1. الخلية المضيفة ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 2 × 10 6 - CHO DXB11 الخلايا في خلية T75 كورنينج قارورة الثقافة في 15 مل متوسطة النمو (ميما مع النيوكليوتيدات والنيوكليوسيدات (Gibco ، رقم الكتالوج 12571) تستكمل مع 10 ٪ γ - المشع تتميز مصل بقري جنيني (cFBS) (HyClone ، رقم الكتالوج SH30071.03) و 10. مل / لتر من محلول جلوكوز 45 ٪ (سيغما ، كتالوج عدد G8769)) قبل يوم واحد ترنسفكأيشن </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت ترنسفكأيشن ، وإعداد مجمعات ترنسفكأيشن على النحو التالي : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 8 الحمض النووي في 800 ميكروغرام ميكرولتر من النمو دون المتوسط ​​في أنبوب المصل microcentrifuge العقيمة. المزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 40 ميكرولتر Lipofectamine ™ (Invitrogen 18324012) في 800 ميكرولتر من النمو دون المتوسط ​​في أنبوب المصل البوليسترين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى الحمض النووي تضعف ™ Lipofectamine المخفف. المزيج بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة النمو من الخلايا في T75 واستبدالها مع 6.4 مل من متوسط ​​النمو دون المصل. إضافة 1.6 مل من المجمعات ترنسفكأيشن إلى القارورة. المزيج بلطف هزاز لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 6 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 8 مل من متوسط ​​النمو في قارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسط ​​عن طريق الشفط وإضافة جديدة للنمو متوسطة القارورة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة متوسطة النمو مع التحديد (MEMA دون المتوسطة أو النيوكليوسيدات النيوكليوتيدات (Gibco ، رقم الكتالوج 12561) تستكمل مع 10 ٪ γ - المشع مدال مصل بقري جنيني (dFBS) (HyClone ، رقم الكتالوج SH30079.03) و 10 45 مل / لتر ٪ محلول الجلوكوز (سيغما ، رقم الكتالوج G8769)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 2-3 أسابيع. </li></ol> 2. الاستنساخ الخلوي عن طريق الفرز تدفق خلية المنشط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزاحة الخلايا من القارورة وأجهزة الطرد المركزي في 800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا في المتوسط ​​تستكمل مع اختيار الأبقار مصل الزلال 2 ٪ وfluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان على التخفيف 01:20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الجليد لاحتضان 15-30 دقيقة ثم يغسل ومرتين مع PBS الباردة. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب البولي بروبلين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير لفرز العقيم على ™ FACSAria دينار بحريني. إعداد 96 - جيدا زراعة الخلايا التي تحتوي على 200 لوحة متوسطة اختيار ميكرولتر في كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل جو معقم و مطهر الأنبوب مع الخلايا وتحليل دينار بحريني على FACSAria ™ ، تسجيل النتائج للخلايا الملون وغير ملوثين ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين غيتس والإعدادات لفرز الخلايا واحد من ملف مضان المطلوب في تلطيخ اللوحة جيدا - 96 (ق). <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي أولا بتحليل الخلايا Transfected استنادا إلى الأمام مقابل مبعثر مبعثر الجانب. يرصد بوابة للخلايا الحية على أساس مبعثر إلى الأمام ، والذي يقيس حجم الخلية ، والتشرذم الجانب ، والذي يقيس تعقيد الخلية أو التفاصيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم فحص الخلايا التي تقع ضمن هذه البوابة لتلطيخ PE. يتم تعيين PE بوابة السلبية للخلايا transfected غير ملوثين أو الخلايا المضيفة الملون. كما يتم فحص خلايا transfected ملطخة بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية ، وحددت ثم &quot;السامي PE&quot; بوابة لتشمل أعلى 5 ٪ من كل الخلايا التي هي إيجابية لتلطيخ PE. