</li><li>Tsuchiya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide-forming+reactions+of+the+water-soluble+nitric+oxide+spin-trapping+agent,+MGD.">Nitric oxide-forming reactions of the water-soluble nitric oxide spin-trapping agent, MGD.</a> Free Radical Biol. Med. 27, 347-355 (1999).</li><li>Vanin, A. F., Poltorakov, A. P., Mikoyan, V. D., Kubrina, L. N., van Faassen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+iron-dithiocarbamates+ensure+detection+of+nitric+oxide+in+cells+and+tissues.">Why iron-dithiocarbamates ensure detection of nitric oxide in cells and tissues.</a> Nitric Oxide. 15, 295-311 (2006).</li><li>RojasWahl, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decomposition+mechanism+of+3-N-morpholinosydnonimine+(SIN-1):+A+density+functional+study+on+intrinsic+structures+and+reactivities.">Decomposition mechanism of 3-N-morpholinosydnonimine (SIN-1): A density functional study on intrinsic structures and reactivities.</a> J. Mol. Model. 10, 121-129 (2004).</li><li>Klempner, M. S., Gallin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+functional+characterization+of+human+neutrophil+subpopulations.">Separation and functional characterization of human neutrophil subpopulations.</a> Blood. 51, 659-669 (1978).</li><li>Pou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping+of+nitric+oxide+by+ferro-chelates:+kinetic+and+in+vivo+pharmacokinetic+studies.">Spin trapping of nitric oxide by ferro-chelates: kinetic and in vivo pharmacokinetic studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1427, 216-226 (1999).</li><li>Finkelstein, E., Rosen, G. M., Rauckman, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin+trapping.+Kinetics+of+the+reaction+of+superoxide+and+hydroxyl+radicals+with+nitrones.">Spin trapping. Kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones.</a> J. Am. Chem. Soc. 102, 4994-4999 (1980).</li><li>Britigan, B. E., Rosen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spin-trapping+and+human+neutrophils.+Limits+of+detection+of+hydroxyl+radical.">Spin-trapping and human neutrophils. Limits of detection of hydroxyl radical.</a> J. Biol. Chem. 264, 12299-12302 (1989).</li><li>Frejaville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline+N-oxide:+A+new+efficient+phosphorylated+nitrone+for+the+in+vitro+and+in+vivo+spin+trapping+of+oxygen-centered+radicals.">5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A new efficient phosphorylated nitrone for the in vitro and in vivo spin trapping of oxygen-centered radicals.</a> J. Med. Chem. 38, 258-265 (1995).</li><li>Snyrychova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+sensitivity+of+EPR+spin+trapping+in+biological+systems+by+cyclodextrins:+A+model+study+with+thylakoids+and+photosystem+II+particles.">Improvement of the sensitivity of EPR spin trapping in biological systems by cyclodextrins: A model study with thylakoids and photosystem II particles.</a> Free Radical Biol. Med. 48, 264-274 (2010).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipophilic+beta-cyclodextrin+cyclic-nitrone+conjugate:+Synthesis+and+spin+trapping+studies.">Lipophilic beta-cyclodextrin cyclic-nitrone conjugate: Synthesis and spin trapping studies.</a> J. Org. Chem. 74, 5369-5380 (2009).</li><li>Han, Y., Tuccio, B., Lauricella, R., Villamena, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+spin+trapping+properties+by+beta-cyclodextrin-cyclic+nitrone+conjugate.">Improved spin trapping properties by beta-cyclodextrin-cyclic nitrone conjugate.</a> J. Org. Chem. 73, 7108-7117 (2008).</li><li>Hardy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+characterization,+and+decay+kinetics+of+ROS+and+thiyl+adducts+of+mito-DEPMPO+spin+trap.">Detection, characterization, and decay kinetics of ROS and thiyl adducts of mito-DEPMPO spin trap.</a> Chem. Res. Toxicol. 20, 1053-1060 (2007).</li><li>Kim, S. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+reactivity+of+a+cyclic+nitrone-calix[4]pyrrole+conjugate+with+superoxide+radical+anion:+Theoretical+and+experimental+studies.">Fast reactivity of a cyclic nitrone-calix[4]pyrrole conjugate with superoxide radical anion: Theoretical and experimental studies.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 17157-17173 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

