אנו מודים Junko ואדה לקבלת סיוע טכני מעולה שלה. אנו מודים לפרופ &#39;אקיו Nomoto עבור באדיבות מתן וקטור ביטוי baculovirus עבור PVR-IgG2a. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי-in-Aid לקידום פוליו חיסול ומחקר על מתעוררים מחדש המתעוררים מחלות זיהומיות של משרד העבודה הבריאות, והרווחה.

1. הכנת בינוני אחזקה (MM) וצמיחה בינוני (GM) להכנת MM ו-GM, ראה מדריך מעבדה פוליו של WHO 1. מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (FCS) ו -10% FCS יכול לשמש תחליפים של MM ו-GM, בהתאמה. 2. הכנת נוגדנים נגד PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנטי PV מחדש נוגדנים (PV RIVM הקלדה antiserum) על ידי הוספת מים (0.5 מ&quot;ל בכל בקבוקון) כדי בקבוקון אחד של נוגדן אנטי PV (סוג 1, 2 או 3). הוסף פתרונות נוגדן מחדש (0.5 מ&quot;ל כל אחת) כדי מ&quot;ל של 4.5 מ&quot;מ צינורות שכותרתו נפרד. הערה: יש המון נוגדנים נגד PV ניתנים כצורה מחדש (0.5 מ&quot;ל בכל בקבוקון). במשך הרבה כאלה של נוגדנים נגד PV, תוספת של מים הכינון מחדש לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים נפח שווה של נוגדנים נגד PV מחדש. עבור אנטי PV1 2, 2 3, 1 או 3: מיקס 1.8 מ&quot;ל של כל נוגדן מחדש (1.8 מ&quot;ל + 1.8 מ&quot;ל = 3.6 מ&quot;ל של תערובת כל אחת). עבור אנטי PV1 2 3: מיקס 1.2 מ&quot;ל של כל נוגדן מחדש (1.2 מ&quot;ל + 1.2 מ&quot;ל + 1.2 מ&quot;ל = 3.6 מ&quot;ל). הערה: דגימות PV יכול להכיל תערובת של סרוטיפים שונים של PV. כדי לזהות סרוטיפ אחת של PV בדגימות בתערובת של PVS, בריכות נגד PV נוגדנים (כלומר 1 2, 2 3, 3 1, 1 +2 +3) הוא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 5 נפח של FCS (0.72 מ&quot;ל) זה אנטי PV (1 2, 2 3, 3 +1, או 1 +2 +3) נוגדן (3.6 מ&quot;ל כל אחד) (FCS 18.2% הסופי). הערה: תוספת של FCS הוא הפחתה של התלכדות בלתי ספציפיים של החלקיקים ג&#39;לטין הנגרמת על ידי נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את בריכות נוגדן ב -20 ° C עד לשימוש assay הרשות. </li></ol> 3. הכינון של חלקיק ג&#39;לטין רגיש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מ&quot;ל של חיץ הכינון מחדש כלול בערכה על בקבוקון אחד של חלקיק ג&#39;לטין רגיש (כאמור אבקת להקפיא מיובש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב על ידי לחיצה עדינה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את החלקיקים רגיש מחדש ב 4 ° C. החלקיקים ג&#39;לטין מחדש יכול להיות פעיל לפחות 2 שבועות שמר על 4 ° C, אבל צריך להיות מוכן לפני assay. </li></ol> הערה חשובה: אל תערבב הרבה שונים של חלקיקים ג&#39;לטין רגיש, כי התמונה התלכדות של חלקיקים שאינם רגישים ג&#39;לטין יכול להיות שונה על ידי הרבה של החלקיקים. עבור כל ניסוי, הרבה אחת של חלקיק ג&#39;לטין רגיש אמור לשמש. 4. הרשות assay עבור PV זיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת מיקרו טיטרציה. לצורך זיהוי של דגימה אחת וירוס, אנחנו צריכים 5 + בארות אחד לפחות שליטה שלילי (חלקיק רגיש ללא וירוסים נוגדנים, גם # 6 ב להלן. ראה שום שליטה וירוס נוגדנים בדוגמה). סה&quot;כ מספר בארות הוא 5 + x דגימות לפחות שליטה assay. הערה חשובה: נא לקחת לפחות אחד לא לשלוט וירוס הנוגדן assay. בקבוקון אחד של החלקיקים הוא כ רגיש לזיהוי של 10 דגימות נגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב אנטי PV נוגדן או GM לצלחת מיקרו טיטרציה. סידור הצלחת הוא כדלקמן (ראה גם דוגמה בהמשך). בדגימות ללא נוגדנים (טוב # 1 ו - 6), להוסיף 12 μL של GM במקום אנטי PV נוגדן. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב או מנפק יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> ג&#39;נרל מוטורס </td><td> אנטי P1 2 3 </td><td> אנטי P1 2 </td><td> אנטי P2 3 </td><td> ani-P1 3 </td><td> ג&#39;נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 12 μL / היטב מדגם וירוס. במדגם אחד ללא וירוס (טוב # 6), להוסיף 12 μL של GM במקום פתרון וירוס. הערה: מדגם וירוס הוא supernatant התרבות של תאים נגועים, תאים L20B בדרך כלל או תאים RD. הערה חשובה: אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב יהיה מועיל עבור שלב זה. