ونحن ممتنون لادا جونكو لمساعدتها التقنية الممتازة. ونحن ممتنون للبروفيسور أكيو Nomoto لتوفير تتكرم متجه التعبير عن الفيروسة العصوية PVR - IgG2a. وأيد هذه الدراسة في جزء من المنح التي تقدم للمساعدة في الترويج للقضاء على شلل الأطفال وبحوث الناشئة والمستجدة من الأمراض المعدية في وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية.

1. إعداد المتوسطة الصيانة (MM) والنمو المتوسط ​​(GM) MM لإعداد وجنرال موتورز ، الرجاء راجع دليل مختبرات شلل الأطفال في منظمة الصحة العالمية 1. Dulbecco المتوسطة لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 10 ٪ يمكن استخدامها كبدائل للFCS MM وجنرال موتورز ، على التوالي. 2. إعداد المضادة للأضداد PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (الكهروضوئية RIVM كتابة ضدي) عن طريق إضافة المياه (0.5 مل في القارورة) إلى كل قارورة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (نوع 1 أو 2 أو 3). إضافة هذه الحلول تشكيل الأضداد (0.5 مل لكل منهما) إلى 4.5 مل من MM في أنابيب منفصلة المسمى. ملاحظة : يتم توفير بعض الكثير من الأجسام المضادة للPV كشكل المعاد (0.5 مل في القارورة). الكثير من هذا القبيل لمكافحة PV الأضداد ، بالإضافة إلى إعادة المياه ليست ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج متساو من حجم الأجسام المضادة لمكافحة PV المعاد. لمكافحة PV1 +2 ، 2 +3 ، أو 3 +1 : مزيج 1.8 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.8 مل + 1.8 مل = 3.6 مل لكل الخليط). لمكافحة PV1 +2 +3 : مزيج 1.2 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.2 مل + 1.2 مل + 1.2 = 3.6 مل مل). ملاحظة : يمكن أن تحتوي على عينات PV خليط من الأنماط المصلية مختلفة من الكهروضوئية. لتحديد النمط المصلي واحدة من الكهروضوئية في العينات مع مزيج من المحاضر الحرفية ، وحمامات المضادة للأضداد الكهروضوئية (أي 1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، 1 +2 +3) أمر ضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 05/01 حجم FCS (0.72 مل) لكل PV - المضادة (1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، أو 1 +2 +3) الأضداد (3.6 مل لكل منهما) (FCS النهائية 18.2 ٪). ملاحظة : إضافة FCS هو من أجل الحد من تراص غير محدد من الجسيمات الجيلاتين التي تسببها الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الضد في برك -20 درجة مئوية حتى استخدامها في فحص للسلطة الفلسطينية. </li></ol> 3. إعادة تشكيل الجسيمات الجيلاتين توعيتهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من العازلة إعادة إدراجها في مجموعة واحدة من الجسيمات فيال الجيلاتين توعية (على النحو المنصوص عليه مسحوق تجميد المجفف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد من خلال استغلال طيف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الجسيمات المعاد توعية في 4 درجات مئوية. ويمكن تشكيل الجسيمات الجيلاتين تكون نشطة على الأقل 2 أسابيع يحتفظ بها في 4 درجات مئوية ، ولكن ينبغي أن نكون مستعدين تماما قبل الفحص. </li></ol> ملاحظة هامة : لا تخلط الكثير من جسيمات مختلفة الجيلاتين توعيتهم ، لأن الصورة غير تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم يمكن أن تكون مختلفة عن الكثير من الجسيمات. لكل تجربة ، يجب استخدام الكثير واحد من الجسيمات الجيلاتين توعيتهم. 4. السلطة الفلسطينية مقايسة لتحديد PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة المعايرة الدقيقة. لتحديد عينة الفيروس واحد ، نحن بحاجة إلى 5 آبار + واحد على الأقل السيطرة السلبية (الجسيمات دون وعي الفيروسات والأجسام المضادة ، كذلك # 6 في الأسفل ، وانظر أي السيطرة على الفيروس والأجسام المضادة في المثال). إجمالي عدد الآبار 5 × عينات + واحد على الأقل التحكم في مقايسة. ملاحظة هامة : يرجى اتخاذ واحد على الأقل لا تحكم الفيروسات والأجسام المضادة في مقايسة. قنينة واحدة من الجسيمات توعية تقريبا لتحديد عينات الفيروس 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر / جيد المضادة للأجسام المضادة أو المعدلة وراثيا PV إلى لوحة المعايرة الدقيقة. الترتيب للوحة هو كما يلي (انظر أيضا مثال أدناه). في عينات من دون الضد (وأيضا # 1 و 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من الأضداد المضادة للالكهروضوئية. ملاحظة هامة : إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، فإن ماصة الأقنية أو الموزع يكون من المفيد لهذه الخطوة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كذلك # 1 </td><td> كذلك # 2 </td><td> كذلك # 3 </td><td> كذلك # 4 </td><td> كذلك # 5 </td><td> كذلك # 6 </td></tr><tr><td> جنرال موتورز </td><td> مكافحة P1 +2 +3 </td><td> مكافحة P1 +2 </td><td> مكافحة - P2 +3 </td><td> العاني - P1 +3 </td><td> جنرال موتورز </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر / بئر عينة الفيروس. في عينة واحدة من دون فيروس (جيد # 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من حل الفيروس. ملاحظة : عينة الفيروس هو طاف ثقافة الخلايا المصابة والخلايا أو الخلايا عادة L20B RD. ملاحظة هامة : إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، سيكون من المفيد ماصة الأقنية لهذه الخطوة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كذلك # 1 </td><td> كذلك # 2 </td><td> كذلك # 3 </td><td> كذلك # 4 </td><td> كذلك # 5 </td><td> كذلك # 6 </td></tr><tr><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> جنرال موتورز </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ المعاد حل الجسيمات بحساسية