البحث للوقاية من العمى؛ Bartly J. Mondino MD، مدير معهد جول شتاين العين، UCLA، وراميرو راميريز سوليس، جاكي الأبيض، وجين Estabel في معهد سانجر، ويلكوم ترست الجينوم الحرم الجامعي. هذا البحث يتفق مع بيان أرفو لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث البصرية.

1. تشريح حادة: قلع العين الماوس في العينات غير المثبتة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزق الجفون لتحسين التعرض والوصول إلى العالم الخلفي (مقلة العين) عن سطح البحر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع forcep خلع الملابس منحني وراء العالم و(تحت) في المدار (محجر العين). وSharptip ماهاجان خلع الملابس forcep هو أداة مخصصة مع نصائح لجعل مدببة هذه الخطوة أسهل (انظر المواد والكواشف الجدول). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق forcep وفهم النسيج الضام المدارية والعصب البصري وراء العالم مع الحرص على تجنب الضغط على العالم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف صعودا ونتف forcep مقلة العين من المدار. والخيط الأبيض مثل الأنسجة هو العصب البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العين في برنامج تلفزيوني. باستخدام إبرة قياس 30-، وجعل ثقب واحد الجرح الخلفي على الفور إلى حوف من إدخال الإبرة 1-2 ملم في مقلة العين. هذا يسمح مثبتات، مثل غلوتارالدهيد، التي لا تستطيع إلا أن اختراق أنسجة العين، لمباشرة ENثالثا العين. قد خلق هذا الجرح ثقب لا يكون ضروريا إذا كان مثبت، مثل بارافورمالدهيد أو الكحول، قادر على نشرها إلى أنسجة العين من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العين على الفور في كامل لتثبيت مثبت الغمر. </li></ol> 2. تشريح حادة: قلع العين التثبيت الماوس نضح التالية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المنحني COLIBRI forcep لعقد جفن بعيدا عن العالم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه تشريح يستكوت منحني مقص بالتوازي مع العالم، في حين تهدف نحو الجزء الخلفي من المدار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع النسيج الضام الذي يحيط الثابتة في العالم السفلي من والجوانب وسطي متفوقة، والجانبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع forcep المنحنية وراء العالم، فهم النسيج الضام دون الضغط على الكرة الأرضية، وسحب إلى الأمام لاستأصل العين. منذ الأنسجة الضامة المدارية هي شديدة من تثبيت نضح، قد قطع إضافية من الأنسجة المدارية يكون من الضروري لاطلاق سراح تماما غلوبه. </li></ol> 3. تثبيت والتغليف يجب شحن الأنسجة الثابتة اتبع الاحتياجات الخاصة بك خدمة البريد بما في ذلك المؤسسات والتسميات المناسبة والتعبئة والتغليف. البروتوكول التالي هو مثال لشحن عينة غير المعدية البيولوجية عند درجة حرارة الغرفة. هذا يتطلب 3 طبقات من التعبئة والتغليف ولكن لا فئة A مادة / B البيولوجية أو تسميات النيتروجين السائل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العين إلى قارورة زجاجية التلألؤ مل 5-3-مع مثبت مل على الأقل، أو المخزن المؤقت بعد التثبيت إذا مثبت قصيرة. اكتب رقم تعقب على غطاء القارورة وختم مع Parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وافق قارورة التلألؤ مكان في عينة بيولوجية حاوية شحن. في معهدنا، على سبيل المثال، تتطلب حاويات وافق ثلاث طبقات: وعاء مختوم التي يتم وضع العينة، طبقة ماصة الأوسط، وطبقة واقية الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحاوية في حزمة فقاعة التفاف ثم إلى التطبيقثبتت فعاليتها حاوية شحن المختبر جنبا إلى جنب مع الوثائق المناسبة. </li></ol> 4. ممثل النتائج لا يمكن أن يؤديها من الفحص النسيجي العينين عن طريق مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك hematoxylin و تلطيخ يوزين، الأنزيمية الكشف التعبير، ونقل المجهر الإلكتروني، والمناعية. بعد تثبيت الانغماس في بارافورمالدهيد 4٪، وجزءا لا يتجزأ من النسيج في البارافين ومقطوع على مشراح. في الإنتاجية العالية phenotyping، نحن نحلل أقسام العصب البصري التلاميذ إلى أن عينة جميع