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ובכן # 1 </td><td> ובכן # 2 </td><td> ובכן # 3 </td><td> ובכן # 4 </td><td> ובכן # 5 </td><td> ובכן # 6 </td></tr><tr><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> וירוס מדגם </td><td> ג&#39;נרל מוטורס </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח חלקיק מחדש פתרון רגיש מתוך 4 ° C לטמפרטורת החדר, לטפוח בעדינות לחלוטין להשעות את החלקיקים. הערה חשובה: לאחר השעיה מלאה של החלקיקים על ידי הקשה עדינים, חלקיקים יש להוסיף מיד את הצלחות לפני החלקיקים המרחפים precipitaטה והצורה הלא הומוגנית פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 μL / טוב של חלקיק רגיש לכל הבארות. הערה חשובה: לאחר תוספת של חלקיקים רגישים, הצלחת לאלתר להיות כפופים להם לצלחת ערבוב להתחיל תגובה אחידה של הדגימות. לפיכך, תוספת של חלקיק רגיש צריך להתבצע באמצעות מתקן לצמצם פער הזמן בין דגימות הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על צלחת מיקסר מערבבים את הצלחת למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת מיקרו טיטרציה על נייר לבן (מטעמי נוחות של תצפית ויזואלית) על השולחן בטמפרטורת החדר (15 ~ 30 ° C) עבור 2 ח הערה חשובה: אל תזיז את הצלחת במהלך ואחרי התגובה להסתכלות התוצאות והתמונות לוקח. התלכדות שנוצר אינו יציב מופרעת בקלות על ידי הזזת צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות של הצלחת. הערה חשובה: נוף חלקי של התמונות לא יכול לתת מספיק נתונים לבדיקה ביקורת מאוחר יותר של תוצאות לפרשנות. כמה תמונות יש לנקוט כדי לכסות את כל הבארות של הצלחות התמקדות התמונה התלכדות של בארות. </li></ol> 5. פרשנות של התוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי בארות חיוביים ושליליים. השווה את התלכדות בדגימות עם זה של שליטה וירוס נוגדנים לא (משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין, התלכדות לא) (איור 1 ו - 2). תמונות של התלכדות כי יש להבחין בבירור מן הנגיף לא ולא לשלוט נוגדן (לא התלכדות, שליטה שלילי) יש לשפוט חיובית, ותמונות של התלכדות דומים שליטה שלילי צריך להישפט כמו שלילית. דוגמאות שמראות התלכדות ברורה אך חלקית בלבד יכול להישפט חיובית, אבל שיא כמו &#39;חיובי (התלכדות חלקית) &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי של PV. לפרש את תוצאות המבוססות על בארות חיוביות ושליליות עם אנטי PV הנוגדנים לזהות קפסיד PV. עקרון הפרשנות של התוצאה היא דומה לזו של בדיקת נטרול במערכת תרבית תאים (לדוגמה חיובית עבור נוגדן אנטי-P1 2 עולה כי המדגם מכיל 3 סוג PV). </li></ol> 6. נציג תוצאות התוצאה נציג הרשות assay PV זיהוי מוצג באיור 1. כל זני PV נוצר התלכדות של חלקיקים רגישים ג&#39;לטין (אין נוגדנים דגימות). בנוכחות נוגדנים המתאימים אנטי PV, משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין (התלכדות לא) דומה וירוס לא ולא לשלוט נוגדנים (שליטה שלילי) נצפתה (למשל, PV1 (סבין) בנוכחות אנטי P1 או 2 אנטי P3 1 נוגדנים). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. וירוס פתרונות זיהוי PV ידי assay הרשות. PV1 של (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, ו 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, בהתאמה) שימשו לזיהוי על ידי assay הרשות. אין וירוסים אין שליטה נוגדנים הראתה משקעים של חלקיקים ג&#39;לטין (לא התלכדות, שליטה שלילי). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. פרשנות בארות חיוביים ושליליים. פתרונות וירוס של PV1 (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 2.4 x 10 μL 8 50/25 CCID, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 μL, ו 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 μL, בהתאמה) היו מדוללים 1 / 20 עד 1 / 320, ולאחר מכן 25 μL של דגימות בדילול נבחנו על ידי הרשות assay ללא אנטי PV נוגדנים.