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحات في 37 حاضنة درجة مئوية لمدة أسبوعين. </li></ol> 3. وثائق من تشكيل مستعمرة من قبل CloneSelect ™ تصوير وثيقة تشكيل مستعمرة في 96 - جيدا على لوحات تصوير CloneSelect ™ في اليوم 0 ، 3 أيام ، يوم 7 ويوم 13 بعد FACS الفرز. فإن وثائق ضمان اختيار صورة من الحيوانات المستنسخة المشتقة من خلية واحدة. خطوة حاسمة في هذه الوثائق هو الحصول على ضبط البؤري بشكل صحيح لقياس 0 يوم ، لأنه ليس هناك خلية واحدة فقط في كل بئر عند تلك النقطة. من المهم جدا أن الصور واحدة من هذه الخلايا هي في التركيز ومحاولة لضبط التركيز عليها يمكن أن تكون مضللة في أحسن الأحوال. يمكن للطائرة تنسيق تتفاوت تفاوتا كبيرا بين أنواع من لوحات وربما حتى من الكثير الكثير من نفس الماركة. وبالتالي طائرة سلفا التنسيق يحتاج إلى استخدامها. ويمكن تحقيق ذلك من خلال التركيز على الخرز والجزئي أو اختبار الخلايا عالية الكثافة المودعة على لوحات الكثير من نفس المستخدمة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام لوحات نمت بشكل كامل من نفسه الكثير لهذا الغرض. FACS بعد الفرز ، من المهم أيضا السماح للخلايا تسوية مدة لا تقل عن 2 ساعة قبل التصوير ، بحيث أنها سوف تكون &quot;ثابتة&quot; في الموقف على لوحة. 4. الفرز والاختيار من الحيوانات المستنسخة مثمرة للغاية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الوثيقة موقف عينة في لوحات تلقي مقايسة 96 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> aliquots نقل 20 ميكرولتر طاف (المخفف إذا لزم الأمر) في 96 - جيدا لوحات فحص من قبل EVO الحرية TECAN ® السائل نظام المناولة. هذا الروبوت مرنة وقادرةوقد تم تكييف جيم منصة لهذه الخلية وغيرها من ثقافة العمل الآلي. تم كتابة برامج خاصة للاستفادة من أفضل وتعزيز قدرات EVO الحرية الروبوتية لتطوير خط الخلية. مثال على ذلك هو تعيين TECAN لتفسير البيانات CloneSelect ™ تصوير لأخذ عينات الآبار مع المستعمرات واحد. وغيرها من البرامج المطلوبة لتنفيذ مهام إضافية مثل زراعة الخلايا لجعل التخفيفات المناسبة للعينات المأخوذة ، وتفسير ، وأنواع لوحات وضعت العينة يدويا إذا لزم الأمر ، من أجل زيادة إنتاج الحيوانات المستنسخة عالية ، وما يمكن أن العديد من هذه البرامج يمكن بسهولة تطبق على 384 لوحات جيدة وكذلك 96 الأصلية تنسيق جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم تحليل إنتاج الأجسام المضادة في عينات من شطيرة الإنسان مفتش الكشف عن ELISA (بيرس ، روكفورد ، ايل) على الحرية EVO TECAN ® السائل نظام المناولة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والعينات القياسية. تم تحميلها (الإنسان المايلوما IgG1 ، كابا) (سيغما ، وسانت لويس ، MO) في مرحلة ما قبل المغلفة بيو معطف مضاد للمفتش الإنسان لوحات الفحص دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، كاليفورنيا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والمحتضنة لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ثم يغسل PBS الثلاثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأضاف ImmunoPure عنزة المضادة للمفتش الإنسان ، (FC - غاما) - HRP (بيرس ، روكفورد ، ايل) على لوحة في التخفيف 1:2000 والمحتضنة لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم غسلها لوحات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني قبل إضافة ABTS الركيزة (بيرس ، روكفورد ، ايل) وتليت على القارئ باستخدام لوحة الامتصاصية في 405 نانومتر للكشف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد استنساخ مثمرة للغاية وتقييم الإنتاجية في الثقافة تعليق. لتتغذى على دفعات والثقافة ، وكان تلقيح الخلايا في 0.3X106 خلايا / مل في البروتين مجانا المتوسطة JRH ADVANTAGE الفوري 65578 (SAFC العلوم البيولوجية ، Lenexa ، KS) تستكمل مع 5 حلامة الصويا ز / لتر (DMV الدولية ، رقم الكتالوج SE50MAF UF - ، والكثير العدد) وحضنت في 37 درجة مئوية مع 7.5 ٪ CO 2. واصلت الثقافة واستكملت مع 2 ز / L الجلوكوز (سيغما ، G8769 عدد التسويقي ، وعدد الكثير 098K2329) عند تركيز الغلوكوز زائد اكتات في الثقافة وصلت إلى أقل من 2 غرام / لتر ، وتغذى 2 مم الجلوتامين (Gibco ، رقم الكتالوج 25030 ، كثيرا