واستخدمت EPR محاصرة تدور في مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية لقياس وتحديد الجذور الحرة. محاصرة تدور حساس جدا، وقادرة على الكشف عن الجذور بتركيزات تتراوح بين نانومتر إلى ميكرومتر مما يجعلها مناسبة للتطبيق في النظم البيولوجية. تشكيل معقد إضافي متوازي المغنطيس?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> الفينول المتوسطة DMEM مجانا ارتفاع الجلوكوز 1X </td><td> GIBCO </td><td> 31053 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25٪ التربسين-EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> L-الجلوتامين </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP379-100 </td><td></td></tr><tr><td> MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> GIBCO </td><td> 11140 </td><td></td></tr><tr><td> الأبقار مصل الجنين </td><td> اتلانتا البيولوجية </td><td> S11550 </td><td></td></tr><tr><td> عامل النمو البطاني </td><td> ميليبور </td><td> 02-102 </td><td></td></tr><tr><td> تساى </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> A-23187 </td><td> تذوب في DMSO </td></tr><tr><td> SIN-1 </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> BML-CN245-0020 </td><td></td></tr><tr><td> DMPO </td><td> Dojindo مختبرات </td><td> D048-10 </td><td></td></tr><tr><td> FeSO 4 0.7 H 2 O </td><td> سيجما ألدريتش </td><td> 215422-250G </td><td> تذوب في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والماغنسيوم </td></tr><tr><td> مليون جالون يوميا </td><td> انزو العلوم الحياتية </td><td> ALX-400-014-M050 </td><td> تذوب في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + </td></tr><tr><td> BAEC الخلايا </td><td> خلية أنظمة </td><td> 2B2-C75 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP231-100 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> سيجما ألدريتش </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS مع CaCl 2 و 2 MgCl </td><td> سيغما Aldrich </td><td> D8662 </td><td></td></tr><tr><td> Phorbol-myristate خلات (PMA) </td><td> سيجما ألدريتش </td><td> 79346-1MG </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of nitric oxide and superoxide radical anion by electron paramagnetic resonance spectroscopy from cells using spin traps

النتروجين التفاعلي / أنواع الاكسجين (ريوس / RNS) بتركيزات منخفضة تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مما يشير، واستجابة جهاز المناعة ولكن في تركيزات غير المنظم تضر بقاء الخلية 1 و 2. في حين أن الأنظمة الحية تطورت مع الداخلية وآليات الدفاع المضادة للأكسدة الغذائية لتنظيم روس جيل، ويتم إنتاج ريوس مستمر وكأنها أمر طبيعي والمنتجات من عملية التمثيل الغذائي العادي للأوكسجين ويمكن أن يسبب الضرر التأكسدي للالجزيئات الحيوية مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البروتين وانقسام الحمض النووي، أو دهن بيروكسيد 3، و في نهاية المطاف إلى الاكسدة مما أدى إلى إصابة أو موت الخلية 4. أنيون دسموتاز الراديكالية (O 2 • -) هو مقدمة كبيرة لبعض من أكثر الأنواع المؤكسدة للغاية تعرف أنها موجودة في النظم البيولوجية مثل peroxynitrite والهيدروكسيل. جيل من O 2 • - يشير إلى أول بادرة من انفجار الأكسدة، وبالتالي، أناTS كشف و / أو عزل في النظم البيولوجية هو المهم. في هذه المظاهرة، O 2 • - قد ولدت من العدلات النوى (PMNs). من خلال تحفيز الكيميائي مع phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA)، PMN يولد O 2 • - عن طريق تفعيل أوكسيديز نيكوتيناميد ثنائي النوكليوتيد الأدينين (NADPH) فوسفات 5. أكسيد النيتريك (NO) سينسيز والتي تأتي في ثلاثة الأشكال الإسوية، ومحرض، العصبية، وNOS البطانية، أو iNOS، nNOS أو أنوش، على التوالي، ويحفز على تحويل أرجينين-L إلى L-سيترولين، وذلك باستخدام لإنتاج NADPH رقم 6 . هنا، ولدت لدينا أي من الخلايا البطانية. في ظل ظروف الاكسدة، يمكن أنوش على سبيل المثال التحول من إنتاج NO إلى O 2 • - في عملية تسمى uncoupling، التي يعتقد أن سببها أكسدة الهيم (7) أو المشارك عامل، tetrahydrobiopterin (BH 4) 8. هناك عدد قليل فقطوتقتصر وسائل موثوق بها للكشف عن الجذور الحرة في النظم البيولوجية ولكن عن طريق خصوصية وحساسية. ويشيع استخدام تعويض اللون تدور لتحديد الجذور الحرة وينطوي على رد فعل جذري إضافة إلى فخ تدور تشكيل معقد إضافي تدور الثابتة، ويمكن الكشف عنها بواسطة التحليل الطيفي الإلكترون ممغطس (EPR) صدى. وadducts مختلف جذري معرض طيف المميزة والتي يمكن استخدامها لتحديد الجذور التي يتم توليدها ويمكن أن توفر ثروة من المعلومات عن طبيعة وحركية الإنتاج جذري 9. وقد تم في nitrones دوري، 5،5، ثنائي ميثيل-بيرولين-N-أكسيد، DMPO 10، DEPMPO فسفوريل-استبدال 11، واستر، بديلا، EMPO 12 و BMPO 13، استخدمت على نطاق واسع الشراك تدور - تدور الأخير الفخاخ واظهار أطول فترة منتصف العمر لO 2 • - معقد إضافي. الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 &lt;/ يستخدم عادة&gt; الباطن إلى اعتراض NO نظرا لارتفاع معدل تكوين معقد إضافي واستقرار عالية للناتج إضافة زيادة ونقصان 14.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps at JoVE.com