أنواع الأنسجة في العين (الشكل 1). كما تم فحص أجزاء من الأنسجة للتعبير lacZ (الشكل 2)، ونقل المجهر الإلكتروني من العضيات الخلوية (الشكل 3)، والتعبير عن جزيئات محددة مع الأجسام المضادة (الشكل 4). لدينا في النمط الظاهري طريقة الفرز، لم يكن من المهم الحفاظ على التوجه للعين فيما يتعلق الأنف (الموق الإنسي) والزمنية (lateraل لحاظ) الجانبين. هناك على الأقل خياران إذا التوجه العين أمر ضروري. بعد استئصال، وقد طبقنا الكي الضوء على القرنية الزمنية في موقف الساعة الثلاثة مع جهاز الكي المحمولة. الآفة واضحة على الأنسجة و لا تضيع أثناء معالجة مثل الأحبار النسيجية. الجانب السلبي هو أن الأضرار الكي القرنية، والذي قد يكون الحرجة في الأنسجة للفحص. الخيار الآخر يتطلب التشريح الماهرة التي يمكن التعرف على العضلات خارج المقلة الإدراج. تحت stereomicroscope، وتحديد الإدراج العضلة المائلة السفلية ومتفوقة يمثل الجانب السفلي ومتفوقة والعالم. 3 مع أي من الطريقتين اتجاه، من المهم أن تتبع عينة كما عين اليمين أو اليسار. معا، وهذا سوف يسمح الدقيق اتجاه العالم قبل تقطيع. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صور العين الماوس النسيجي بعد عملية الشراء؟<html> ومنزوعة النواة R عن بعد الاستحواذ. عيون الماوس عن طريق تشريح حاد بعد تثبيت نضح مع بارافورمالدهيد 4٪. A. التلميذ البصرية قسم الأعصاب ملطخة hematoxylin و eosin يظهر الحفاظ على جميع الأساسات الأنسجة. ON، العصب البصري. (الأخضر شريط النطاق = 500 ميكرون) B. A مشاهدة أعلى التكبير من شبكية العين العادية يظهر هيكلها الصفحي: RGC، وخلايا الشبكية العقدة؛ IPL، طبقة ضفيري الداخلية؛، INL طبقة داخلية النووية؛ OPL، طبقة ضفيري الخارجي؛ قل، الخارجي طبقة النووي (مبصرة الخلية) (السهم)، ويتم، وقطاعات الداخلية مبصرة (رأس السهم)؛ OS، شرائح مبصرة الخارجي؛ RPE، ظهارة الصباغ الشبكية؛ C، المشيمية. (الأخضر شريط النطاق = 50 ميكرون) C. وبالمقارنة مع شبكية العين العادية، هذه العينة هو أرق بسبب تنكس مبصرة. وقل، هو، وغائبة تماما OS (السهم). (الأخضر شريط النطاق = 50 ميكرون) &quot;بديل =&quot; الشكل 2 &quot;/&gt; ومنزوعة النواة التعبير lacZ الرقم 2. في الفئران المعدلة وراثيا. العيون من قبل تشريح حادة ومنغمسين في 1 حل X-غال ملغ / مل (5 ملي K3Fe (CN) 6، 5 ملي K4Fe (CN) 6، 2 مم MgCl2، 0.02٪ NP40 وdeoxycholate الصوديوم 0.1٪) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. كانت ثابتة في عيون 2٪ غلوتارالدهيد formaldehyde/0.2٪ لمدة 30 دقيقة ومقطوع على مشراح. X-غال المنتج (أزرق) التسميات: A. ظهارة الهدبية، B. ظهارة القرنية، وC. الخلية الشبكية العقدة (RGC) في طبقة الشبكية. INL، طبقة النووي الداخلية؛، قل الخارجي طبقة النووي. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. انتقال الإلكترون المجهري للظهارة الصباغ الشبكية (RPE). بعد تشريح حادة وخلق ثقب الجرح، العيون كانت ثابتة في امتصاص العرق غمر 2.5٪ / 2.5٪ في غلوتارالدهيد الصوديوم 0.1M العازلة الفوسفات. وكانت الشركة السعودية العينينdarily ثابتة في textroxide الأزميوم 1٪، المجففة تدريجيا، وجزءا لا يتجزأ من الراتنج Spurr ل. كان مقطوع في الأنسجة 90 نانومتر وضعت على شبكات النحاس فتحة مغطاة في Formvar وتصويرها باستخدام مجهر الإلكتروني النافذ. صورة مجهرية للمعارض، وقطاعات مبصرة الخارجي للشبكية العصبي الحسي، الأجسام الصباغية (M) داخل الظهارة الصبغية الشبكية، وغشاء بروك. <img src="/files/ftp_upload/3184/3184fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. ومنزوعة النواة من وضع العلامات المناعى الفائق 3-ديسموتاز (الأخضر) في الجسم الزجاجي الماوس. العينين عن طريق تشريح حادة وخضع لتثبيت الانغماس في بارافورمالدهيد 4٪. كانت جزءا لا يتجزأ أنها في البارافين ومقطوع باستخدام مشراح. وحضنت أقسام الأنسجة مع SOD3 الأرنب مصل ضدي بولكلونل المخفف 1:50. تم الكشف عن SOD3 التعبير باستخدام الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L)-اليكسا فلور 488 الأجسام المضادة الثانوية مترافق. ويظهر وسم SOD3 في اليونانEN.