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , (2004).</li><li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus.">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li><li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site.">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li><li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms.">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li><li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells.">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li><li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+receptor+for+poliovirus:+molecular+cloning,+nucleotide+sequence,+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily.">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li><li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion.">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li><li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor.">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li><li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro.">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li><li>Avoort, H. G. v. a. n. d. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses.">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li><li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+group-,+serotype-,+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues.">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li></ol>

Souji Masujima הוא עובד של מוצר חדש מחלקת עיצוב, Fujirebio בע&quot;מ

הנקודה הייחודית של assay זו הרשות היא ניצול של המולקולה PVR במקום אנטי PV נוגדנים לצורך זיהוי של PV 2. זה מאפשר אינטראקציה ספציפית של חלקיקי ג&#39;לטין רגיש עם PV עם זיקה אחיד לכל שלושת קפסיד של PV 3-6. השתמשנו צורה immunoadhesin של PVR (PVR-IgG2a) עבור סנסיטיזציה של חלקיקי ג&#39;לטין, כי צו?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> רגיש, ג&#39;לטין חלקיקים </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> הכינון חיץ </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Microtitration צלחת </td><td> Fujirebio בע&quot;מ </td><td></td><td> מבחן הערכה </td></tr><tr><td> Anti-PV נוגדן </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

particle agglutination method for poliovirus identification

ב גלובל פוליו חיסול היוזמה, אבחנה מעבדה משחק תפקיד קריטי ידי בידוד וזיהוי PV מן דגימות צואה של שיתוק רפה (AFP) במקרים אקוטיים. בארגון הבריאות העולמי (WHO) גלובל פוליו מעבדה רשת, PV בידוד וזיהוי כרגע מתבצע באמצעות תרבית תאים של המערכת בזמן אמת RT-PCR, בהתאמה. בעידן שלאחר מיגור של PV, הליכי זיהוי פשוטה ומהירה יהיה מועיל לאישור מהיר של מקרי פוליו במעבדות הלאומיות. במחקר הנוכחי, אנו נראה את ההליך של assay הרשות חדשנית שפותחה לצורך זיהוי PV. זה assay הרשות מנצל האינטראקציה של מולקולת PV (PVR) הקולטן virion כי הוא זיקה מסוימת ואחידה לכל קפסיד של PV. ההליך הוא פשוט (אחד הליך צעד צלחות תגובה) ומהירה (ניתן להשיג תוצאות בתוך שעות 2 של התגובה), והתוצאה היא נצפתה חזותית (תצפית של התלכדות של חלקיקי ג&#39;לטין).