رقم 568177) عند مستويات الجلوتامين صلت إلى أقل من 200 ملغم / لتر (الأيضات تقاس Bioanalyzer YSI). أنهيت تغذيها الثقافات دفعة يوم 14 و إنتاج الأجسام المضادة والتي تقاس HPLC عكس المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجينية توصيف استنساخ مرشح مضان التهجين في الموضع (FISH) 5. </li></ol> 5. ممثل النتائج : ويرد مثال على الضد النامية المنتجة للاستنساخ مع أسلوب إنتاجية عالية في الشكل 1 والشكل 2. وكان ملون Transfected تجمع الخلايا مع fluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان (الشكل 1A) ، وتحليلها وفرزها على FACSAria ™ دينار بحريني (1B الشكل). تم تصوير تشكيل مستعمرة في لوحة 96 - جيدا على تصوير CloneSelect ™ (الشكل 1C). وأخذت عينات الخلايا طاف الثقافة من الآبار التي تحتوي على مستعمرة واحدة ويعاير بواسطة ELISA على حرية TECAN نظام ® EVO مناولة السائل (1D الشكل). تم العثور على استنساخ مثمرة للغاية من الخلايا التي أظهرت ارتفاع مستوى الأجسام المضادة السطحية التي تعكسها تلطيخ مع الفلورسنت مفتش مكافحة الإنسان المسمى. عند المقارنة بين الحيوانات المستنسخة ولدت اثنين من سكان تجمع transfected الخلية الأولية ، والفارق الشاسع في الإنتاجية في تغذيتها على دفعات ولوحظ الثقافة (الشكل 2). لاستنساخ اثنين من كبار ولدت من السكان مع ارتفاع سطح الخلية التعبير الأضداد (PE العالي) ، وتراوحت إنتاجية محددة 50-70 جزء من الغرام / خلية / يوم. في حين أن الأجسام المضادة الإنتاجية ~ 20 بيكوغرام / خلية / يوم لاثنين من كبار الحيوانات المستنسخة ولدت من السكان مع انخفاض سطح الخلية التعبير الأضداد (PE منخفض). وعلاوة على ذلك ، والخطوط التي وضعتها خلية FACS الفرز هي أكثر استقرارا فيما يتعلق بالإنتاج الضد من تلك التي تم استنساخها من خلال تخفيف التجيير اليدوية (الشكل 3A). إنتاجية محددة من استنساخ العلوي ، انخفض &quot;استنساخ 1&quot; ، التي تم إنشاؤها بواسطة التخفيف من الجير اليدوي ~ 30 ~ 10 إلى PCD PCD بعد زرع الخلايا لالأضعاف 80. من ناحية أخرى ، فإن subclone الأعلى التي تم إنشاؤها بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والفرز ، &quot;استنساخ 2&quot; ، كان قادرا على الحفاظ على إنتاجية محددة نحو 20 PCD الأضعاف عن الخلية لا يقل عن 100. بواسطة فلوري التهجين في الموضع (FISH) ، أثبتنا استنساخ 1 اظهر كما اختلط فيها النمط الظاهري ألف (85 ٪) و (ب) النمط الظاهري (15 ٪). في المقابل ، FACS فرز استنساخ (استنساخ 2) التي أظهرت أن عدد السكان أكثر تجانسا مع 99.5 ٪ من الخلايا ثبت أن النمط الظاهري A (الشكل 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. التنمية خطوط تصنيع الخلية لإنتاج الاجسام المضادة من خلايا CHO. أ) تلوين سطح الخلية الأولي تجمع transfected مع fluorescently المسمى الأضداد المضادة للمفتش الإنسان. ب) من سكان الخلية الفرز مع كثافة عالية مضان (PE عالية) وكثافة منخفضة مضان (PE منخفض) في لوحة 96 - جيدا. ج) توثيق مستعمرةتشكيل من يوم بذر آخر 0 إلى 13 يوما في تصوير CloneSelect ™. فحص الحيوانات المستنسخة D) عن طريق ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. مستوى سطح الجسم المضاد يرتبط ارتباطا والإنتاجية مع الضد من الخلية. وكانت كل من البلدان المتقدمة مع الحيوانات المستنسخة تلطيخ الفلورية العالية والمنخفضة إلى خطوط الخلية وتقييمها في تغذيها ثقافة الدفعي. وتمت مقارنة عيار الحجمي وإنتاجية محددة بين الحيوانات المستنسخة 2 أعلى كل السكان. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. النسخ الناتجة عن الفرز FACS المعرض التجانس العالي الوراثية واستنساخ الاستقرار. أ) استقرار الانتاج في جسم الثقافة دفعة ل~ الأضعاف الخلية 80 من الوقت ينقضي الثقافة. Δ ، قد ولدت عن طريق استنساخ تخفيف الحد ، حيث كان المصنف الخلايا على 2000 خلية / كذلك ، 1000 خلية / جيد و 500 خلية / أيضا. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="مثلث أسود" /> ، قد ولدت عن طريق استنساخ الخلية FACS في 1 / أيضا. ب) يتم تحديد موقع التحوير التكامل في كروموسوم الخلية CHO بواسطة نيون في الموقع التهجين.

