الكتاب أود أن أشكر فريق الخدمات الإبداعية في جامعة ميسوري مركز الدعم الأكاديمي الذي أنتج هذا الفيديو. وأيد هذا العمل من قبل كينيدي شرايفر يونيس المعهد الوطني للصحة والتنمية البشرية للأطفال من المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة عدد HD055231

1. تشريح المشيمة الماوس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أزواج التزاوج من الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل من الأيام التالية، تحقق من وجود المكونات copulatory. ويعتبر اليوم الذي تم الكشف عن المكونات 0،5 يوما بعد الجماع (DPC) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن جمع مشيمة المطلوب في المرحلة من الحمل، مع تشريح نظيفة من بداية المشيمة ممكن مع تطور المشيمة ناضجة على 10.5 د. هنا، علينا أن نبرهن 14،5 DPC. في وحدات التخزين معينة، سوف 40-60 مشيمة على DPC 10.5، و 10-20 مشيمة على 14،5 DPC تسفر عن الخلية الأرومة الغاذية واضحة للعيان طبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس الحوامل، وإزالة الرحم، وقطع في عنق الرحم، وعلى طول مسراق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص حاد، وقطع بين كل الحمل المستكن (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اثنين من أزواج من ملقط، فهم جدار الرحم عند حافة قطع، ومزق، وإزالة عضل الرحم (1B الشكل)<html> . ويوصى احدة مسننة الزوج، ملقط غرامة معتدلة (منحني أو مستقيم)، بالإضافة إلى زوج واحد ملقط دقيق جدا (# 5، على سبيل المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقابل المشيمة، فتح الساقط مع ملقط أو مقص، وتعريض المشيمة. استيعاب الأنسجة الرحم مع الزوج ملقط واحد، حرك آخر ملقط تحت المشيمة لفصل (الشكل 1C). إذا لزم الأمر، الجنين والأغشية الجنينية منفصلة من المشيمة. ليس من الممكن لإزالة جميع الأنسجة ساقطي من دون أن تفقد أيضا تشريح أنسجة المشيمة، ولكن يمكن إزالة الأنسجة ساقطي إضافية (شاحب) من سطح المشيمة عن طريق تقشير بلطف مع ملقط. وسوف نعتمد على التدرج Percoll نحو المزيد من التنقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل المشيمة تشريح في 25 مل العازلة الجليد الباردة التفكك في أنبوب مخروطي 50 مل حتى جميع تشريح كاملة. في مراحل لاحقة، المفروم خشنا أنسجة المشيمة مع مقص أو شفرة حلاقة قبل نقل إلى المخزن المؤقت التفكك. </li></ol>TLE &quot;2&gt;. عزل خلايا الأرومة الغاذية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب فضفاضة غطاء مخروطي الشكل والمكان في حمام 37 درجة مئوية لمدة 45-60 دقيقة. مزيج الحل تفارق بقوة من قبل pipetting تقريبا كل 10 دقيقة. وينبغي رصد الوقت الهضم الكلي عن كثب وسوف يتطلب على الأرجح بعض التجربة والخطأ لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش الخلية. يجب أن تكون قادرة على الأنسجة تمريرها من خلال الماصة 10 مل، ولكن قطع صغيرة مرئية من الأنسجة ستبقى. سوف يؤدي إلى بقاء Overdigestion خلية الفقراء وكفاءة الطلاء. سوف الأمثل بقاء الخلية وكفاءة الطلاء تحدث عندما كتل من بضع خلايا في وجود، وليس عندما يتحقق التفكك الكامل. وعلى العكس، سوف يؤدي إلى نقاء underdigestion خفض percoll بعد الانفصال. عندما تم الوصول إلى نقطة هضم السليم، أنبوب مكان على الجليد لوقف النشاط كولاجيناز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير الحل من خلال مصفاة الخلية لإزالة المواد غير مهضوم، وأجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل وإزالةطاف و resuspend الخلايا في 10 مل محلول الغسيل. أجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال الطرد المركزي، وإعداد حل percoll عن طريق خلط 9،6 مل percoll و 13.4 مل حل غسيل و 1.1 مل 10X المتوسطة 199 في أنبوب 50 مل مناسبة للالطرد المركزي بسرعة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف بيليه و resuspend خلية في 2 مل حل غسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى خلايا percoll حل وأجهزة الطرد المركزي 30000 XG @ لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أنبوب الطرد المركزي من دون إزعاج التدرج. لتصور أنبوب التدرج المكان، أمام مصدر الضوء الساطع. تحديد موقع الفرقة الأرومة الغاذية (الشكل 2)، ونضح مع الماصة، مع الحرص على عدم تعكير صفو خلايا الدم الحمراء الفرقة أدناه. وحجم الفرقة