وقد تم تمويل هذا العمل من قبل السريرية NCI البروتين تقييم التكنولوجيا مركز (CPTAC) منحة (# U24 CA126476) ، فضلا عن منحة من مؤسسة صناعة الترفيه (EIF) ، وصندوق المرأة EIF لأبحاث السرطان للكونسورتيوم سرطان الثدي اكتشاف العلامات البيولوجية ، و هدايا سخية من مؤسسة كيك ، ومؤسسة الكناري ، والأسرة بول آلن مؤسسة جي.

الإجراءات التجريبية : ويتطلب مقايسة الببتيد الاصطناعية وأضداد الببتيد. وينبغي أن تكون فريدة من نوعها الببتيدات المحدد للبروتين من الفائدة ، وتحتوي على ما بين 8 و 22 من الأحماض الأمينية ، وليس لديهم معروفة بعد متعدية التعديلات. وتجنبت عموما مخلفات ميثيونين والببتيدات تحتوي على الأحماض الأمينية ثنائي القاعدة (على سبيل المثال KK ، KR ، RR) غير مرغوب فيها. لهذا الأسلوب ، فإنه من الشائع استخدام النظائر مستقرة الببتيدات وصفت بأنها المعايير الداخلية ، وتتضمن الثقيلة (13 C و N 15) المسمى الأحماض الأمينية في النهاية - C من الببتيد (أي K المسمى أو R). بروتوكول التالية يصف مقايسة وضعت لقياس GDSLAYGLR الببتيد من الماوس Osteopontin البروتين ، واستخدام الألغام المضادة للببتيد الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من شركة Epitomics (بورلنجام ، كاليفورنيا) والببتيدات الاصطناعية من نيو انغلاند الببتيد (غاردنر ، MA). بروتوكول يتكون من ثلاث خطوات رئيسية (الشكل 1) : 1) التربسين هضم البروتين من خليط معقد ، 2) إثراء الببتيدات 3) تحليل بواسطة مطياف الكتلة. سيظهر ذلك على عينة البلازما البشرية ارتفعت مع البروتين Osteopontin الماوس. 1. التربسين الهضم الأنزيمي وتنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أذاب 10 ميكرولتر قسامة البلازما أنيق على الجليد الرطب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين الكلي عن طريق فحص BCA وأجهزة الطرد المركزي لعينة لإزالة أي المواد الصلبة العالقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة قسامة 10 ميكرولتر من أنبوب التخزين لديها بصورة طبق deepwell ميكرولتر 1000 ، وتغطي مع بيرس ، وقادر على الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من 9M الطازجة اليوريا / 30mM dithiothreitol (DTT) (6M النهائي تركيز اليوريا / 20mM DTT) لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر العذبة iodoacetamide 500 مم (IAM النهائي 50mM) لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة تريس 257 ميكرولتر من 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) (يخفف اليوريا إلى ~ 0.6M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من محلول المخزون التربسين (1 ميكروغرام / ميكرولتر ، على انزيم 01:50 : نسبة الركيزة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 37 درجة مئوية خلال الليل (12-16 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من حمض الفورميك أنيق (تركيز النهائي من 1 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة معيار النظائر المستقرة (تضاف معايير متعددة إذا إجراء مقايسة المضاعفة ، وعادة هذا هو حوالي 10 ميكرولتر fmol 5-10 تحتوي على معيار الببتيد isotopically المسمى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل لوحة خرطوشة واحة جيدة مع 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في أسيتونتريل 80 ٪ ، وتتناسى من خلال تدفق. كرر هذا 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن لوحة خرطوشة بإضافة 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في الماء ، والتخلص من التدفق من خلال. كرر هذا 4 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل عينات من هضم لوحة خرطوشة وضبط الفراغ حتى تدفق بطيء للغاية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في الماء ، والتدفق من خلال تجاهل. كرر هذا 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الببتيدات أزل بإضافة 2 × 500 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ في أسيتونتريل 80 ٪ في 1000 لوحة في آبار عميقة ميكرولتر (لا يتخلص من التدفق من خلال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize (أو speedvac) وشطافة للجفاف. (Lyophilization هو الأسلوب المفضل) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجففة إعادة الببتيدات بإضافة 50 ميكرولتر PBS + 0.03 ٪ الفصول. </li></ol> 2. الببتيد immunoaffinity تخصيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى مستوى 96 لوحات الرفراف جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 و 1.5 ميكروغرام الأضداد البروتين - G المغلفة ميكرولتر الخرز المغناطيسي في الهدف (وهو اختياري لتشعبي الأجسام المضادة لحبات قبل الإضافة). وعلقت كذلك ضمان الخرز عن طريق هز أو vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن مع احباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن بين عشية وضحاها (12-16 ساعة) مع تراجع لطيف لضمان تعليق الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة أجهزة الطرد المركزي في 32 x ج لمدة 5 ثوان لإزالة أي سطح السائل من احباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء احباط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن إجراء غسيل وشطف من الخرز يدويا أو بطريقة آلية. يصف هذا الإجراء الخطوات الآلية على منصة الرفراف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 2 مرات مع 200 ميكرولتر الفصول + 0.03 ٪ PBS (1 في الدقيقة يغسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 1 الوقت مع التخفيف من 200 ميكرولتر 01:10 PBS الفصول + 0.03 ٪ (1 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وeluted الببتيد في 25 ماي من حامض الخليك 5 ٪ + 0.03 ٪ الفصول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على شطف المغناطيس ونقل إلى لوحة شطافة 96 بشكل جيد ، مع الحرص على عدم نقل حبات متبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية صحن مع حصيرة الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسليم لوحة تحتوي على شطافة إلى مطياف الكتلة quadrapole الثلاثي للتحليل. </li></ol> 3. تحليل من خلال رصد ردود الفعل متعددة -- الطيف الكتلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تحديد التحولات لSRM / MRM تحليل والأمثل من خلال غرس بيكو مول 1 في حل ميكروليتر القياسية في الببتيد حمض الفورميك 30 ٪ acetonitrile/0.1 ٪ في مطياف الكتلة عند 0.5 ميكرولتر / دقيقة. مرة واحدة يتم الحصول على رش مستقرة ، وجمع لطيف MS / MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم اختيار الانتقال من الطيف MS / MS عن طريق تحديد ثلاث ،ه أيونات تفتيت وفيرة في المنطقة من الطيف مع الضجيج قليلا. لمضاعفة الأيونات المشحونة الببتيد ، وشظايا ذ في الكشف عن أيون م / ض&gt; السلائف م / ض وعادة ما تكون أفضل من أجل