עבודה זו כבר מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור.

1. אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני התגובה תיוג, לטהר וירוס דנגה עם כרית סוכרוז ולהכין את הצורך ריאגנטים וציוד כמפורט בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ביקרבונט טרי 0.2M נתרן חיץ, pH 8.5 (חיץ תיוג), ו 1.5M חיץ hydroxylamine, pH 8.3 (לעצור מגיב), ממש לפני תיוג לסנן לעקר עם מסנני מזרק 0.2μm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל כ 3x10 8 יחידות פלאק ויוצרים (pfu) של מטוהרים וירוס דנגה ב 1ml של תיוג חיץ בתוך שפופרת 2ml. זה יכול להיות scaled עד פרופורציונלי תיוג אצווה של הנגיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש את lyophilized אלקסה פלואוריד 594 (AF594) אסטרים succinimidyl כדי 1mm ב תיוג חיץ מייד לפני התגובה תיוג. Fluorochromes אחרים של פלואוריד אלקסה לצבוע סדרת ניתן להשתמש בהתאם לצרכים של האדם. מזעור החשיפה לאור מכאן ואילך צעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl של צבע 1mm AF594 לנגיף בדילול תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה תיוג לערבב בטמפרטורת החדר 1 שעות בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין בקצרה צינור בצנטריפוגה השולחן ולהוסיף 100μl של מגיב להפסיק לערבב את התגובה תוך ערבוב בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה נוספת בחושך. מערבבים על ידי תנוחות הפוכות עדינות כל 15mins. </li></ol> 2. טיהור אלקסה פלואוריד שכותרתו וירוס דנגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, לאזן את העמודה טיהור עם המאגר של בחירה. בניסוי זה, טור PD-10 הוא equilibrated עם 25ml של חיץ HNE (Hepes 5mm, 150mm NaCl, 0.1mm EDTA), pH 7.4, לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את הנגיף שכותרתו לחלק העליון של הטור להתחיל לאסוף את הזרימה דרך אחת הנגיף שכותרתו נכנס מטריקס. מלאו את העמודה עם חיץ HNE כל פעם את הנגיף שכותרתו חתמה מטריקס. בטל 2.5ml הראשון של זרימה דרך לאסוף את 2ml הבא של שבריר וירוס הנקרא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot ולאחסן מטוהרים AF594 וירוס דנגה שכותרתו ב -80 ° C, הרחק ממקור אור. </li></ol><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי one aliquot ולקבוע את כייל של נגיף הנקרא על ידי assay פלאק לפני השימוש אצווה של וירוס הנקרא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרעים 5x10 4 ל Vero היטב של תאים, שגודלו בינוני M-199 גדילה, בצלחת 4-היטב עם coverslip על החלק התחתון של יום הרבה לפני זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant תרבות היטב להדביק תאים עם ריבוי הזיהום של 1 של הנגיף שכותרתו בנפח 100μl (בדילול מלא בינוני M-199 תחזוקה כנדרש) עבור 10min ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את inoculums ולשטוף coverslips פעמיים 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים paraformalydehyde 3% עבור 30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים 1xPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize התאים עם פתרון permeabilization המכיל saponin 0.1% ו BSA 5% 1xPBS עבור 30mins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חי צנטריפוגה, הבהיר supernatant של 3H5 תרבות נוגדן חד שבטי hybridoma עבור 1 שעות בתא לח, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לשטוף (1xPBS המכיל כלוריד 1mm סידן, מגנזיום כלוריד 1mm saponin 0.1%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם הנוגדנים AF488 IgG נגד העכבר, 1:100 בדילול מלא בתמיסה permeabilization, עבור 45mins בתא לח, מוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips 3 פעמים חיץ לרחוץ ולשטוף במים deionized פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את קצה coverslip נגד מגבת נייר לניקוז המים העודפים על הר להחליק זכוכית עם Dabco 8μl 4-88 Mowiol 2.5% המכיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון הרכבה להגדיר לילה בשעה 4 ° C לפני צפייה באמצעות מיקרוסקופ confocal Zeiss. רכישות רצופות יש לבצע fluorophore מרגש אחד בכל פעם ומיתוג בין גלאי במקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות מנותחים ואז לוקליזציה משותף של חלבון מכתים נוגדנים E בווירוס שכותרתו באמצעות תוכנת LSM Zeiss זן כדי לאמוד את מידת תיוג. </li></ol> 3. נציג תוצאות דוגמה תשואה של וירוס דנגה שכותרתו עם צבע AF594 מוצג באיור 2. בדרך כלל, פחות ירידה של פי 10 מן titer הראשונית צריכה להיות שנצפו בעקבות תיוג מוצלח. עם זאת, יש לציין כי חוצצי כל צריך להיות מוכן טרי תיוג להצליח ואת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl יש להשתמש מיד לאחר הכינון מחדש כפי שהם hydrolyze לחומצות חינם nonreactive תמיסות מימיות 8. בשלב הבא, הווירוס שכותרתו יש להיבדק על הקרינה מספיק לפני השימוש בניסויים. Assay immunofluorescence פשוט נעשה על תאים Vero ומידת תיוג ניתן לאמוד מתוך לוקליזציה המשותפת של הנגיף שכותרתו עם אנטי מכתים E-נוגדן חלבון. לנתקאל התאים נבדקו תמונה confocal טיפוסי מוצגת באיור 3. Co-לוקליזציה ניתוח של תמונות באמצעות התוכנה זן LSM הפגינו חפיפה מקדמי החל 0.65-0.8, טוען כי כ -65 עד 80% של virions תויגו עם הצבע. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig1.jpg" alt="איור 1" /> תכנית איור המתאר את 1.Overall פלואוריד אלקסה תיוג צבען של ההליך וירוס דנגה. ראשית, מאגרים רלוונטיים וירוס דנגה מטוהרים מוכנים. פלואוריד הוא Alexa לצבוע מחדש והוסיף לנגיף דנגה מדולל תיוג חיץ. התגובה היא ונעצר 1 שעה מאוחר יותר עם תוספת של מגיב לעצור. לאחר מכן, הנגיף שכותרתו היא מטוהרים באמצעות עמודה הדרה גודל להסיר צבע חופשי. לבסוף, הווירוס שכותרתו מחדש טיטרציה ידי assay רובד נבדק פלואורסצנטי. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ממוצע מספר virions קיימא (pfu / ml) כפי שנקבע על assay שלט לפני ואחרי תיוג AF594. Aliquot של וירוס דנגה AF594 שכותרתו היא מופשר מחדש טיטרציה ידי assay רובד זה בדרך כלל עולה פחות מ -10 לקפל ירידה מ titer ההתחלה. ברים שגיאה מצביעים סטיית התקן של כפילויות. <img src="/files/ftp_upload/3168/3168fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. Co-לוקליזציה של AF594 תוויות עם E וירוס דנגה חלבונים בתאי Vero. התאים גדל על coverslips יום לפני נדבקו דנגה AF594 שכותרתו על הפנים של 1 במשך 10 דקות על 37 ° C. התאים היו קבועים לאחר מכן ומסומן עם נוגדנים נגד E, בדק עבור colocalization של חלבון ה &#39;(ירוק) AF594 תיוג (אדום). אותות פלורסנט היו דמיינו בהגדלה 63X באמצעות Zeiss LSM 710 מיקרוסקופ confocal. סרגל קנה המידה 10μm. צהוב עולה תחומי colocalization, כפי שמוצג הבלעה.