من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة ، والاستفادة تماما برفق لتعليق الجسيمات. ملاحظة هامة : بعد الوقف الكامل للجسيمات من خلال استغلال طيف ، ينبغي أن تضاف الجزيئات على الفور إلى لوحات قبل precipita والجسيمات العالقةالشركة المصرية للاتصالات وشكل غير متجانسة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر / جيدا الجسيمات توعية جميع الآبار. ملاحظة هامة : بعد إضافة الجسيمات توعيتهم ، ينبغي على الفور لوحة يتعرضون لوحة مزج لبدء رد فعل موحد للعينات. لذا ، ينبغي أن يؤديها إضافة الجسيمات توعيتهم باستخدام موزع لتصغير الفجوة الزمنية بين العينات في اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المعايرة الدقيقة على خلاط واخلطه لوحة لوحة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المعايرة الدقيقة على ورق أبيض (للراحة الملاحظة البصرية) على طاولة في درجة حرارة الغرفة (15 ~ 30 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة. ملاحظة هامة : لا تتحرك لوحة أثناء وبعد رد الفعل لرصد النتائج وأخذ الصور. وشكلت تراص غير مستقر ومضطربا بسهولة عن طريق نقل الصفائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور من لوحة. ملاحظة هامة : ويمكن رؤية جزئية من الصور لا تعطي معلومات كافية لفحص في وقت لاحق ، وإعادة النظر في نتائج للترجمة الشفوية. وينبغي اتخاذ عدة صور لتغطية جميع الآبار لوحات تركز على الصورة تراص من الآبار. </li></ol> 5. تفسير النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الآبار الإيجابية والسلبية. مقارنة تراص في العينات مع عدم وجود مراقبة الفيروس والأجسام المضادة (ترسب جزيئات الجيلاتين ، وعدم تراص) (الشكل 1 و 2). يجب أن يحكم من تراص الصور التي يتم تمييزها بوضوح من أي فيروس وليس السيطرة الأضداد (غير تراص ، ومراقبة سلبية) بأنها إيجابية ، ويجب أن يحكم من تراص الصور التي تشبه إلى سيطرة السلبية والسلبية. ويمكن الحكم على العينات التي تظهر تراص واضحة ولكن جزئيا فقط بأنها إيجابية ، ولكن السجل ك &quot;الإيجابية (تراص جزئي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الكهروضوئية. تفسير النتائج اعتمادا على الآبار الإيجابية والسلبية المضادة للأضداد الكهروضوئية لتحديد الأنماط المصلية الكهروضوئية. مبدأ تفسير النتيجة هي مماثلة لتلك التي في تحييد نظام اختبار ثقافة خلية (على سبيل المثال إيجابية لمكافحة الأجسام المضادة +2 P1 يشير إلى أن العينة تحتوي على نوع 3 PV). </li></ol> 6. ممثل النتائج ويظهر نتيجة ممثل السلطة الفلسطينية تحديد مقايسة الكهروضوئية في الشكل 1. جميع سلالات PV شكلت تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم (أي عينات الأضداد). في وجود أضداد PV المقابلة ، وترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص) مماثلة لفيروس لا توجد رقابة والأضداد (مراقبة سلبية) وحظ (على سبيل المثال ، PV1 (سابين) في حضور P1 مكافحة +2 أو P3 المضادة للأضداد +1). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. حلول التعرف على الفيروسات التي PV مقايسة السلطة الفلسطينية. PV1 من (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 1.2 X CCID 8 10 50 / 12 ميكرولتر ، 8.2 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، و واستخدمت 3.5 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، على التوالي) لتحديد الهوية من جانب السلطة الفلسطينية مقايسة. لم يظهر أي فيروس وليس السيطرة الأضداد ترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص ، ومراقبة سلبية). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. تفسير الآبار الإيجابية والسلبية. حلول الفيروسات من PV1 (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 2.4 × 10 8 ميكرولتر 50/25 CCID ، 1.7 × 10 8 CCID ميكرولتر 50/25 ، و وكانت مخففة 7.3 × 10 7 CCID 50/25 ميكرولتر ، على التوالي) 1 / 20-320 / 1 ، ومن ثم تم فحص عينات من 25 ميكرولتر المخففة التي مقايسة السلطة الفلسطينية من دون المضادة للPV الأضداد.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , (2004).</li><li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus.">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li><li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site.">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li><li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms.">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li><li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells.">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li><li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptor+for+poliovirus:+molecular+cloning,+nucleotide+sequence,+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily.">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li><li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion.">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li><li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor.">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li><li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro.">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li><li>Avoort, H. G. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses.">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li><li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+group-,+serotype-,+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues.">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li></ol>