<ol>
	<li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+Mouse+Eye+Phenomics+System.">A high-throughput Mouse Eye Phenomics System.</a> Cold Spring Harbor Laboratories, Mouse Genetics Meeting. , (2010).</li><li>Smith, R. S., John, S. W. M., Nishina, P. M., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In Research Methods For Mutant Mice. , (2002).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Anderson, M. G., Smith, R. S., Hawes, N. L., Zabaleta, A., Chang, B., Wiggs, J. L., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+genes+encoding+melanosomal+proteins+cause+pigmentary+glaucoma+in+DBA/2J+mice.">Mutations in genes encoding melanosomal proteins cause pigmentary glaucoma in DBA/2J mice.</a> Nat. Genet. 30, 81-85 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22-22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384-391384 (2011).</li><li>Pinto, L. H., Vitaterna, M. H., Siepka, S. M., Shimomura, K., Lumayag, S., Baker, M., Fenner, D., Mullins, R. F., Sheffield, V. C., Stone, E. M., Heffron, E., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Results+from+screening+over+9000+mutation-bearing+mice+for+defects+in+the+electroretinogram+and+appearance+of+the+fundus.">Results from screening over 9000 mutation-bearing mice for defects in the electroretinogram and appearance of the fundus.</a> Vision. Res. 44, 3335-3345 (2004).</li><li>Heckenlively, J. R., Winston, J. V., Roderick, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mouse+retinal+degenerations.+I.+Correlation+of+indirect+ophthalmoscopy,+electroretinograms,+and+histology.">Screening for mouse retinal degenerations. I. Correlation of indirect ophthalmoscopy, electroretinograms, and histology.</a> Doc. Ophthalmol. 71, 229-239 (1989).</li><li>Tsang, S. H., Gouras, P., Yamashita, C. K., Kjeldbye, H., Fisher, J., Farber, D. B., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+in+mice+lacking+the+gamma+subunit+of+the+rod+cGMP+phosphodiesterase.">Retinal degeneration in mice lacking the gamma subunit of the rod cGMP phosphodiesterase.</a> Science. 272, 1026-1029 (1996).</li><li>Tsang, S. H., Woodruff, M. L., Jun, L., Mahajan, V., Yamashita, C. K., Pedersen, R., Lin, C. S., Goff, S. P., Rosenberg, T., Larsen, M., Farber, D. B., Nusinowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+carrying+the+H258N+mutation+in+the+gene+encoding+the+beta-subunit+of+phosphodiesterase-6+(PDE6B)+provide+a+model+for+human+congenital+stationary+night+blindness.">Transgenic mice carrying the H258N mutation in the gene encoding the beta-subunit of phosphodiesterase-6 (PDE6B) provide a model for human congenital stationary night blindness.</a> Hum. Mutat. 28, 243-254 (2007).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الفئران المعدلة وراثيا أكثر توجد في المختبرات التي لا تفحص العينين. أسلوبنا الفيديو يوضح بسيطة، طريقة موحدة لنقل المهارات الجراحية عن بعد لتحسين اكتساب الأنسجة من المختبرات مع خبرة قليلة مع العينين. هذه التقنية تساعد في التغلب على الفيديو شرك كبير في الإنتاجية العا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> منحني Forcep خلع الملابس </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> ماهاجان Sharptip خلع الملابس forcep </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E1406 (REF-SP7 64520) </td><td></td></tr><tr><td> منحني مقص يستكوت </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E3321 WH </td><td></td></tr><tr><td> 15 ° BD بيفر المجهرية بليد </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 374881 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22-الجميلة Castroviejo الملقط خياطة </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> E1805 </td><td></td></tr><tr><td> 0،12 COLIBRI ملقط </td><td> STORZ Ophthalmics </td><td> 2/132 </td><td></td></tr><tr><td> 30-قياس الإبرة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 305128 </td><td></td></tr><tr><td> بيولوجية ميلر </td><td> الصياد </td><td> 03-523-4 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> الصياد </td><td> 13-374-10 </td><td></td></tr><tr><td> الزجاج قارورة التلألؤ </td><td> ويتون </td><td> 4500413033 </td><td></td></tr><tr><td> PBS، درجة الحموضة 7.4 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 70011-044 </td><td></td></tr><tr><td> 16٪ لامتصاص العرق </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15700 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5٪ لامتصاص العرق / غلوتارالدهيد 2.5٪ من الصوديوم 0.1M العازلة الفوسفات </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15700 16300 &amp; </td><td> مختلطة في المختبر </td></tr><tr><td> 50٪ غلوتارالدهيد </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 16300 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25٪ Formvar </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 15810 </td><td></td></tr><tr><td> شرطيفي الشبكة فتحة </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> M2010-CR </td><td></td></tr><tr><td> 4٪ الأزميوم رابع أكسيد </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 19140 </td><td></td></tr><tr><td> الأجسام المضادة لمكافحة SOD3 </td><td> Abcam </td><td> Ab21974 </td><td></td></tr><tr><td> الماعز المضادة للأرنب اليكسا فلور 488 </td><td> إينفيتروجن </td><td> A11070 </td><td></td></tr><tr><td> Spurr لتضمين الراتنج </td><td> علوم المجهر الإلكتروني </td><td> 14300 </td><td></td></tr></tbody></table>

mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping

العين الماوس نموذجا هاما لدراسة وراثية للمرض العيون متعدية الإنسان. وقد لخص الأمراض المسببة للعمى في البشر، مثل التنكس البقعي، تنكس مبصرة، والساد، الزرق، والشبكية، واعتلال الشبكية السكري في الفئران المعدلة وراثيا، وقد تم إنشاؤها 1-5 الفئران المعدلة وراثيا ومعظم خروج المغلوب من قبل مختبرات لدراسة طب العيون الأمراض غير، ولكن حفظ الوراثية بين نظم الجهاز تشير إلى أن العديد من نفس الجينات قد تلعب أيضا دورا في تطوير العين والمرض. وبالتالي، فإن هذه الفئران تمثل موردا هاما لاكتشاف الجديد الوراثي، النمط الظاهري الارتباطات في العين. لأن تنتشر هذه الفئران في جميع أنحاء العالم، فإنه من الصعب الحصول على، والحفاظ على، والنمط الظاهري لهم بطريقة فعالة من حيث التكلفة الفعالة. وهكذا، وتقتصر معظم phenotyping العيون عالية الإنتاجية شاشات لبعض المواقع التي تتطلب في الموقع والخبرة لدراسة طب العيون في عيون الفئران الحية. 6-9 وثمة نهج بديل وضعتها مختبرنا هو وسيلة لاكتساب النائية الأنسجة التي يمكن استخدامها في عمليات المسح كبيرة أو صغيرة الحجم من العيون الماوس المعدلة وراثيا. إجراءات موحدة للفيديو المستندة إلى نقل المهارات الجراحية، تثبيت الأنسجة، والشحن تسمح لأي مختبر لجمع العيون كلها من الحيوانات متحولة وإرسالها لphenotyping الجزيئية والمورفولوجية. في هذه المقالة الفيديو، نقدم التقنيات لنقل كل من استأصل وغير المثبتة ونضح عيون الماوس الثابتة لتحاليل phenotyping البعيد.