<ol>
	<li>Olenych, S. G., Claxton, N. S., Ottenberg, G. K. &. a. m. p. ;. a. m. p., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Protein+Color+Palette.">The Fluorescent Protein Color Palette.</a> Current Protocols in Cell Biology. 21.5, 1-34 (2007).</li><li>Panchuk-Voloshina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alexa+dyes,+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright,+photostable+conjugates.">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li><li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+fluorescent+protein+technology.">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+use+of+fluorescent+protein+markers+in+living+cells.">Development and use of fluorescent protein markers in living cells.</a> Science. 300, 87-91 (2003).</li><li>Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+dengue+virus:+implications+for+flavivirus+organization,+maturation,+and+fusion.">Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion.</a> Cell. 108, 717-725 (2002).</li><li>Aguilar, J. S., Roy, D., Ghazal, P., Wagner, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+blocks+herpes+simplex+virus-1+productive+infection+in+vitro+acting+at+different+stages+with+positive+cooperativity.+Application+of+micro-array+analysis.">Dimethyl sulfoxide blocks herpes simplex virus-1 productive infection in vitro acting at different stages with positive cooperativity. Application of micro-array analysis.</a> BMC Infect Dis. 2, 9-9 (2002).</li><li>Zhang, S. L., Tan, H. C., Hanson, B. J., Ooi, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+Alexa+Fluor+dye+labelling+of+dengue+virus.">A simple method for Alexa Fluor dye labelling of dengue virus.</a> J Virol Methods. 167, 172-177 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Alexa Fluor Succinimidyl Esters (Molecular Probes. , (2009).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+proteins+stained+by+Alexa+dyes.">Analysis of proteins stained by Alexa dyes.</a> Electrophoresis. 25, 779-784 (2004).</li><li>Freistadt, M. S., Eberle, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+poliovirus+for+flow+cytometric+cell+surface+binding+studies.">Fluorescent poliovirus for flow cytometric cell surface binding studies.</a> J Virol Methods. 134, 1-7 (2006).</li></ol>

