עבודה זו מומנה על ידי קלינית NCI proteomic Technology Assessment מרכז (CPTAC) מענק (# U24 CA126476) וכן מענק מקרן תעשיית הבידור (EIF) ו לחקר הסרטן הנשים EIF הקרן הקונסורציום סרטן השד סמן דיסקברי, ו מתנות נדיבה מקרן קק, קרן הקנריים, ואת ג&#39;פול אלן הקרן המשפחתית.

נוהל ניסיוני: Assay דורש פפטידים סינתטיים פפטיד אנטי נוגדנים. פפטידים נבחרים צריך להיות ייחודי לחלבון של עניין, מכילים בין 8 ל 22 חומצות אמינו, ואין ידוע שלאחר translational שינויים. שאריות מתיונין נמנעים בדרך כלל ופפטידים המכילים חומצות אמיניות dibasic (למשל KK, KR, RR) אינם רצויים. עבור טכניקה זו, מקובל להשתמש פפטידים איזוטופ יציב שכותרתו סטנדרטים פנימיים, שילוב כבד (13 C ו 15 N) שכותרתו חומצות אמינו בתחנה הסופית-C של הפפטיד (כלומר K או R שכותרתו). פרוטוקול הבאה מתארת ​​assay שפותחה כדי למדוד את GDSLAYGLR פפטיד מ Osteopontin החלבון העכבר, באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים המתקבל Epitomics Inc (Burlingame, CA) ו - פפטידים סינתטיים מניו אינגלנד פפטיד (גרדנר, MA). פרוטוקול מורכב משלושה שלבים עיקריים (איור 1): 1) טריפסין העיכול של תערובת חלבונים מורכבים, 2) העשרה של פפטידים 3) ניתוח על ידי ספקטרומטריית מסה. זה יהיה הפגינו על מדגם פלזמה אנושי מתובל החלבון Osteopontin העכבר. 1. טריפסין העיכול ניקוי האנזימטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 10 פלזמה μL aliquot מסודר על קרח רטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז החלבון הכולל ידי assay BCA ו צנטריפוגות מדגם להסיר כל מוצקים מרחפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 Pipet aliquot μL מצינור האחסון שלה כדי בצלחת 1000 deepwell μL ומכסים הסרט לנקב-מסוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של 9M טרי אוריאה / 30mm dithiothreitol (DTT) (הריכוז הסופי 6M אוריאה / 20mm DTT) מדגם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μL של iodoacetamide 500 טרי מ&quot;מ (IAM הסופי 50mm) מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 257 μL של 100 מ&quot;מ טריס (pH 8) (אוריאה מדלל ל ~ 0.6M). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של פתרון מניות טריפסין (1 מיקרוגרם / μL, כי האנזים 01:50: יחס המצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 37 ° C במשך הלילה (12-16 שעות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 μL של חומצה פורמית נקי (הריכוז הסופי של% 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף תקן איזוטופ יציב (סטנדרטים מרובים מתווספים אם ביצוע assay multiplexed, בדרך כלל זה על 10 fmol μL 50-100 המכיל של הפפטיד isotopically שכותרתו סטנדרטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הצלחת היטב עם מחסנית אואזיס μL 500 של חומצה פורמית 0.1% ב אצטוניטריל 80%, משיל את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הצלחת מחסנית על ידי הוספת 500 μL של חומצה פורמית 0.1% במים, וזורקים את הזרימה דרך. חזור על פעולה זו 4 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען דגימות לעכל הצלחת מחסנית ולהתאים את חלל כל כך הזרימה היא איטית מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם μL 500 של חומצה פורמית 0.1% במים, וזורקים זרימה דרך. חזור על פעולה זו 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים Elute ידי הוספת 2 x 500 μL של חומצה פורמית 0.1% ב 80% אצטוניטריל 1000 לתוך צלחת עמוקה גם μl (לא למחוק את הזרימה דרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize (או speedvac) eluate עד יובש. (Lyophilization היא השיטה המועדפת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש יבשים פפטידים על ידי הוספת 50 μL PBS + 0.03% בחורים. </li></ol> 2. פפטיד העשרה immunoaffinity <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת לרמת Kingfisher 96 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 ו - 1.5 מיקרוגרם נוגדן μL חלבון ה-G-חרוזים מגנטיים מצופה לכל מטרה (זה אופציונלי crosslink את הנוגדן חרוזים לפני כן). ודא חרוזים מושעים היטב על ידי רעד או vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת בנייר כסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לילה (12-16 שעות) עם עדין הנופל על מנת להבטיח חרוזים מושעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחת על XG 32 למשך 5 שניות כדי להסיר כל נוזל ממשטח האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מכסה האלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביסה elution של החרוזים יכול להתבצע באופן ידני או באופן אוטומטי. הליך זה מתאר את השלבים אוטומטית על פלטפורמת Kingfisher. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים 2 פעמים עם 200 μL PBS + 0.03% בחורים (1 לדקה לשטוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים פעם 1 עם דילול 200 01:10 μL של PBS בחורים + 0.03% (1 דקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פפטידים הם eluted ב UL 25 של חומצה אצטית 5% + בחורים 0.03%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת elution על מגנט ולהעביר את eluate לצלחת 96 באר, נזהרת שלא להעביר את חרוזי שאריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת עם מחצלת איטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת המכילה את eluate מועבר ספקטרומטר מסה לשלש את quadrapole לניתוח. </li></ol> 3. ניתוח על ידי ניטור התגובה מרובים - ספקטרומטריית מסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעברים לניתוח SRM / MRM ניתן לבחור אופטימיזציה על ידי יציקת picomole 1 לכל פתרון microliter רמת פפטיד חומצה פורמית% 30% acetonitrile/0.1 לתוך ספקטרומטר מסה על 0.5 μL / min. לאחר ריסוס יציב מתקבל, לאסוף ספקטרום MS / MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעברים נבחרו מקשת MS / MS ידי זיהוי threדואר יונים שבר בשפע באזור הקשת עם מעט רעש. עבור להכפיל יונים טעונים פפטיד, y-ion שברי זוהה ב m / z&gt; מבשר m / z הם בדרך כלל הטוב ביותר עבור התפתחות SRM / MRM assay. איור 2 מציג את ספקטרום MS / MS ויונים המעבר נבחר 476.3&gt; 508.3, 579.3 , 692.4 (מעברים עבור כבד איזוטופ יציב סטנדרט 481.3 &lt;518.3, 589.3, 702.4 לא מוצג) עבור GDSLAYGLR הפפטיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם והדגם של ספקטרומטר מסה בשימוש, ישנם מספר פרמטרים אשר יכול להיות מותאם עבור כל מעבר. כאן, אנו אופטימיזציה האנרגיה התנגשות של כל מעבר נבחר על ידי ramping האנרגיה התנגשות ניטור רמת האות. האנרגיה של ההתנגשות 25 שימש כל מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה, תצורה טיפוסית לניתוח SRM / MRM הוא כדלקמן: שלב נייד (א) חומצה פורמית 0.1%; (ב) אצטוניטריל 90% / חומצה פורמית 0.1%, 0.3 x 5 מ&quot;מ טור C18 מלכודת, 75 מיקרומטר מזהה x 15 ס&quot;מ טור אנליטית C18 (Reprosil-פור א.ק. C18, 120 נקבוביות °). נפח הזרקה הוא 10 μL ואת מדגם נטען 5 דקות ב B 3% בקצב זרימת הכולל 3 μL / דקה ו eluted ידי שיפוע ליניארית 3-45-B% ב 300-400 NL / min ב 10 דקות. תנאי על QTRAP 4000 (ABSCIEX, פוסטר סיטי, קליפורניה) רוססו 2.3kV מתח, טמפרטורה מקור יון 150 ° C, GS1 של 12, וגז וילון 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם מנותח על ידי SRM / MRM על ידי הזרקת 10 μL של המדגם. אזורים שיא משולבים עבור פפטידים קל וכבד באמצעות קו רקיע התוכנית. 14 חשב את יחס שטח השיא (PAR) של הפפטיד ללא תווית / שכותרתו במדגם כל שימוש המעבר הנפוץ ביותר כי ללא רעשי רקע, במקרה הזה, המעבר y5 (פפטיד אור 476.3 &lt;579.3, פפטיד תקן כבד 481.3 &lt;589.3). </li></ol> 4. נציג תוצאות: נמדד יחס שטח השיא (פפטיד אור יחסית אנדוגני כדי פפטיד ממוסמר isotopically שכותרתו כבד) מספקים מידה כמותי של הפפטיד היעד. איור 3 מראה דוגמא של פפטידים chromatogram קל וכבד במדגם SISCAPA מועשר. שים לב פפטידים קל וכבד elute באותו זמן ומעברים מרובים יכול להיות פיקוח על פפטיד זה כדי לוודא את זהותו. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירה סכמטי של תהליך SISCAPA. תערובת חלבונים מורכבים מתעכל לתוך פפטידים. Analytes פפטיד ממוקד (אנליטי אנדוגני איזוטופ שכותרתו ממוסמר יציב סטנדרט פנימי) מועשרים באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים משותקת על חלבון ה-G-מצופה חלקיקים מגנטיים. בעקבות הבידוד, פפטידים ממוקדות eluted מן חלקיקים מגנטיים ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה עבור quantitation יחסית לרמת הפנימי. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. MS / MS קשת GDSLAYGLR הפפטיד מראה מבחר של שלושה שברי עבור SRM / MRM מעברים. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Chromatograms דוגמה המציגה את פרופיל השיא של אנליטי פפטיד אור (אדום) ואת כבד איזוטופ יציב שכותרתו תקן פנימי (כחול). Chromatograms למעבר y5 מן הפפטיד אור (476.3 &lt;579.3) ו איזוטופ יציב כבד שכותרתו סטנדרטי (481.3 &lt;589.3) הם זממו לאורך זמן כפי שהם elute ממערכת כרומטוגרפיה.