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping at JoVE.com

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

تقنية تشريح يوضح قلع العين الماوس لتثبيت الأنسجة لأداء phenotyping في شاشات عالية الإنتاجية.

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

mouse-eye-enucleation-for-remote-high-throughput-phenotyping

Research

JoVE Journal

Medicine

20.3K Views.  University of Iowa. تقنية تشريح يوضح قلع العين الماوس لتثبيت الأنسجة لأداء phenotyping في شاشات عالية الإنتاجية.

Video: Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

منهج في النسب الانسحاب من الخلايا القرنية عن طريق متعدد الألوان مراسل الفلورسنت الفئران

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Developmental Biology

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to cis-regulatory elements (CREs), short (&tilde;300-600 bp) stretches of genomic DNA which can lie upstream, downstream, or within the introns of the genes they control. CREs (i.e., enhancers/promoters) typically consist of multiple clustered binding sites for both transcriptional activators and repressors1-3. They serve as logical integrators of transcriptional input giving a unitary output in the form of spatiotemporally precise and quantitatively exact promoter activity. Most studies of mammalian cis-regulation to date have relied on mouse transgenesis as a means of assaying the enhancer function of CREs4-5. This technique is time-consuming, costly and, on account of insertion site effects, largely non-quantitative. On the other hand, quantitative assays for mammalian CRE function have been developed in tissue culture systems (e.g., dual luciferase assays), but the in vivo relevance of these results is often uncertain. 
Electroporation offers an excellent alternative to traditional mouse transgenesis in that it permits both spatiotemporal and quantitative assessment of cis-regulatory activity in living mammalian tissue. This technique has been particularly useful in the analysis of cis-regulation in the central nervous system, especially in the cerebral cortex and the retina6-8. While mouse retinal electroporation, both in vivo and ex vivo, has been developed and extensively described by Matsuda and Cepko6-7,9, we have recently developed a simple approach to quantify the activity of photoreceptor-specific CREs in electroporated mouse retinas10. Given that the amount of DNA that is introduced into the retina by electroporation can vary from experiment to experiment, it is necessary to include a co-electroporated 'loading control' in all experiments. In this respect, the technique is very similar to the dual luciferase assay used to quantify promoter activity in cultured cells. 
When assaying photoreceptor cis-regulatory activity, electroporation is usually performed in newborn mice (postnatal day 0, P0) which is the time of peak rod production11-12. Once retinal cell types become post-mitotic, electroporation is much less efficient. Given the high rate of rod birth in newborn mice and the fact that rods constitute more than 70% of the cells in the adult mouse retina, the majority of cells that are electroporated at P0 are rods. For this reason, rod photoreceptors are the easiest retinal cell type to study via electroporation. The technique we describe here is primarily useful for quantifying the activity of photoreceptor CREs.

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

This protocol describes a simple and inexpensive way to quantify the activity of cis-regulatory elements (i.e., enhancer/promoters) in living mouse retinas via explant electroporation. DNA preparation, retinal dissection, electroporation, retinal explant culture, and post-fixation analysis and quantification are described.

قياس نشاط رابطة الدول المستقلة عناصر التنظيم في الشبكية بواسطة الماوس Electroporation يزدرع

Transcription factors within cellular gene networks control the spatiotemporal pattern and levels of expression of their target genes by binding to ...