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا)<sub&gt; 2</sub&gt; و 5،5، ثنائي ميثيل-1-pyroroline-N-أكسيد، DMPO، على التوالي.

اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

detection-nitric-oxide-superoxide-radical-anion-electron-paramagnetic

Research

JoVE Journal

Biology

18.8K Views.  The Ohio State University. كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 و 5،5، ثنائي ميثيل-1-pyroroline-N-أ...

Video: Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment of live cells with micron-scale resolution1. Oxygen is one of the most important molecules in the cycle of life. It serves as the terminal electron acceptor of oxidative phosphorylation in the mitochondria and is used in the production of reactive oxygen species. Measurements of oxygen are important for the study of mitochondrial and metabolic functions, signaling pathways, effects of various stimuli, membrane permeability, and disease differentiation. Oxygen consumption is therefore an informative marker of cellular metabolism, which is broadly applicable to various biological systems from mitochondria to cells to whole organisms. Due to its importance, many methods have been developed for the measurements of oxygen in live systems. Current attempts to provide high-resolution oxygen imaging are based mainly on optical fluorescence and phosphorescence methods that fail to provide satisfactory results as they employ probes with high photo-toxicity and low oxygen sensitivity. ESR, which measures the signal from exogenous paramagnetic probes in the sample, is known to provide very accurate measurements of oxygen concentration. In a typical case, ESR measurements map the probe's lineshape broadening and/or relaxation-time shortening that are linked directly to the local oxygen concentration. (Oxygen is paramagnetic; therefore, when colliding with the exogenous paramagnetic probe, it shortness its relaxation times.) Traditionally, these types of experiments are carried out with low resolution, millimeter-scale ESR for small animals imaging. Here we show how ESR imaging can also be carried out in the micron-scale for the examination of small live samples. ESR micro-imaging is a relatively new methodology that enables the acquisition of spatially-resolved ESR signals with a resolution approaching 1 micron at room temperature2. The main aim of this protocol-paper is to show how this new method, along with newly developed oxygen-sensitive probes, can be applied to the mapping of oxygen levels in small live samples. A spatial resolution of ~30 x 30 x 100 &mu;m is demonstrated, with near-micromolar oxygen concentration sensitivity and sub-femtomole absolute oxygen sensitivity per voxel. The use of ESR micro-imaging for oxygen mapping near cells complements the currently available techniques based on micro-electrodes or fluorescence/phosphorescence. Furthermore, with the proper paramagnetic probe, it will also be readily applicable for intracellular oxygen micro-imaging, a capability which other methods find very difficult to achieve.

This protocol describes a method for micron-scale three-dimensional imaging of oxygen concentration in the immediate environment of live cells by electron spin resonance microscopy.