الأرومة الغاذية تكون 5-8 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل خلايا الأرومة الغاذية إلى أنبوب 50 مل المخروطية. إضافة إلى غسل حل إجمالي حجم 45ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي @ 500 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، و resuspend في ميدي الثقافةأم (NCTC-135). يمكن تربيتها الخلايا على طبقة رقيقة من البلاستيك أو الأنسجة matrigel الثقافة في 37 ° C و 5٪ CO 2. في اليوم 10.5، كل المشيمة ينتج ما يقرب من 50000 الخلايا الحية، التي من 80-90٪ وcytokeratin إيجابية. </li></ol> 3. الأرومة الغاذية الغزو الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1-2 مل مستنبت (NCTC-135) لكل غرفة matrigel واحتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 ل30-90 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة، وإضافة 1.5 مل × 10 5 خلايا معزولة حديثا في وسط 2ml إلى مجلس الشيوخ. إضافة 1 مل المتوسطة لمجلس النواب لتغطية السطح السفلي الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في إدراج ل18-24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكشط خلايا matrigel من إدراج باستخدام مسحة الرغوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف أعلى وأسفل للغرفة PBS مل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح لمدة 5 دقائق في بارافورمالدهيد مل 1 4٪ في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار عن طريق ملء النواب مع 400 ميكرولتر دابي (300nM) واحتضان لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني. </li><lيمكنني إزالة&gt; الأغشية من إدراج شفرة مشرط مع حادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​تركيب (الجلسرين 50٪ في برنامج تلفزيوني) إلى الشريحة. باستخدام ملقط، وضع غشاء على انخفاض. إضافة آخر قطرة 10 ميكرولتر من المتوسط، ثم ساترة بعناية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة والعد الخلايا. تأكد من غشاء مناسب المشرق (الخلايا أو الخلية الجانب الأعلى إلى أسفل الجانب) لمجهر المستخدمة. الصورة J البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة) يتضمن ميزة العد اليدوي التي يمكن استخدامها لهذا الغرض، كما يمكن أدوبي فوتوشوب أو عداد اليدوي. </li></ol> 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تشريح المشيمة الماوس. (أ) يتم إزالة الرحم عن طريق قطع على طول ناقلة البيضات (الصفراء)، وعلى طول سطح mesometrial، وعلى عنق الرحم (الجزء السفلي). ويمكن بعد ذلك conceptuses الفردية يمكن فصلها عن طريق قطع مع مقص كما هو موضح. (ب) الرحم<html> تتم إزالة الجدار بوضع اثنين في ملقط قطع سطح الرحم، وتمزق على طول الجانب مكافحة mesometrial، بالقرب من الجنين والمشيمة بعيدا عن. (ج) يتم عزل ثم المشيمة من استيعاب ملقط مع انزلاق وآخر بين المشيمة والأنسجة الرحم. ويمكن بعد ذلك الحبل السري والأغشية خارج الجنين لا يمكن فصلها عن غيرها من المشيمة. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الفصل Percoll الرقم 2. من الخلايا الأرومة الغاذية. بعد الطرد المركزي، وثلاثة نطاقات رئيسية تكون مرئية كما هو مبين في الرسوم المتحركة في اليسار، وصورة على اليمين. الشريط العلوي يحتوي على الحطام الخلوية والخلايا الليفية، وسوف تكون أكثر وضوحا. وهناك ضيق (الحمراء) الفرقة بالقرب من أسفل تحتوي خلايا الدم الحمراء تكون مرئية فقط تحت الأرومة الغاذية الفرقة منتشر. سوف ينظر المرجح المجاميع خلية في النطاق الأرومة الغاذية، كما في جهازي المبينة فقط إلى يسار السهم في الصورة. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> والشكل 3. خلايا الأرومة الغاذية الغازية (السهم الأبيض) تمر من خلال طبقة matrigel والمسام الغشاء، والتي تظهر على السطح السفلي من الغشاء. المسامات هي أيضا مرئية (أسود رأس السهم). قد تحسب عدد الخلايا على سطح الغشاء بأكمله أو منطقة عينة تمثيلية. وقد عكس صورة الرمادي من تلطيخ دابي الفلورسنت النووية لتحسين التصور من الخلايا. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> ويمكن تحديد خلايا الأرومة الغاذية الشكل 4.، ونقاء من السكان معزولة المقررة، من قبل المناعية للcytokeratin 7 (مركز والأرجواني). وcounterstained الخلايا مع دابي (أعلى والأزرق). الصورة المدمجة، أسفل.