<ol>
	<li>Hoofnagle, A. N., Wener, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+flaws+of+immunoassays+and+potential+solutions+using+tandem+mass+spectrometry.">The fundamental flaws of immunoassays and potential solutions using tandem mass spectrometry.</a> J. Immunol. Methods. 347, 3-11 (2009).</li><li>Anderson, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+quantitation+of+peptides+and+proteins+using+Stable+Isotope+Standards+and+Capture+by+Anti-Peptide+Antibodies+(SISCAPA).">Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA).</a> J Proteome Res. 3, 235-244 (2004).</li><li>Chace, D. H., Kalas, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+perspective+on+the+use+of+tandem+mass+spectrometry+for+newborn+screening+and+clinical+testing.">A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing.</a> Clin Biochem. 38, 296-309 (2005).</li><li>Want, E. J., Cravatt, B. F., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+role+of+mass+spectrometry+in+metabolite+profiling+and+characterization.">The expanding role of mass spectrometry in metabolite profiling and characterization.</a> Chembiochem. 6, 1941-1951 (2005).</li><li>Barr, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+dilution--mass+spectrometric+quantification+of+specific+proteins:+model+application+with+apolipoprotein+A-I.">Isotope dilution--mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.</a> Clin Chem. 42, 1676-1682 (1996).</li><li>Gerber, S. A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M. W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absolute+quantification+of+proteins+and+phosphoproteins+from+cell+lysates+by+tandem+MS.">Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6940-6945 (2003).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+C-reactive+protein+in+the+serum+of+patients+with+rheumatoid+arthritis+using+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry+and+13C-labeled+peptide+standards.">Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards.</a> Proteomics. 4, 1175-1186 (2004).</li><li>Whiteaker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+enrichment+of+peptides+on+magnetic+beads+for+mass-spectrometry-based+quantification+of+serum+biomarkers.">Antibody-based enrichment of peptides on magnetic beads for mass-spectrometry-based quantification of serum biomarkers.</a> Anal Biochem. 362, 44-54 (2007).</li><li>Hoofnagle, A. N., Becker, J. O., Wener, M. H., Heinecke, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+thyroglobulin,+a+low-abundance+serum+protein,+by+immunoaffinity+peptide+enrichment+and+tandem+mass+spectrometry.">Quantification of thyroglobulin, a low-abundance serum protein, by immunoaffinity peptide enrichment and tandem mass spectrometry.</a> Clin Chem. 54, 1796-1804 (2008).</li><li>Kuhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+Multiplexed+Assays+for+Troponin+I+and+Interleukin-33+in+Plasma+by+Peptide+Immunoaffinity+Enrichment+and+Targeted+Mass+Spectrometry.">Developing Multiplexed Assays for Troponin I and Interleukin-33 in Plasma by Peptide Immunoaffinity Enrichment and Targeted Mass Spectrometry.</a> Clin Chem. 55, 1108-1117 (2009).</li><li>Whiteaker, J. R., Zhao, L., Anderson, L., Paulovich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+and+multiplexed+method+for+high+throughput+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+multiple+reaction+monitoring+mass+spectrometry-based+quantification+of+protein+biomarkers.">An automated and multiplexed method for high throughput peptide immunoaffinity enrichment and multiple reaction monitoring mass spectrometry-based quantification of protein biomarkers.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 184-196 (2010).</li><li>Neubert, H., Gale, J., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+high-flow+peptide+immunoaffinity+enrichment+and+nanoflow+LC-MS/MS:+assay+development+for+total+salivary+pepsin/pepsinogen.">Online high-flow peptide immunoaffinity enrichment and nanoflow LC-MS/MS: assay development for total salivary pepsin/pepsinogen.</a> Clin. Chem. 56, 1413-1423 (2010).</li><li>Ackermann, B. L., Berna, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+immunoaffinity+techniques+with+MS+for+quantitative+analysis+of+low-abundance+protein+biomarkers.">Coupling immunoaffinity techniques with MS for quantitative analysis of low-abundance protein biomarkers.</a> Expert Rev. Proteomics. 4, 175-186 (2007).</li><li>MacLean, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).