המחברים מבקשים להודות לצוות השירותים יצירתיים באוניברסיטת מרכז תמיכה האקדמית מיזורי שהפיק בסרטון זה. עבודה זו נתמכה על ידי יוניס קנדי ​​שרייבר המכון הלאומי לבריאות והתפתחות ילד האנושית של המכונים הלאומיים לבריאות, מספר מענק HD055231

1. נתיחה של עכבר השליה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת זוגות הזדווגות של עכברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל אחד מהימים הבאים, לבדוק את קיומו של תקע הזדווגות. היום שבו תקע מזוהה נחשב 0.5 ימים לאחר זק (DPC) 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליות ניתן לגבות בשלב הרצוי של הריון, עם נתיחה נקיה של התחילה האפשרית השליה עם ההתפתחות של השליה הבוגרת בד 10.5. הנה, אנחנו מדגימים 14.5 DPC. בכרכים שניתנו, 40-60 שליות על 10.5 DPC, ו10-20 שליות על 14.5 DPC תנבנה שכבת תא trophoblast נראית בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר בהריון, ולהוציא את הרחם, חיתוך בצוואר הרחם, ולאורך mesometrium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים חדים, לחתוך בין כל conceptus (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשני זוגות של מלקחיים, לתפוס את דופן הרחם בקצה החתך, ומושך לגזרים, הסרת myometrium (האיור 1B)<html> . זוג אחד משונן, מלקחיים עדינים מתון (מעוגל או ישר) וזוג אחד מלקחיים עדינים מאוד (# 5, לדוגמה) מומלצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפך השליה, פתח decidua עם מלקחיים או מספריים, חושף שליה. אחיזת רקמת רחם עם זוג אחד מלקחיים, עוד שקופית מלקחיים מתחת לשליה להפריד (התרשים 1C). אם עובר צורך נפרד וקרומים עובריים משלייה. לא ניתן להסיר את כל רקמת decidual ידי נתיחה מבלי שאבד אף רקמת שליה, אבל רקמת decidual נוספת (חיוור) ניתן להסיר מפני השטח של השליה על ידי קילוף בעדינות עם מלקחיים. אנו נסתמך על שיפוע Percoll לטיהור נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם כל שליה גזורה בחיץ 25 מיליליטר קרח קר דיסוציאציה בצינור חרוטים 50 מ&quot;ל עד שכל הניתוחים הושלמו. בשלבים מאוחר יותר, גס לרכך רקמת שליה עם מספריים או סכין גילוח ולפני ההעברה לחיץ דיסוציאציה. </li></ol>&quot;&gt; 2. בידוד TLE של תאי trophoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רופף צינור כובע חרוטים ומקום באמבטית 37 ° C עבור 45-60 דקות. מערבב את פתרון דיסוציאציה נמרצות על ידי pipetting בערך כל 10 דקות. זמן העיכול הכולל צריך להיות תחת פיקוח הדוק וכפי הנראה ידרוש קצת ניסוי וטעייה על מנת להשיג התאוששות תא אופטימלית. רקמות אמורות להיות מסוגלות לעבור דרך pipet מ&quot;ל 10, אך חלקים גלויים של רקמה יישארו. Overdigestion יגרום הישרדות תא מסכנת ויעילות ציפוי. הישרדות תא אופטימלית ויעילות ציפוי תתרחשנה כאשר גושים של כמה תאים הם הווה, ולא כאשר הניתוק מוחלט מושג. לעומת זאת, underdigestion יוביל לטוהר מופחת בעקבות פרידת percoll. כאשר נקודת העיכול התקינה כבר הגיעה, צינור מקום בקרח כדי להפסיק את פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הפתרון דרך מסננת תא כדי להסיר חומרים לא מעוכלים, וחובצה @ 500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף, להסירתאי supernatant ו resuspend בפתרון 10 מ&quot;ל לשטוף. צנטריפוגה @ 500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך צנטריפוגה, להכין תמיסת percoll ידי ערבוב 9.6 המ&quot;ל percoll, פתרון 13.4 מ&quot;ל לשטוף ובינוני 1.1 מ&quot;ל 10x 199 בצינור מ&quot;ל 50 מתאים לצנטריפוגה במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת תאי supernatant ו resuspend גלולה בפתרון 2 מ&quot;ל לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לתאי percoll פתרון וסרכזת @ 30000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מצינור צנטריפוגה ללא מפריע את השיפוע. כדי להמחיש את השיפוע, צינור המקום מול מקור אור בהיר. אתר להקת trophoblast (איור 2), ולשאוב עם pipet, נזהר