למרות AF594 לצבוע שימש בדוח זה, מגוון רחב של fluorophores בסדרת פלואוריד אלקסה אסטרים succinimidyl זמין כימיה עם תיוג דומה. זה יכול להרחיב את היישום תיוג מעבר הדמיה. Cytometry זרימת יכול לשמש כחלופה מיקרוסקופיה confocal להערכת מידת תיוג עבור fluorophores שניתן נרגש זוהה על ידי מכונת FACS. <p class="jove...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> סודיום ביקרבונט </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> Hydroxylamine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 159417 </td><td></td></tr><tr><td> סודיום הידרוקסיד </td><td> מרק </td><td> 106498 </td><td></td></tr><tr><td> AF594 אסטרים succinimidyl </td><td> בדיקות מולקולריות, Invitrogen </td><td> A20004 </td><td></td></tr><tr><td> PD-10 טור </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0851-01 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> H6147 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S3014 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> M-199 </td><td> Invitrogen </td><td> 11150 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> 4 גם צלחת </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> Einst </td><td> 0111520 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרוסקופ שקופיות </td><td> מפרש מותג </td><td> 7105 </td><td></td></tr><tr><td> 3H5 hybridoma </td><td> ATCC </td><td> HB46 </td><td></td></tr><tr><td> 10x PBS </td><td> 1 מאגר </td><td> Buf-2040-10X1L </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S4521 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A7906 </td><td></td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> סידן כלוריד </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C3306 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehye </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 15,812-7 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4-88 </td><td> Calbiochem </td><td> 475904 </td><td></td></tr><tr><td> Dabco </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> D27802 </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop צנטריפוגות </td><td> Eppendorf </td><td> 5424 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Zeiss </td><td> LSM 710 </td><td></td></tr></tbody></table> כדי להכין את ה-M-199 בינוני צמיחה, להוסיף 50 מ&quot;ל של FBS, 5 מ&quot;ל של pyruvate נתרן של 5 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו 500ml של M-199, סינון סטרילי. כדי להכין את ה-M-199 בינוני תחזוקה, להוסיף 15 מ&quot;ל של FBS, 5 מ&quot;ל של pyruvate נתרן של 5 מ&quot;ל שאינם חיוניים חומצות אמינו 500ml של M-199, סינון סטרילי.