التنمية مقايسة SRM / MRM. ويبين الشكل 2 طيف MS / MS والأيونات الانتقالية المحددة 476.3&gt; 508.3 ، 579.3 ، 692.4 (التحولات لمستوى النظائر مستقرة الثقيلة 481.3&gt; 518.3 ، 589.3 ، 702.4 لا يظهر) لGDSLAYGLR الببتيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعتمادا على وتقديم النموذج للاستخدام مطياف الكتلة ، وهناك عدة معايير يمكن أن يكون الأمثل لكل مرحلة انتقالية. هنا ، نحن الأمثل للطاقة اصطدام كل انتقال مختارة من خلال زيادة الطاقة الاصطدام ورصد مستوى الإشارة. تم استخدام الطاقة اصطدام 25 لكل مرحلة انتقالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باختصار ، تكوين نموذجي لSRM / MRM التحليل على النحو التالي : المرحلة المتنقلة (أ) حمض الفورميك بنسبة 0.1 ٪ ، (B) الأسيتونيتريل 90 ٪ / 0.1 ٪ حمض الفورميك ، 0.3 × 5 ملم فخ العمود C18 ، 75 ميكرومتر معرف x 15 سم التحليلية العمود C18 (بور Reprosil - AQ C18 ، و 120 ألف مسام °). حجم الحقن هو 10 ميكرولتر ويتم تحميل العينة لمدة 5 دقائق عند B 3 ٪ في معدل التدفق الكلي 3 ميكرولتر / دقيقة وeluted الانحدار الخطي من قبل 3-45 ٪ عند B 300-400 NL / دقيقة في 10 دقيقة. الظروف على QTRAP 4000 (ABSCIEX ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) وكان رذاذ 2.3kV الجهد ، ايون حرارة 150 درجة مئوية المصدر ، GS1 من 12 عاما ، وستارة الغاز 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل العينة SRM / MRM عن طريق ضخ 10 ميكرولتر من العينة. تتكامل المناطق الذروة لالببتيدات الخفيفة والثقيلة باستخدام برنامج الأفق (14). أحسب نسبة المساحة الذروة (PAR) من الببتيد غير المسماة / المسمى في كل عينة باستخدام الانتقالية الأكثر وفرة خالية من الضوضاء في الخلفية ، في هذه الحالة ، والانتقال Y5 (ببتيد ضوء 476.3&gt; 579.3 ، 481.3 الببتيد القياسية الثقيلة&gt; 589.3). </li></ol> 4. ممثل النتائج : قياس نسب منطقة الذروة (ضوء النسبية الذاتية لالببتيد الببتيد الثقيلة ارتفعت isotopically المسمى) مقياسا كميا لالببتيد الهدف. الشكل 3 يبين chromatogram سبيل المثال من الببتيدات الخفيفة والثقيلة في عينة SISCAPA التخصيب. علما أنه يمكن رصد الببتيدات الخفيفة والثقيلة أزل في نفس الوقت والتحولات متعددة لكل الببتيد لتأكيد الهوية. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. نظرة عامة التخطيطي لعملية SISCAPA. يتم هضم البروتين مزيج معقد في الببتيدات. يتم إثراء analytes الببتيد المستهدفة (الحليلة الذاتية وارتفعت النظائر مستقرة ذات العلامات القياسية الداخلية) استخدام الألغام المضادة للأضداد الببتيد ثبتوا على بروتين G - مغلفة الجسيمات المغناطيسية. بعد العزلة ، هي eluted والببتيدات المستهدفة من الجزيئات المغناطيسية وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة عن الكميات النسبية للمعايير الداخلية. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. MS / MS طيف GDSLAYGLR الببتيد تبين اختيار ثلاثة أجزاء عن SRM / MRM التحولات. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. chromatograms مثال يظهر ملف ذروة الحليلة الببتيد الضوء (أحمر) والنظائر الثقيلة مستقرة ذات العلامات القياسية الداخلية (الأزرق). Chromatograms للانتقال Y5 من الببتيد الخفيفة (476.3&gt; 579.3) ، والنظائر مستقرة الثقيلة المسمى القياسي (481.3&gt; 589.3) هي تآمر على مر الزمن لأنها أزل من النظام اللوني.