</li><li>Proc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+the+effects+of+chaotropic+agents,+surfactants,+and+solvents+on+the+digestion+efficiency+of+human+plasma+proteins+by+trypsin.">A quantitative study of the effects of chaotropic agents, surfactants, and solvents on the digestion efficiency of human plasma proteins by trypsin.</a> J. Proteome Res. 9, 5422-5437 (2010).</li><li>Berna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+immunoaffinity+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry+determination+of+a+type+II+collagen+peptide+biomarker+in+rat+urine:+Investigation+of+the+impact+of+collision-induced+dissociation+fluctuation+on+peptide+quantitation.">Online immunoaffinity liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of a type II collagen peptide biomarker in rat urine: Investigation of the impact of collision-induced dissociation fluctuation on peptide quantitation.</a> Anal. Biochem. 356, 235-243 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול כפי שתואר הוא הבטחת החרוזים להישאר היטב מעורבת במהלך תקופת הדגירה. מתן חרוזים כדי ליישב לתחתית הבאר / בקבוקון תגרום השתנות מוגברת. חשוב גם ספין למטה נוזלי העלול להישאר בחלק העליון של הבאר / בקבוקון לאחר תקופת הדגירה. העיכול טריפסין לשחזור גם קריטי. ההליך המתואר כאן לעיכול נוצל באופן נרחב בשיתוף עם SISCAPA במעבדה שלנו, עם זאת, הוא בשיטות חלופיות סביר של מערכת העיכול יכול להיות מותאם עבור קבוצה מסוימת של חלבונים יעד 15 elution של נוגדן חופשי לא להפריע לזיהוי של. הפפטיד, סביר להניח כי את הנוגדן אינו נכלל מהעמודה או elutes יאוחר פפטידים, אבל את הנוגדן ניתן crosslinked את חרוזי חלבון G לפני העשרה זיקה בניסויים גדול או אם נוגדן חופשי הופך לבעיה. מצאנו גם את זה שימושי למקום מגנט מתחת לצלחת מדגם על autosampler כמו גם שטיפת העמודה מלכודת בכיוון ההפוך של הזרימה (לעומת טעינה) כדי להסיר כל החרוזים שיורית או חלקיקים. בנוסף הגישה חרוז מגנטי המתואר, הטכניקה ניתן גם להתאים לתבנית עמודה (כלומר זיקה כרומטוגרפיה). 12, 16 לאחר שהמשתמש מרגיש נוח עם פרוטוקול הכולל, הטכניקה היא גם מקובל מספר שינויים המשפרים את assay הכוללת. 11 ראשית, ניתן לנתח analytes מרובים assay אחת על ידי שילוב של נוגדנים בשלב העשרה (כלומר ריבוב). ספקטרומטר מסה הוא מסוגל לנתח בו זמנית מספר גדול של analytes. שנית, הגדלת נפח המדגם המקורי משפרת את הרגישות של assay.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם החומר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> צלחות עמוקות גם 96-היטב 1000ul </td><td> Eppendorf </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> אואזיס HLB 1 סמ&quot;ק צלחת מחסנית, ספטמבר-Pak, 40 צלחת 96 מ&quot;ג היטב </td><td> ווטרס </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> Kingfisher 96 גם צלחת </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> נקה 96 היטב, צלחת קיר לבן </td><td> Bio-Rad </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> לסכל לחפות על צלחת יפה 96 </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> Axymat מחצלת איטום לצלחת 96 טוב </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> X לנקב הסרט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> Kingfisher מעבד חרוז מגנטי עם ראש מגנט PCR </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: חומרים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם החומר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> דשן </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma בסיס </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> לנקב </td><td> 20291 </td><td> &quot;לא, לשקול dithiothreitol&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין זהב </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> חלבון G חרוזים מגנטיים, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> בחורים </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> 28300 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה פורמית </td><td> EMD </td><td> 11670 </td><td></td></tr><tr><td> אצטוניטריל </td><td> תרמו פישר סיינטיפיק </td><td> A998-1 </td><td></td></tr><tr><td> חומצה אצטית </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 2: ריאגנטים <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> פתרון </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> 100 מ&quot;מ טריס pH 8 </td><td></td></tr><tr><td> 9 M אוריאה / DTT 30 מ&quot;מ 100 מ&quot;מ טריס (pH 8) </td><td> חייב להיות מוכן טריים בכל פעם </td></tr><tr><td> 500 מ&quot;מ IAM ב 100 מ&quot;מ טריס (pH 8) </td><td> חייב להיות מוכן טריים בכל פעם </td></tr><tr><td> טריפסין 1mg/mL ב-pH 100 טריס 8 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> מעכבי טריפסין 1mg/mL ב-pH 100 טריס 8 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> איזוטופ יציב סטנדרט mastermix </td><td></td></tr><tr><td> Anti-פפטיד נוגדן mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3: פתרונות להיות מוכנים

quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry

יש צורך גדול מבחני כמותי למדידת חלבונים. Immunoassays כריך מסורתית, נחשב במידה רבה את תקן הזהב ב quantitation, קשורים עם עלות גבוהה, זמן להוביל ארוך, והם טומנת בחובה חסרונות (נוגדנים heterophilic למשל, התערבות autoantibody, &quot;וו אפקט&quot;). 1 טכניקה חלופית היא העשרה זיקה של פפטידים יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית, המכונות גם SISCAPA (איזוטופ יציב סטנדרטים ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים). 2 בטכניקה זו, העשרה זיקה של פפטידים עם דילול איזוטופ יציב זיהוי על ידי נבחרת / מרובות ניטור התגובה ספקטרומטריית מסה ( SRM / MRM-MS) מספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. SRM / MRM-MS היא מבוססת היטב על quantitation מדויק של מולקולות קטנות, 3, 4 ולאחרונה הותאם למדידת ריכוזים של חלבונים בפלסמה lysates התא. 5-7 כדי להשיג quantitation של חלבונים, מולקולות אלה גדול מתעכלים עד פפטידים רכיב באמצעות אנזים כגון טריפסין. אחד או יותר פפטידים אשר נבחר רצף ייחודי חלבון היעד מינים (כלומר &quot;proteotypic&quot; פפטידים) מועשרים אז מן המדגם באמצעות פפטיד אנטי נוגדנים, כפי שהיא נמדדת בתחליפים stoichiometric כמותי ריכוז חלבון במדגם. לפיכך, מצמידים את דילול איזוטופ (SID) שיטות יציב (כלומר זינק ב-איזוטופ יציב הנקרא פפטיד סטנדרטי), SRM / MRM ניתן להשתמש כדי למדוד ריכוזים של פפטידים proteotypic כתחליפי עבור וכימות של חלבונים מטריצות ביולוגיות מורכבות. מבחני יש כמה יתרונות לעומת immunoassays המסורתית. ריאגנטים הם יחסית פחות יקר לייצר, הספציפיות עבור אנליטי הוא מעולה, מבחני ניתן multiplexed מאוד, העשרה ניתן לבצע מפלסמה מסודר (דלדול לא חובה), ואת הטכניקה ניתנת מגוון רחב של חלבונים או שינויים של עניין. 8-13 בסרטון הזה אנחנו מדגימים את פרוטוקול בסיסי המותאם פלטפורמה חרוז מגנטי.