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

في هذا الفيديو، ونحن تثبت عزل خلايا الأرومة الغاذية من المشيمة الماوس. ثم نعرض لفحص المختبر في الأرومة الغاذية للغزو. باستخدام هذا الإجراء، وإلى حد كبير، ولكن ليس تماما، يمكن الحصول على السكان نقية من خلايا الأرومة الغاذية. إذا كان مطلوبا المزيد من النقاء، يمكن أن يؤ...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

المشيمة هي المسؤولة عن نقل الغازات، والمغذيات وعوامل النمو على الجنين، وكذلك القضاء على النفايات. وهكذا، عيوب في التنمية المشيمة لها آثار هامة على الجنين والأم، وهي سبب رئيسي من الفتك الجنينية. نوع من الخلايا الرئيسية للجزء من المشيمة الجنين هو الأرومة الغاذية. الأولية خلايا فأر الأرومة الغاذية المشيمة هي أداة مفيدة لدراسة التنمية المشيمة طبيعية وغير طبيعية، وعلى عكس خطوط الخلايا، قد تكون معزولة وتستخدم لدراسة الأرومة الغاذية في مراحل معينة من الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الثقافات الأولية من الأرومة الغاذية من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة دور جينات معينة في خلايا المشيمة. ويستند بروتوكول المعروضة هنا على وصف من قبل Thordarson وآخرون. 1، والذي يستخدم في الانحدار percoll للحصول على الخلايا الأرومة الغاذية نقي نسبيا من السكان مشيمة الماوس معزولة. وهو يشبه إلى استخدام أكثر على نطاق واسعد طرق الإنسان الأرومة الغاذية الخلية 2-3 العزلة. يمكن تقييم النقاء من تلطيخ immunocytochemical للخلايا معزولة عن cytokeratin 7 4. هنا، ثم يتم تحليل الخلايا المعزولة باستخدام مقايسة الغزو matrigel لتقييم الغزو الأرومة الغاذية في المختبر 5-6. ويتم تحليل الخلايا التي غزتها كيمياء سيتولوجية مناعية والملون لفرز الأصوات.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

في هذا البروتوكول، ونحن تصف تشريح المشيمة من الماوس على الحمل d10.5، تليها عزل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام التدرج Percoll. علينا أن نبرهن ثم استخدام الخلايا المعزولة في مقايسة الغزو matrigel.

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

23.5K Views.  University of Missouri. في هذا البروتوكول، ونحن تصف تشريح المشيمة من الماوس على الحمل d10.5، تليها عزل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام التدرج Percoll. علينا أن نبرهن ثم استخدام الخلايا المعزولة في مقايسة الغزو matrigel.

Video: Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

قوية FISH DNA 3D استخدام مجسات إعتبر مباشرة

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

عزل Myofibroblasts الابتدائية من ماوس والأنسجة البشرية القولون

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

تحليل الجريان خارج الخلية عزل وتوصيف وإنتاجية عالية للماوس الأساسي كلوي أنبوبي الخلايا الظهارية

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

مجموعة خلايا واحدة من الخلايا الأرومية الترونفوبلاست في مرحلة زرع الأجنة البشرية

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...