שלא להפריע ללהקת תאי הדם האדומה בהמשך. נפח של להקת trophoblast יהיה 5-8 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאי trophoblast לצינור 50 מיליליטר חרוטים. הוסף לשטוף פתרון להיקף כולל של 45ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה @ 500 XG במשך 5 דקות. הסרת supernatant, resuspend ובתרבות Mediאממ (NCTC-135). תאים יכולים להיות מתורבתים בmatrigel שכבה דקה או פלסטיק תרביות רקמה על 37 המעלות צלזיוס ו 5% CO 2. ביום 10.5, כל שליה מניבה כ 50,000 תאים חיים, מתוכם 80-90% הם cytokeratin חיוביים. </li></ol> 3. Assay הפלישה Trophoblast <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיום תרבות מ&quot;ל 1-2 (NCTC-135) לכל תא ולדגור matrigel על 37 מעלות, CO 2% 5 עבור 30-90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני, ומוסיף 1.5 מ&quot;ל x 10 5 תאים מבודדים טרי במדיום 2ml לבית העליון. הוסף 1 מ&quot;ל בינוני לחדר תחתון כדי לכסות את פני שטח קרום תחתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תרבות במוסיפה ל18-24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לגרד וmatrigel מלהוסיף באמצעות קיסם קצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החלק העליון והתחתון של החדר ב2 המ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן למשך 5 דקות במ&quot;ל paraformaldehyde 1 4% ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם על ידי מילוי החלל נמוך עם 400 DAPI μl (300nM) ו דגירה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים לזמן קצר בערוץ המדע. </li><li&gt; הסרת קרומים ממוסיף עם להב אזמל חד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף טיפת μl 10 של מדיום הרכבה (גליצרול 50% ב PBS) להחליק. באמצעות מלקחיים, שכב על קרום טיפה. הוסף עוד טיפת μl 10 של מדיום, אז coverslip בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לצלם ולספור. הקפד למקם את הקרום כראוי (עד תא בצד תא או בצד למטה) למיקרוסקופ בשימוש. תמונת J תוכנה (המכונים הלאומיים לבריאות) כוללת תכונת ספירה ידנית שניתן להשתמש בו למטרה זו, כפי שניתן Adobe Photoshop או דלפק ידני. </li></ol> 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1. Dissection של שלית העכבר. () הרחם הוסר על ידי חיתוך לאורך oviducts (צהוב), על פני שטח mesometrial, ובצוואר הרחם (למטה). conceptuses בודד אז יכול להיות מופרד על ידי חיתוך במספריים כפי שמוצג. (ב) הרחם<html> הקיר הוסר על ידי צבת שני מלקחיים במשטח רחם החתך, וקרע בצד אנטי mesometrial, סמוך לעובר ומן השליה. (ג) השליה אז בודד על ידי אחיזה עם מלקחיים והחלקה נוספת בין השלייה ורקמות רחם. חבל טבור וקרומי extraembryonic אחרים אז ניתן להפריד את השליה. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הפרדת Percoll של תאי trophoblast. לאחר צנטריפוגה, שלוש להקות עיקריות תהיינה גלויות כפי שמוצג בסרט מצויר בצד שמאל, ותמונה בצד ימין. הרצועה העליונה מכילה פסולת וfibroblasts סלולרי ויהיה ברור ביותר. רצועה הדוקה (אדום) הקרוב לתחתית המכילה תאי דם אדומים תהיה גלויה ממש מתחת ללהקת trophoblast המפוזרת. אגרגטים סלולריים יהיו סביר ראו בלהקת trophoblast, כמו בשניים שמוצגים רק בצד השמאל של החץ בתמונה. ove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תאי trophoblast פולשים (חץ לבן) יעבור דרך שכבת matrigel ואת הנקבוביות בממברנה, המופיע על פני השטח התחתונים של הקרום. הנקבובי הם גם גלויים (ראש החץ שחור). מספר התאים על פני הקרום או כל אזור מדגם מייצג ניתן לספור. תמונה בגוונים האפורים של צביעה גרעינית ניאון DAPI כבר מתהפך לשיפור הדמיה של תאים. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="איור 4" /> תאי Trophoblast איור 4. ניתן לזהות, והטוהר של האוכלוסייה המבודדת העריך, על ידי immunostaining ל7 cytokeratin (מרכז, מגנט). תאי counterstained עם DAPI (למעלה, כחול). תמונה, תחתון ממוזגת.