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry at JoVE.com

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיות חלקית.

כימות של חלבונים באמצעות העשרה Immunoaffinity פפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

quantification-proteins-using-peptide-immunoaffinity-enrichment

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  Fred Hutchinson Cancer Research Center - FHCRC. תקנים איזוטופ יציב ו ללכוד על ידי Anti-פפטיד נוגדנים (SISCAPA) זוגות להעשרת הזיקה של פפטידים עם איזוטופ יציב דילול ספקטרומטריית מסה (MRM-MS) כדי לספק מדידה כמותית של פפטידים כתחליפי עבור חלבונים, בהתאמה. כאן אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות חלקיקים מגנטיים בפורמט אוטומטיו?...

Video: Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

הערכה כמותית של Lipidome שמרים באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial applications as well as increases basic fundamental biological knowledge. F&ouml;rster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) between a donor molecule in an electronically excited state and a nearby acceptor molecule has been frequently utilized for studies of protein-protein interactions in living cells. The proteins of interest are tagged with two different types of fluorescent probes and expressed in biological cells. The fluorescent probes are then excited, typically using laser light, and the spectral properties of the fluorescence emission emanating from the fluorescent probes is collected and analyzed. Information regarding the degree of the protein interactions is embedded in the spectral emission data. Typically, the cell must be scanned a number of times in order to accumulate enough spectral information to accurately quantify the extent of the protein interactions for each region of interest within the cell. However, the molecular composition of these regions may change during the course of the acquisition process, limiting the spatial determination of the quantitative values of the apparent FRET efficiencies to an average over entire cells. By means of a spectrally resolved two-photon microscope, we are able to obtain a full set of spectrally resolved images after only one complete excitation scan of the sample of interest. From this pixel-level spectral data, a map of FRET efficiencies throughout the cell is calculated. By applying a simple theory of FRET in oligomeric complexes to the experimentally obtained distribution of FRET efficiencies throughout the cell, a single spectrally resolved scan reveals stoichiometric and structural information about the oligomer complex under study. Here we describe the procedure of preparing biological cells (the yeast Saccharomyces cerevisiae) expressing membrane receptors (sterile 2 &alpha;-factor receptors) tagged with two different types of fluorescent probes. Furthermore, we illustrate critical factors involved in collecting fluorescence data using the spectrally resolved two-photon microscopy imaging system. The use of this protocol may be extended to study any type of protein which can be expressed in a living cell with a fluorescent marker attached to it.

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

By employing a spectrally resolved two-photon microscopy imaging system, pixel-level maps of F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiencies are obtained for cells expressing membrane receptors hypothesized to form homo-oligomeric complexes. From the FRET efficiency maps, we are able to estimate stoichiometric information about the oligomer complex under study.

ב כימות vivo של G מצמידים חלבון קולטן אינטראקציות באמצעות נפתר Spectrally שני פוטון מיקרוסקופית

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...