<ol>
	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

كتاب هذه المقالة هي من موظفي شركة ميرك وشركاه ، وشركة ، الذين يستخدمون هذه الطريقة لانتاج على نطاق واسع من العلاجات البروتين من خطوط الخلايا الثديية.

قدمنا ​​خلية التصنيع الآلي الخط الأساسي للتطوير العزلة التي تمكن من استنساخ مثمرة للغاية ، ويعنى في حين ان يضمن قابلية التنسيل استنساخ والاستقرار. إشراك تلوين الأجسام المضادة السطحية تليها فرز FACSAria الخلية ™ هو مفتاح الحصول على الحيوانات المستنسخة واحد مع الضد الإنتاجية العالية. نتائجنا وغيرها من التقارير 2-4 توحي بأن مستوى الأجسام المضادة عرض عابر على سطح الخلية مرتبطة بشكل جيد مع إنتاجية الخلية. وبالتالي ، يمكن استخدام الأجسام المضادة ، مترافق فلوريسئين الاعتراف المنتجات المرتبطة بها والمساعدات غشاء عزل المنتجين عالية. بدلا من ذلك ، وقد استخدمت coexpression الجينات مراسل وهلام microdrop التكنولوجيا لتسهيل اختيار عالية استنساخ بواسطة FACS 6-8. بالإضافة إلى عزل الحيوانات المستنسخة عالية المنتجة عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، تطورت تقنيات أخرى لتحقيق نفس الهدف. وتشمل هذه التكنولوجيا تعريشة CellSpot العلوم البيولوجية التي تستخدم أنظمة الكشف عن الأجسام المضادة microspere وتكنولوجيا الليزر لتحديد الفرز استنساخ مثمرة للغاية والقضاء على الخلايا غير المرغوب فيها ، Genetix ClonePix FL StemCell وتقنيات منصة EasyPick ClonaCell تؤدي سرعة عالية فحص خطوط إنتاج الخلية باستخدام نظام كشف الأجسام المضادة الفلورسنت . اخترنا لتنفيذ أسلوب الاستنساخ FACS على أساس مستوى سطح الجسم المضاد يرتبط لأنه يجمع بين سهولة التشغيل والانتقائية على الإنتاجية وقابلية التنسيل. توظيف الحرية TECAN نظام ® EVO مناولة السائل زيادة كبيرة في إنتاجية الفرز ، والتي توفر الفرصة لاختيار لاستنساخ عالية الغلة من تجمع الخلايا أكبر من ذلك بكثير. أجهزة أخرى لفحص مثل HTRF ، BioForte اللحن الثماني ، HPLC ، الخ ، وجميع الوسائل الممكنة لتحديد وفحص المنتجين عالية من المنتجين منخفضة. من خلال تتبع تشكيل استنساخ مع CloneSelect تصوير ™ ، ولدت لنا الوثائق اللازمة لإثبات قابلية التنسيل رقمية مع خلية خط التاريخ. ويؤكد كذلك قابلية التنسيل التي تميز وراثيا واحد موقع التكامل التحوير على الكروموسوم. وهكذا يمكن خطوة subcloning التي تؤخذ عادة لضمان قابلية التنسيل ، لا يمكن إزالتها. وهذا سيوفر 4-8 أسابيع من الوقت لتطوير خط الخلية. باختصار ، أظهرت نوعية خطوط الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة منصة عالية الإنتاجية الآلي إنتاجية عالية ، والاستقرار وتوثيق تاريخ الإنتاج خط الخلية التي يجب أن تلبي الطلب على الانتاج الواسع النطاق والمتطلبات التنظيمية الحالية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td></tr><tr><td> دينار بحريني FACS الأغنية ™ فارز الخلايا </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ تصوير </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN الحرية ايفو ® نظام مناولة السائل </td><td> Tecan المجموعة </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

