القياسات الكمية الدقيقة للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات لفهم المرض مرة أخرى إلى علم الأحياء. والهدف العام لهذه التجربة هو توفير سير عمل بروتيومي كمي متكامل لعينات الأنسجة، يجمع بين التنميط البروتيني الخالي من الملصقات والقائم على التسمية لاكتشاف العلامات الحيوية. في هذه الدراسة، استخدمنا أداة Orbitrap Fusion لتحديد البروتينات باستخدام نهج قائمة على التسمية وخالية من التسمية.
تحلل الأنسجة هو واحد من أهم الخطوات لنجاح تجربة LC-MS-MS. تأخذ 30 ملغ من الأنسجة في أنبوب حبة الضرب. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، إضافة 300 ميكرولتر من العازلة تحلل اليوريا التي تحتوي على ثمانية اليوريا الضرس، تريس، NaCl وMgCl2.
باستخدام سونيكاتور التحقيق، lyse محتويات الأنسجة. كرر هذا لدورة أخرى. إذا لاحظت أي نسيج سليم في الجزء السفلي من الأنبوب ، فأضف حبات الزركونيوم إلى الأنبوب وتجانس الأنسجة باستخدام مضرب حبة لمدة 90 ثانية ، مع حضانة لمدة خمس دقائق على الجليد.
طرد مركزي العينات حول 6000 G لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية لفصل حطام الخلية من supernatant. جمع supernatant في أنبوب جديد وخلط الحل بشكل موحد. تحديد تركيز البروتين في الأنسجة lysate باستخدام كاشف برادفورد.
لهذا، قياس OD من العينة في 595 نانومتر واستقراء باستخدام الرسم البياني القياسية كما هو مبين على هذه الشاشة. بعد تحديد كمية البروتين، قم بتشغيل 10 ميكروغرام من lysate الأنسجة على هلام 12٪ SDS-PAGE للتحقق من جودة اللسات. الخطوة الأولى في عملية الهضم في حل ينطوي على الحد من السندات ثنائي الكبريتيد، وذلك باستخدام TCEP.
بعد إضافة TCEP، احتضان محتويات الأنبوب لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية. وينطوي الخطوة التالية على الألكيل لمنع إعادة تشكيل سندات ثاني كبريتيد مخفضة. إضافة عامل الألكيل مثل iodoacetamide واحتضان الأنبوب في الظلام لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة ، خفض التركيز النهائي لليوريا إلى أقل من ضرس واحد عن طريق التخفيف مع أربعة إلى ثمانية مجلدات من العازلة المخفف. عند هذه النقطة، فإنه من المستحسن للتحقق من درجة الحموضة. الخطوة التالية تنطوي على إضافة التريبسين إلى الأنبوب، واحتضان الأنبوب بين عشية وضحاها لعملية الهضم الفعالة.
في اليوم التالي، وتجفيف الببتيدات المهضومة في تركيز فراغ، والمضي قدما لخطوة تحلية. لأداء تحلية الببتيدات، استخدم نصائح المرحلة C18. تنشيط تلميح المرحلة C18 بإضافة 50 ميكرولتر من الميثانول، والطرد المركزي تلميح في 1000 G لمدة دقيقتين.
الآن, إضافة 50 ميكرولتر من أسيتونيتريل في 0.1٪ حمض الفورميك لغسل طرف المرحلة, ومرة أخرى, الطرد المركزي غيض. إعادة تشكيل الببتيدات المجففة المهضومة في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪. إضافة الببتيدات المعاد تشكيلها في تلميح المرحلة المنشطة.
كرر هذه الخطوة أربع مرات على الأقل. لغسل العينة، أضف 50 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، وكرر خطوة الطرد المركزي. ل elution من الببتيدات، إضافة 50 ميكرولتر من 40٪ ACN في حمض الفورميك 0.1٪، وتمريره من خلال تلميح المرحلة عن طريق الطرد المركزي.
كرر هذه الخطوة مع 50٪ و 60٪ ACN في حمض الفورميك 0.1٪وجمع filtrate في أنبوب جديد. جفف الببتيدات المجففة باستخدام مكثف فراغ. قبل تشغيل LC-MS-MS، قم بقياس الببتيدات باستخدام طريقة Scopes.
لهذا، تحميل اثنين من ميكرولتر من عينة المعاد تشكيلها في بئر لوحة ميكرودروب، وقياس الامتصاص في 205 نانومتر و 280 نانومتر. حساب التركيز من الصيغة الموضحة على هذه الشريحة. بمجرد تجفيف الببتيدات المجففة ، فهي جاهزة للقياس الكمي القائم على التسمية.
بالنسبة لعلامات iTRAQ ، يجب إعادة تشكيل الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من العازلة للحل ، المقدمة في مجموعة وضع العلامات iTRAQ. إعادة تشكيل التسميات عن طريق إضافة الإيثانول من القارورة المقدمة في عدة، وتخلط جيدا. من المستحسن أن يتم تنفيذ جميع الخطوات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أضف ملصقات iTRAQ المختلطة بشكل متجانس إلى أنابيبها الخاصة بها والسماح لتفاعل وضع العلامات بالانخاض. في نهاية رد الفعل، أطفئ أي ملصق غير مقيد زائد في الأنبوب عن طريق إضافة ماء من درجة MS، واحتضانه لمدة نصف ساعة إلى ساعة واحدة. الآن، نقل جميع المحتويات المسماة في أنبوب واحد وتجفيف الببتيدات المسمى.