سبين الإلكترون التصوير بالرنين الصغرى ، من الأنواع الحية لرسم خرائط الأوكسجين

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in understanding the role of mitochondrial function in obesity, diabetes, aging, cancer, cardiovascular function and safety toxicity.
Cellular metabolism is the process of substrate uptake, such as oxygen, glucose, fatty acids, and glutamine, and subsequent energy conversion through a series of enzymatically controlled oxidation and reduction reactions. These intracellular biochemical reactions result in the production of ATP, the release of heat and chemical byproducts, such as lactate and CO2 into the extracellular environment.
Valuable insight into the physiological state of cells, and the alteration of the state of those cells, can be gained through measuring the rate of oxygen consumed by the cells, an indicator of mitochondrial respiration - the Oxygen Consumption Rate - or OCR. Cells also generate ATP through glycolysis, i.e.: the conversion of glucose to lactate, independent of oxygen. In cultured wells, lactate is the primary source of protons. Measuring the lactic acid produced indirectly via protons released into the extracellular medium surrounding the cells, which causes acidification of the medium provides the Extra-Cellular Acidification Rate - or ECAR.
In this experiment, C2C12 myoblast cells are seeded at a given density in Seahorse cell culture plates. The basal oxygen consumption (OCR) and extracellular acidification (ECAR) rates are measured to establish baseline rates. The cells are then metabolically perturbed by three additions of different compounds (in succession) that shift the bioenergetic profile of the cell.
This assay is derived from a classic experiment to assess mitochondria and serves as a framework with which to build more complex experiments aimed at understanding both physiologic and pathophysiologic function of mitochondria and to predict the ability of cells to respond to stress and/or insults.

A description of a method for profiling mitochondrial function in cells is provided. The mitochondrial profile generated provides four parameters of mitochondrial function that can be measured in one experiment: basal respiration rate, ATP-linked respiration, proton leak, and reserve capacity.

الطاقة البيولوجية التجربة الملف باستخدام الخلايا Myoblast C2C12

The ability to measure cellular metabolism and understand mitochondrial dysfunction, has enabled scientists worldwide to advance their research in ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

تركيز من الأيضات من المجتمعات العوالق منخفض الكثافة لالايض البيئية باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

الكشف عن لايف<em&gt; كولاي</em&gt; O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

التصوير ثنائي الفوتون من الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2+</sup&gt; المناولة واكسيد النيتريك الإنتاج في البطانية وخلايا العضلات الملساء لعزل الجرذ الأبهر

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

أون كشف الوجه من اكسيد النيتريك وفوق الأكسيد في طبقة بطانة الأوعية الدموية من شرايين سليمة

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

تطوير وتوصيف<em&gt; في المختبر</em&gt; شبكة Microvessel والقياسات الكمية من غشائي [كا<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; ط</sub&gt; والنيتريك إنتاج أكسيد

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

الكشف عن أشكال معدلة من السيتوزين عن طريق الحساسة المناعية

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into nitrite and nitrate by interactions with various oxy-heme proteins and other still not well known pathways. The reverse process, reduction of nitrite and nitrate into NO had been discovered in mammals in the last decade and it is gaining attention as one of the possible pathways to either prevent or ease a whole range of cardiovascular, metabolic and muscular disorders that are thought to be associated with decreased levels of NO. It is therefore important to estimate the amount of NO and its metabolites in different body compartments &#8212; blood, body fluids and the various tissues. Blood, due to its easy accessibility, is the preferred compartment used for estimation of NO metabolites. Due to its short lifetime (few milliseconds) and low sub-nanomolar concentration, direct reliable measurements of blood NO in vivo present great technical difficulties. Thus NO availability is usually estimated based on the amount of its oxidation products, nitrite and nitrate. These two metabolites are always measured separately. There are several well established methods to determine their concentrations in biological fluids and tissues. Here we present a protocol for chemiluminescence method (CL), based on spectrophotometrical detection of NO after nitrite or nitrate reduction by tri-iodide or vanadium(III) chloride solutions, respectively. The sensitivity for nitrite and nitrate detection is in low nanomolar range, which sets CL as the most sensitive method currently available to determine changes in NO metabolic pathways. We explain in detail how to prepare samples from biological fluids and tissues in order to preserve original amounts of nitrite and nitrate present at the time of collection and how to determine their respective amounts in samples. Limitations of the CL technique are also explained.

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

قياس النتريت والنترات، الأيضية في اكسيد النيتريك المسار، في المواد البيولوجية باستخدام أسلوب التوهج

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&amp;#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&amp;#8226; Signals in Single Cells

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...