الصناعة الصيدلانية البيولوجية التي تنمو بسرعة مطالب التطور السريع لنظم الإنتاج ذات كفاءة عالية وموثوق بها لتلبية الحاجة المتزايدة لإمدادات المخدرات. وقد شمل الجيل خطوط إنتاج الخلية تقليديا العمليات اليدوية التي تتطلب عمالة مكثفة ، وانخفاض الإنتاجية وعرضة لأخطاء بشرية. ونحن هنا التقرير منصة متكاملة عالية الإنتاجية والآلية لتطوير خطوط تصنيع الخلية لإنتاج البروتين المداواة. مزيج من دينار بحريني FACS الأغنية ™ فارز الخلية ، وتصوير CloneSelect ™ TECAN EVO الحرية مكن ® نظام مناولة السائل خط خلية عالية الإنتاجية وأكثر كفاءة عملية التنمية. في هذه العملية ، يتم transfected first إنتاج الخلايا المضيفة مع ناقلات التعبير يحمل الجين المصالح 1 ، تليها العلاج مع وكيل التحديد. هي ملطخة ثم الخلايا ستابلي - transfected مع مضان المسمى مفتش الأضداد المضادة للبشرية ، وتخضع لاحقا لتحليل التدفق الخلوي 2-4. ويتم اختيار الخلايا المنتجة للغاية على أساس كثافة مضان ومعزولة عن طريق وحيدة الخلية الفرز على ™ FACSAria دينار بحريني. تم الكشف عن تشكيل مستعمرة من مرحلة وحيدة الخلية مجهريا واتخذت سلسلة من الصور الرقمية التي فات الوقت CloneSelect ™ تصوير لتوثيق التاريخ خط الخلية. بعد استنساخ واحدة شكلت ، كما تم عرض هذه الحيوانات المستنسخة لزيادة الإنتاجية التي تجرى على ELISA EVO الحرية TECAN ® السائل نظام المناولة. ويمكن فحص 10000 استنساخ لكل دورة عملية الإعداد مع النظام الحالي -- حوالي 2000. وقد استخدم هذا النهج المتكامل لتوليد ارتفاع إنتاج المبيض الهامستر الصيني خطوط الخلية (شو) لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة العلاجية (ماب) ، وكذلك البروتينات الانصهار بهم. مع المعونة من أنواع مختلفة من تحقيقات كشف ، يمكن استخدام أسلوب لتطوير علاجات أخرى أو البروتين يمكن تطبيقها على غيرها من نظم إنتاج المضيف. إلى إجراء مقارنة اليدوية التقليدية ، أظهرت هذه المنصة الآلي مزايا زيادة القدرة بشكل ملحوظ ، قابلية التنسيل مضمونا ، التتبع في التاريخ خط الخلية مع الوثائق الإلكترونية وفرصة أقل بكثير في الخطأ المشغل.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics at JoVE.com

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

ووصف الإنتاجية العالية ، ومنصة الآلي للتصنيع الخلايا تطوير خط لإنتاج البروتين المداواة. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية دينار بحريني فارز الخلايا الأغنية ، وقد أثبتت CloneSelect تصوير والحرية TECAN EVO نظام مناولة السائل زيادة كبيرة في القدرة على معالجة وضع خط الخلية مع خلية تحسين جودة الخط واستنساخ عالية.

ومنصة عالية الإنتاجية الآلي للتنمية في خطوط التصنيع لخلية التداوي البروتين

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

a-high-throughput-automated-platform-for-development-manufacturing

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Views.  Merck & Co., Inc. ووصف الإنتاجية العالية ، ومنصة الآلي للتصنيع الخلايا تطوير خط لإنتاج البروتين المداواة. تنفيذ نظام مراقبة الأصول الميدانية دينار بحريني فارز الخلايا الأغنية ، وقد أثبتت CloneSelect تصوير والحرية TECAN EVO نظام مناولة السائل زيادة كبيرة في القدرة على معالجة وضع خط الخلي...

Video: A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

استعمال قياس المثانة في القوارض الصغيرة: دراسة في Chemosensation المثانة

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

الإنسان الخلية السرطانية الهرموني العصبي خطوط بمثابة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الإنسان علاج ورم الغدد الصم العصبية

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

الأنف التداوي إدارة CNS على الفئران استيقظ

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

الإنتاجية العالية التدفق الخلوي القائم على الفحص لكشف خلية أضداد N-ميثيل مد اسبارتاتي مستقبلات الدوبامين-2 أو مستقبلات في مصل الإنسان

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

الاستجابة للعلاج خارج الحي من الأورام الابتدائية و / أو أسوشيتد الانبثاث لما قبل السريرية والسريرية التنمية من التداوي

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

عالية الإنتاجية توصيف الخلايا الجذعية البالغة المهندسة لتسليم العوامل العلاجية لاستراتيجيات اعصاب

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

تحليل عالي الإنتاجية لبيانات الخرائط البصرية باستخدام الخريطة الكهربائية

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...