Souji Masujima هو موظف من المنتجات الجديدة قسم التصميم ، شركة Fujirebio

في نقطة وحيدة من هذا الاختبار هو السلطة الفلسطينية الاستفادة من جزيء PVR بدلا من مكافحة PV الأضداد للكشف عن الكهروضوئية 2. هذا يسمح للتفاعل معينة من الجسيمات الجيلاتين مع توعية الكهروضوئية مع تقارب موحد لجميع الأنماط المصلية الثلاثة 3-6 الكهروضوئية. استخدمنا نموذ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> توعية جيلاتين الجسيمات </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> إعادة العازلة </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> لوحة Microtitration </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للالكهروضوئية </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

particle agglutination method for poliovirus identification

في المبادرة العالمية لاستئصال شلل الأطفال ، ومختبر التشخيص يلعب دورا حاسما من خلال عزل وتحديد الكهروضوئية من عينات البراز من الشلل الرخو الحاد (اف ب) الحالات. في منظمة الصحة العالمية (WHO) في الوقت الحاضر شبكة مختبرات شلل الأطفال ، والعزلة ، وتحديد الكهروضوئية التي يتم تنفيذها باستخدام خلية نظام الثقافة في الوقت الحقيقي وRT PCR ، على التوالي. في حقبة ما بعد القضاء على الكهروضوئية ، وتحديد إجراءات بسيطة وسريعة تكون مفيدة للتأكيد السريع لحالات شلل الأطفال في المختبرات الوطنية. في هذه الدراسة ، وسوف نعرض لإجراءات فحص رواية السلطة الفلسطينية وضعت لتحديد الكهروضوئية. ويستخدم هذا الاختبار للسلطة الفلسطينية من التفاعل جزيء الكهروضوئية (PVR) ومستقبلات الفيريون التي تقارب محددة وموحدة لجميع الأنماط المصلية الكهروضوئية. الإجراء بسيط (واحد من إجراء الخطوة رد فعل في لوحات) و (يمكن الحصول على نتائج في غضون 2 ساعة من رد الفعل) السريع ، ويلاحظ البصر نتيجة (مراقبة تراص جزيئات الجيلاتين).

Watch this Scientific Journal Video about Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification at JoVE.com

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

يسمح للجسيمات الرواية وضعت مؤخرا تراص (السلطة الفلسطينية) مقايسة باستخدام جزيء الفيروس إلى تحديد مستقبلات سريعة وسهلة لفيروس شلل الأطفال (PV). في هذه المقالة ، سوف نعرض لإجراء فحص للسلطة الفلسطينية لتحديد الكهروضوئية.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  National Institute of Infectious Diseases. يسمح للجسيمات الرواية وضعت مؤخرا تراص (السلطة الفلسطينية) مقايسة باستخدام جزيء الفيروس إلى تحديد مستقبلات سريعة وسهلة لفيروس شلل الأطفال (PV). في هذه المقالة ، سوف نعرض لإجراء فحص للسلطة الفلسطينية لتحديد الكهروضوئية.

Video: Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

إجراء 1.5 ساعة لتحديد معوي أنواع الثقافات مباشرة من الدم

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

تحديد القائمة على الببتيد من الزخارف وظيفية وشركائها التجليد

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

متوسط ​​الفيروسية مغلف جلايكوبروتين المسامير من الكترون Cryotomography إعادة بناء باستخدام Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

الفيروسية في وقت مبكر فحوصات دخول لتحديد وتقييم المركبات المضادة للفيروسات

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...