<ol>
	<li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry.">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li><li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+(SISCAPA).">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li><li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing.">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li><li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization.">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li><li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins:+model+application+with+apolipoprotein+A-I.">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards.">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li><li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers.">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li><li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+thyroglobulin,+a+low-abundance+serum+protein,+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry.">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry.">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li><li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers.">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li><li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS/MS:+assay+development+for+total+salivary+pepsin/pepsinogen.">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li><li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers.">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li><li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li><li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents,+surfactants,+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin.">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li><li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+immunoaffinity+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine:+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation.">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول كما هو موضح هو ضمان بقاء حبات جيدا مختلطة خلال فترة الحضانة. وسوف يسمح للالخرز لتستقر في قاع البئر / فيال نتيجة التباين المتزايد في. فمن المهم أيضا أن تدور إلى أسفل أي السائل الذي قد تبقى على رأس البئر / فيال بعد فترة الحضانة. استنساخه الهضم التربسين أمر بالغ الأهمية أيضا. ووصف الإجراء للهضم هنا قد استخدمت على نطاق واسع في مختبرنا بالتعاون مع SISCAPA ، ومع ذلك ، فإنه يمكن أن أمثل الطرق البديلة المحتملة لعملية الهضم لمجموعة معينة من البروتينات 15 هدفا شطف من الأجسام المضادة الحرة لا تتداخل مع اكتشاف. الببتيد ، من المحتمل بسبب استبعاد الضد من العمود أو elutes في وقت لاحق من الببتيد ، ولكن يمكن crosslinked الأجسام المضادة لبروتين G حبات قبل تخصيب تقارب كبير في التجارب الحرة أو إذا كان الضد يصبح مشكلة. لقد وجدنا من المفيد أيضا أن تضع المغناطيس تحت لوح العينة على الاوتوماتيكى وكذلك غسل فخ العمود في الاتجاه العكسي للتدفق (مقارنة ب تحميل) لإزالة أي بقايا أو جزيئات حبات. بالإضافة إلى نهج حبة المغناطيسي صفها ، ويمكن أيضا أن تتكيف مع أسلوب شكل عمود (أي تقارب اللوني) 12 ، 16 مرة واحدة للمستخدم هو مريح مع بروتوكول عموما ، فإن الأسلوب هو أيضا قابلة لعدة تعديلات التي تعزز الفحص الشامل. 11 الأولى ، فإنه من الممكن تحليل analytes متعددة في فحص واحد من خلال الجمع بين الأضداد في خطوة تخصيب (أي مضاعفة). مطياف الكتلة قادرة على تحليل واحد عدد كبير من analytes. ثانيا ، زيادة حجم العينة الأصلي يحسن حساسية مقايسة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المادة </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> 1000ul وحات بئر عميقة 96 - جيدا </td><td> إيبندورف </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> واحة HLB 1 خرطوشة لوحة مكعب ، باك سبتمبر ، و 40 ملغ 96 لوحة جيدا </td><td> مياه </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> الرفراف 96 لوحة جيدا </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> 96 واضح تماما ، لوحة الحائط الأبيض </td><td> الحيوي راد </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> احباط غطاء جيدا لمدة 96 لوحة </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat حصيرة ختم جيدا لمدة 96 لوحة </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> فيلم X بيرس </td><td> سيغما الدريخ </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> الرفراف المعالج حبة المغناطيسي مع رئيس المغناطيس PCR </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1 : مواد <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم المادة </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> اليوريا </td><td> سيغما الدريتش </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma قاعدة </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> ثقب </td><td> 20291 </td><td> &quot;لا تزن dithiothreitol&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين الذهب </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> بروتين G حبات المغناطيسي ، 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> الفصلان </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الفورميك </td><td> EMD </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> أسيتونتريل </td><td> الحرارية فيشر العلمية </td><td> A998 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الخليك </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2 : الكواشف <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> حل </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> 100 درجة الحموضة تريس 8 ملم </td><td></td></tr><tr><td> 9 M اليوريا / 30 ملم في تريس DTT 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) </td><td> يجب أن يكون مستعدا في كل مرة جديدة </td></tr><tr><td> 500 ملم IAM في تريس 100 ملم (الرقم الهيدروجيني 8) </td><td> يجب أن يكون مستعدا في كل مرة جديدة </td></tr><tr><td> التربسين 1mg/mL في 100 درجة الحموضة تريس 8 ملم </td><td></td></tr><tr><td> مثبط التربسين 1mg/mL في 100 درجة الحموضة تريس 8 ملم </td><td></td></tr><tr><td> نظائر مستقرة القياسية mastermix </td><td></td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للببتيد mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 3 : حلول ليكون مستعدا

quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry

هناك حاجة كبيرة لفحوصات قياس الكمي في البروتينات. وترتبط المناعية شطيرة التقليدية ، وتعتبر الى حد كبير في الكميات معيار الذهب ، مع ارتفاع تكلفة وطويلة المهلة الزمنية ، ومحفوفة عيوب (أضداد غيروي على سبيل المثال ، تدخل الأجسام المضادة ، &#39;ربط تأثير&quot;) 1 ان البديل هو تقنية تخصيب تقارب من الببتيدات مقرونا مطياف الكتلة الكمية ، ويشار اليه عادة باسم SISCAPA (المعايير النظائر المستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد) 2 في هذه التقنية ، تقارب تخصيب الببتيدات مع تخفيف النظائر مستقرة والكشف عن طريق اختيار / رصد رد فعل متعددة الطيف الكتلي ( SRM / MRM - MS) على القياس الكمي للالببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. راسخة SRM / MRM - MS لالكميات الدقيقة من جزيئات صغيرة 3 ، 4 ، ومؤخرا تم تكييفها لقياس تركيز البروتينات الموجودة في البلازما وlysates الخلية. 5-7 ولتحقيق الكميات من البروتينات ، ويتم هضم هذه الجزيئات لأكبر الببتيد المكون باستخدام انزيم مثل التربسين. ثم يتم إثراء واحد أو أكثر الببتيدات المحدد الذي تسلسل فريد من نوعه للبروتين المستهدف في ذلك الأنواع (&quot;proteotypic&quot; أي الببتيدات) من العينة استخدام الألغام المضادة للأضداد الببتيد وقياس الكمي كبديل متكافئة لتركيز البروتين في العينة. وبالتالي ، بالإضافة إلى تخفيف النظائر مستقرة (SID) أساليب (أي ارتفعت في النظائر مستقرة الببتيد المسمى قياسي) ، ويمكن استخدامها SRM / MRM لقياس تركيز الببتيد proteotypic كبديل عن الكمي للبروتينات في مصفوفات بيولوجية معقدة. والمقايسات تتمتع بالعديد من المزايا مقارنة المناعية التقليدية. الكواشف هي أقل تكلفة نسبيا لتوليد وخصوصية لتحليلها هي ممتازة ، ويمكن أن تكون المقايسات المضاعفة للغاية ، يمكن إجراء تخصيب متقنة من البلازما (أي استنزاف المطلوبة) ، وتقنية قابلة للمجموعة واسعة من البروتينات أو تعديلات من الفائدة. 8-13 وفي هذا الفيديو نظهر البروتوكول الأساسية وتكييفها لمنصة حبة المغناطيسي.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

معايير النظائر مستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد (SISCAPA) أزواج من الببتيدات تخصيب تقارب مع النظائر مستقرة تخفيف الطيف الكتلي (MRM - MS) لتوفير قياس الكمي من الببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام الجزيئات المغناطيسية في شكل الآلي جزئيا.

الكمي من البروتينات عن طريق التخصيب الببتيد Immunoaffinity اقترن الطيف الكتلي

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

quantification-proteins-using-peptide-immunoaffinity-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC. معايير النظائر مستقرة والتقط بواسطة أجسام المضادة للالببتيد (SISCAPA) أزواج من الببتيدات تخصيب تقارب مع النظائر مستقرة تخفيف الطيف الكتلي (MRM - MS) لتوفير قياس الكمي من الببتيدات كبدائل للبروتينات كل منهما. نحن هنا وصف بروتوكول باستخدام الجزيئات المغناطيسية في شكل ا?...

Video: Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

والتقييم الكمي لاستخدام الطيف Lipidome الخميرة Electrospray قداس التأين

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

الكمي في الجسم الحي من التفاعلات بروتين G مستقبلات اقترن به الطيفي ثنائي الفوتون الميكروسكوب

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

تحديد بروتين في مجمعات<em&gt; كولاي</em&gt; استخدام المتعاقبة تنقية تقارب الببتيد في تركيبة مع جنبا إلى جنب الطيف الكتلي

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

رد الفعل المحدد رصد الطيف الكتلي لالمطلق البروتين الكمي

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...