بعد إعادة تشكيل العينات في حمض الفورميك 0.1٪، افتح الاختام التلقائي ل NanoLC، ووضع العينات داخل autosampler. بمجرد وضع العينات في الاختام التلقائي ، من المهم تعيين المعلمات الصحيحة للكروماتوغرافيا السائلة وقياس الطيف الكتلي. هنا، نقوم بوصف معلمات كل من الكمية الخالية من التسمية والتحديد الكمي القائم على iTRAQ باستخدام LC-MS.
في حالة الكمية الخالية من التسمية، تم استخدام تدرج لمدة 120 دقيقة كعينة واحدة غير مكسرة يتم حقنها. يمكن زيادة هذه المدة أو تقليلها استنادا إلى تعقيد العينة. في هذه التجربة، تم تعيين تدفق 300 نانولتر في الدقيقة الواحدة مع التدرج التالي للحل B، وهو 80٪ أسيتونيتريل في حمض الفورميك 1٪، في هذه الحالة.
وبنفس الطريقة، يمكننا تعيين تدرج لتجربة iTRAQ. وبما أن العينات غير مكسرة، فقد استخدم تدرج مدته 90 دقيقة. يمكن رؤية معلمات MS لكل من القياس الكمي الخالي من التسمية ، وكذلك القياس الكمي القائم على تسمية iTRAQ ، هنا.
تتضمن الخطوة الأولى إعداد وضع التطبيق بالنقر فوق المعلمات العمومية. حدد وضع الببتيد، وحدد مدة الأسلوب وفقا لتدرج LC المستخدم. حدد معلمات المسح الضوئي للتجربة.
عند النقر فوق الخيار MS-OT المعلمات تصبح مرئية. يتم تعيين نوع الكاشف قيد الاستخدام إلى Orbitrap. الخيار الآخر المتاح على هذا الصك يتضمن فخ أيون.
تم تعيين الدقة إلى 60,000، ويمكن للمرء الاختيار بين الخيارات المختلفة المتاحة، اعتمادا على الحاجة ونوع التجربة. نطاق الكتلة طبيعي، ويتم تعيين نطاق المسح الضوئي من 375 إلى 1700. المعلمات الأخرى افتراضية لتطبيق MS.
تم تعيين عتبة الكثافة، وتعيين حالة الشحن في نطاق من اثنين إلى ستة. تم تعيين الاستبعاد الديناميكي إلى 40 ثانية ، وتم الاحتفاظ بالتسامح الجماعي إلى 10. تتضمن المجموعة التالية من المعلمات المعلمات MS-MS.
تم تحديد وضع العزل مع رباعية، نافذة العزل تعيين في اثنين، تم تعيين إزاحة العزل إلى إيقاف، ونوع التنشيط عادة ما يكون HCD لتجربة بروتيوميكس. يمكن إما إصلاح طاقة الاصطدام ، أو يمكن مساعدتها. تتطلب العينات الموسومة طاقات تصادم أعلى ، وبالتالي ، بالنسبة لتجارب iTRAQ ، من المستحسن تعيين طاقة الاصطدام إلى 35 ، في حين أنه بالنسبة لتجارب LFQ ، يمكن تعيينها إلى 30.
نوع الكاشف المستخدم هنا هو أوربيراب. سيكون وضع نطاق المسح الضوئي تلقائيا. المعلمات الأخرى افتراضية لتجارب iTRAQ وتجربة كمية خالية من التسميات.
سيؤدي النقر على الملخص إلى تقديم نظرة عامة على جميع معلمات LC وMS المستخدمة في التجربة. يمكنك إلقاء نظرة على كل معلمة والقيام التدقيق اللغوي. بمجرد الانتهاء من ذلك ، ثم انقر على الملف وحفظه كملف الأسلوب.
بمجرد حفظ، ثم يمكنك تشغيل الأسلوب، وسوف تحصل على الملفات الخام. وبعد ذلك يمكن تحليل تلك الملفات الخام باستخدام برنامج Proteome Discoverer. يظهر هذا الرقم تغطية تسلسل BSA في ثلاث نسخ متماثلة تقنية ، وهي 91٪ في النسخ المتماثلة الثلاثة.
وهذا يشير إلى إمكانية استنساخ الصك. الآن، يظهر هذا الرقم التوحيد في عدد المباريات الطيفية الببتيد، والببتيدات، والبروتينات التي تم تحديدها في ثلاث عينات بيولوجية مختلفة، والتي، مرة أخرى، يعطي فكرة عن استنساخ الصك. هنا، يمثل الرسم البياني Venn البروتينات الشائعة والحصرية التي تم تحديدها في ثلاث عينات مختلفة في تجربة خالية من الملصقات والتجربة القائمة على التسمية.
تظهر هذه الرسوم البيانية الشريطية عدد المطابقات الطيفية للببتيد ومجموعات الببتيد ومجموع البروتينات ومجموعات البروتين وعدد البروتين بعد 1٪ FDR ، المحدد في تجربة LFQ و iTRAQ. بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف للتحليل البروتي الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ.
ويضمن استخدام النسخ المتماثلة التقنية إمكانية استنساخ جيدة، حتى لو تم تشغيل العينات في نقاط زمنية مختلفة. هنا ، أظهرنا تحليل عينات الأنسجة باستخدام طريقتين للكمية: البروتيوم الخالي من التسمية والقائم على التسمية. قد يعتمد اختيار التقنيات البروتيوميكية الكمية على عدد العينات وتوافر منصات MS والسؤال البيولوجي الذي سيتم تناوله.