visualizing dengue virus through alexa fluor labeling

האירועים בתחילת האינטראקציה בין הנגיף לתא יכולה להיות השפעה רבה על התוצאה של זיהום. קביעת הגורמים המשפיעים על האינטראקציה הזאת יכולה להוביל להבנה משופרת של הפתוגנזה במחלה ובכך להשפיע על החיסון או עיצוב טיפולית. לפיכך, פיתוח של שיטות בדיקה זו אינטראקציה יהיה שימושי. הפיתוחים האחרונים fluorophores בפיתוח טכנולוגיית הדמיה 1-3 ו 4 ניתן לנצל כדי לשפר את הידע הנוכחי שלנו על הפתוגנזה דנגה, ובכך לסלול את הדרך כדי להפחית את מיליוני זיהומים דנגה המתרחשים מדי שנה. וירוס דנגה אפוף יש פיגום חיצונית המורכבת 90 גליקופרוטאין המעטפה (E) הדימרים להגן על הקליפה nucleocapsid, אשר מכיל גדיל RNA חיובי יחיד בגנום 5. יחידות משנה החלבון זהה על פני הווירוס ולכן יכול להיות מתויג עם צבע תגובתי אמין ו דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescent. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה של ​​תיוג של וירוס דנגה עם אלקסה פלואוריד succinimidyl אסתר צבע מומס ישירות חיץ סודיום ביקרבונט שהניבו וירוס קיימא מאוד לאחר תיוג. אין הליך סטנדרטי עבור תיוג של נגיף חי פרוטוקול היצרן הקיימים תיוג חלבון בדרך כלל דורש את הכינון מחדש של צבע בתוך sulfoxide דימתיל. הנוכחות של sulfoxide דימתיל, אפילו בכמויות מזעריות, יכול לחסום זיהום פרודוקטיבי של הנגיף וגם לגרום cytotoxicity תא 6. הדרה של השימוש sulfoxide דימתיל בפרוטוקול זה ובכך לצמצם את האפשרות הזאת. אלקסה צבעים פלואוריד יש photostability מעולה פחות pH רגיש יותר צבעים נפוצים, כגון והעמסת ו rhodamine 2, מה שהופך אותם אידיאליים עבור מחקרים על ספיגת הסלולר תחבורה endosomal של הנגיף. נטיה של אלקסה פלואוריד לצבוע לא השפיע על זיהוי של וירוס דנגה שכותרתו ידי נוגדן וירוסים ספציפיים קולטנים המשוערת שלה בתאים לארח 7. שיטה זו יכולה להיות יישומים שימושיים במחקרים virological.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling at JoVE.com

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של ​​אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

visualizing-dengue-virus-through-alexa-fluor-labeling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.7K Views.  DSO National Laboratories. ניצול של התקדמות בפיתוח fluorophore ואת טכנולוגיית הדמיה, שיטה פשוטה של ​​אלקסה פלואוריד תיוג של וירוס דנגה תוכננה כדי לחזות את האינטראקציות המוקדמות בין וירוס לתא.

Video: Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

הערכת היעילות והרעילות של RNAs מיקוד ייצור HIV-1 לשימוש ב ג&#39;ין או טיפול תרופתי

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

הצלה אפיון של וירוס רקומביננטי מעולם חדש Zika וירוס זיהום מזוהם

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

להמחיש מלכודות חוץ-תאי מקרופאג באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

Cytometry זרימה פשוטים מבוסס Assay כדי לקבוע במבחנה נוגדן התלויים שיפור של וירוס דנגה באמצעות נסיוב הבראה Zika וירוס

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

חילוץ מהיר, בטוח, ופשוט ידנית המיטה חומצת גרעין איתור וירוס בדגימות דם מלא

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

מדידת דנגה נגיף RNA תגובת שיקוע התרבות של תאים נגועים על ידי תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

A Murine Model of Dengue Virus-induced Acute Viral Encephalitis-like Disease

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is characterized by lethal complications due to plasma leakage, ascites, pleural effusion, respiratory distress, severe bleeding, and organ impairment. A few cases of DENV infection present neurological manifestations; however, studies have not explored DENV-induced neuropathogenesis further. In this study, we present a protocol to use an immunocompetent outbred ICR (Institute of Cancer Research) mouse for investigating the induction of central nervous system (CNS) infection with DENV, followed by the progression of acute viral encephalitis-like disease.

Here, we present a protocol for creating an immunocompetent ICR (Institute of Cancer Research) murine model of central nervous system infection to display the development of neuropathy. Monitoring acute viral encephalitic disorders by identical disease scores could be performed for showing dengue virus-induced neuropathy in vivo.

מודל Murine של וירוס דנגה-הנגרמת חריפה דלקת קרום המוח-כמו מחלה

Dengue virus (DENV), an arthropod-borne virus transmitted by mosquitoes, may cause the severe disease known as dengue hemorrhagic fever, which is ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

בדיקת מחוץ גופית מבחן להערכת כלבת חיסון עוצמת

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...