Watch this Scientific Journal Video about Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification at JoVE.com

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש&quot;פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  National Institute of Infectious Diseases. החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

Video: Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

נוהל 1.5 שעה עבור זיהוי אנטרוקוקוס מינים ישירות מתרבויות דם

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these glycoprotein &#8216;spikes&#8217; is often technically challenging but important for understanding viral pathogenesis and in drug design. Here, a protocol is presented for viral spike structure determination through computational averaging of electron cryo-tomography data. Electron cryo-tomography is a technique in electron microscopy used to derive three-dimensional tomographic volume reconstructions, or tomograms, of pleomorphic biological specimens such as membrane viruses in a near-native, frozen-hydrated state. These tomograms reveal structures of interest in three dimensions, albeit at low resolution. Computational averaging of sub-volumes, or sub-tomograms, is necessary to obtain higher resolution detail of repeating structural motifs, such as viral glycoprotein spikes. A detailed computational approach for aligning and averaging sub-tomograms using the Jsubtomo software package is outlined. This approach enables visualization of the structure of viral glycoprotein spikes to a resolution in the range of 20-40 &#197; and study of the study of higher order spike-to-spike interactions on the virion membrane. Typical results are presented for Bunyamwera virus, an enveloped virus from the family Bunyaviridae. This family is a structurally diverse group of pathogens posing a threat to human and animal health.

An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.

ממוצע של ויראלי מעטפת גליקופרוטאין Spikes מאלקטרוני Cryotomography שחזור באמצעות Jsubtomo

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the &#8216;gold standard&#8217; Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective. 
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Latex agglutination testing is a simple, rapid and inexpensive method for serotyping Streptococcus pneumoniae, and has also been widely applied in diagnostic microbiology. This manuscript describes the in-house production of latex agglutination reagents, quality control procedures and the application of this technique to pneumococcal serotyping.

קופסית Serotyping של<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; על ידי לאטקס התלכדות

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in diameter. In addition to a characterization of forward and sideward scatter properties, it enables the use of fluorescent labeled markers like antibodies to detect respective structures. Using indirect antibody staining, flow cytometry is employed here to quantify birch pollen allergen (precisely Bet v 1)-loaded particles of 0.5 to 10 &#181;m in diameter in inhalable particulate matter (PM10, particle size &#8804;10 &#181;m in diameter). PM10 particles may act as carriers of adsorbed allergens possibly transporting them to the lower respiratory tract, where they could trigger allergic reactions.
So far the allergen content of PM10 has been studied by means of enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) and scanning electron microscopy. ELISA measures the dissolved and not the particle-bound allergen. Compared to scanning electron microscopy, which can visualize allergen-loaded particles, flow cytometry may additionally quantify them. As allergen content of ambient air can deviate from birch pollen count, allergic symptoms might perhaps correlate better with allergen exposure than with pollen count. In conjunction with clinical data, the presented method offers the opportunity to test in future experiments whether allergic reactions to birch pollen antigens are associated with the Bet v 1 allergen content of PM10 particles &#62;0.5 &#181;m.

Here, we present a protocol to quantify allergen-loaded particles by flow cytometry. Ambient particulate matter particles may act as carriers of adsorbed allergens. We show here that flow cytometry, a method widely used to characterize suspended solids &#62;0.5 &#181;m in diameter, can be used to measure these allergen-loaded particles.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...