Neuroscience

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

بروتوكول لتقييم وقياس أمراض ظهارة الشبكية المصطبغة في نماذج الفئران من التنكس البقعي المرتبط بالعمر

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Genetics

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

عزل الخلايا البطانية الشبكية للجيل التالي

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

التصوير المقطعي التماسك البصري: التصوير الماوس العقدة الشبكية خلايا في فيفو

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

مخصص متعدد الصور المجهر منصة للتصوير الحي من القرنية ماوس وConjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Bioengineering

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

القرار أولتراهيغ الماوس الضوئية التماسك التصوير المقطعي لمساعدة الحقن داخل مقلة العين في أبحاث العلاج الجيني الشبكية

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the different aspects of visual, cross-modal and developmental plasticity along the mammalian visual system1-4.
Here, we demonstrate an elegant and straightforward technique for the removal of one or both eyes in the mouse, which is validated in mice of 20 days old up to adults. Briefly, a disinfected curved forceps is used to clamp the optic nerve behind the eye. Subsequently, circular movements are performed to constrict the optic nerve and remove the eyeball. The advantages of this technique are high reproducibility, minimal to no bleeding, rapid post-operative recovery and a very low learning threshold for the experimenter. Hence, a large amount of animals can be manipulated and processed with minimal amount of effort. The nature of the technique may induce slight damage to the retina during the procedure. This side effect makes this method less suitable as compared to Mahajan et al. (2011)5 if the goal is to collect and analyze retinal tissue. Also, our method is limited to post-eye opening ages (mouse: P10 - 13 onwards) since the eyeball needs to be displaced from the socket without removing the eyelids. The in vivo enucleation technique described in this manuscript has recently been successfully applied with minor modifications in rats and appears useful to study the afferent visual pathway of rodents in general.

A Highly Reproducible and Straightforward Method to Perform In Vivo Ocular Enucleation in the Mouse after Eye Opening

The removal of eyes, also called enucleation, provides a useful strategy to study aspects of visual, cross-modal, and developmental plasticity along the mammalian visual system since it induces irreversible partial (monocular) or complete (binocular) vision loss. Here we describe a highly reproducible and straightforward approach to perform in vivo enucleation.

وهناك طريقة استنساخه للغاية ومباشرة إلى تنفيذ<em&gt; في فيفو</em&gt; قلع العين في الفأر بعد فتح العين

Enucleation or the surgical removal of an eye can generally be considered as a model for nerve deafferentation. It provides a valuable tool to study the ...

Biology

Microdissection of the Rodent Eye

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, to obtain the anterior and posterior eyecups. With this technique, the sub-parts of the eye, including the corneal tissue, neural tissue, retinal pigment epithelial (RPE) tissue, and lens, can be obtained for wholemounts, cryo-sectioning, and/or single-cell suspensions of a specific ocular tissue. The presence of the third eyelid presents unique and significant advantages, as it benefits the maintenance of the orientation of the eye, which is important for understanding eye physiology following any localized intervention or in studies involving ocular analysis relating to the eye&#39;s spatial topography.
In this method, we enucleated the eyeball at the socket along with the third eyelid by carefully and slowly cutting through the extraocular muscles and severing the optic nerve. The eyeball was pierced through the corneal limbus using a microblade.&#160;The incision was used as the point of entry, allowing for cutting along the corneal-scleral junction by inserting micro-scissors through the incision point. Small and continuous cuts along the circumference were made until the cups separated. These could be further dissected by gently peeling the translucent layer of the neural retina using Colibri suturing forceps to obtain the neural retina and RPE layers. Further, three/four equidistant cuts were made from the periphery perpendicularly to the optic center until the optic nerve was reached. This opened the hemispherical cups into a floret shape so that they fell flat and could be easily mounted. This technique has been used in our lab for corneal wholemounts and retinal sections. The presence of the third eyelid delineates the nasal-temporal orientation, which allows for the study of various cell therapy interventions post-transplantation and, thus, the targeted physiological validation vital for visualization and accurate representation in such studies.

This paper presents a protocol for ocular micro-dissection in rodents. The process involves the enucleation of the eyeball along with the nictitating membrane (i.e., the third eyelid). This is then followed by the separation of the posterior and anterior eye cups.

التشريح المجهري لعين القوارض

The ocular micro-dissection of the rodent eye involves the segmentation of the enucleated eyeball with the attached nictitating membrane, or third eyelid, ...