<ol>
	<li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion.">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+characterization,+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae.">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li><li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta:+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening.">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li><li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts.">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li><li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion.">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

אין לנו מה למסור.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הבידוד של תאים משלית trophoblast העכבר. אז אנחנו מראים assay חוץ גופייה בפלישה לtrophoblast. שימוש בהליך זה, במידה רבה, אבל לא לגמרי, אוכלוסייה טהורה של תאי trophoblast ניתן להשיג. אם טוהר נוסף נדרש, הפרדה מגנטית חרוז או הזרימה cytometry יכול להתבצע, כפי שכבר תאר לת...

Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
<table border='1'>
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>50ml</td>
 <td>1X</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hepes</td>
 <td>2.383 g</td>
 <td>0.02M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>sodium bicarbonate</td>
 <td>0.42 g</td>
 <td>0.01M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicllin-Streptomycin</td>
 <td>5 mL</td>
 <td>100 U- 100 &mu;g /ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile dH20</td>
 <td>to 500 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagent</td>
 <td>Amount</td>
 <td>Final concentration</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wash Solution</td>
 <td>100 mL</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>1 vial (2000 U)</td>
 <td>20 U/mL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>100 mg</td>
 <td>125 digestion units/mL</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>


<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>C9891</td>
 <td>This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NCTC-135</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>Add FBS to 10%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Matrigel invasion chambers</td>
 <td>BD Biosciences</td>
 <td>354481</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10x Medium 199</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>M9163</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin-Streptomycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15140</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DNase</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D4263</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 &mu;m Cell strainer</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>22363549</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibody to cytokeratin 7</td>
 <td>DAKO</td>
 <td>M7018</td>
 <td>Used at 1:100 dilution</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.

isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay

השליה אחראית להובלה של חומרים מזינים, גזים וגורמי גדילה לעובר, כמו גם החיסול של פסולת. לכן, פגמים בהתפתחות שליה יש לו השלכות רבות על העובר ואמו, והם גורם עיקרי של הקטלניות עובריות. סוג התא העיקרי של החלק העוברי של השליה הוא trophoblast. תאי trophoblast שליה ראשוניים עכבר הם כלי שימושי לחקר התפתחות שליה רגילה ונורמלית, ולא כמו שורות תאים, עשוי להיות מבודדים ומשמשים ללמוד trophoblast בשלבים מסוימים של הריון. בנוסף, תרבויות העיקריות של trophoblast מעכברים מהונדסים עלולות לשמש כדי לחקור את תפקידם של גנים מסוימים בתאי שליה. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על התיאור של Thordarson et al. 1, שבו שיפוע percoll משמש להשגת אוכלוסיית תא trophoblast טהורה יחסית משליות עכבר בודדות. זה דומה לשימוש נרחב יותרשיטות ברה 2-3 בידוד תא trophoblast אנושיים. טוהר יכול להיות מוערך על ידי צביעת immunocytochemical של התאים המבודדים ל7 4 cytokeratin. הנה, התאים הבודדים לאחר מכן, נותחו באמצעות assay פלישה matrigel להעריך הפולשנות trophoblast במבחנת 5-6. התאים פלשו מנותחים immunocytochemistry ומוכתם לספירה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay at JoVE.com

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

isolation-primary-mouse-trophoblast-cells-trophoblast-invasion

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  University of Missouri. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הנתיחה של placentae מהעכבר על ההריון d10.5, ואחרי הבידוד של תאי trophoblast באמצעות שיפוע Percoll. אז אנחנו מדגימים שימוש בתאים המבודדים בassay פלישת matrigel.

Video: Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation, Characterization, And High Throughput Extracellular Flux Analysis of Mouse Primary Renal Tubular Epithelial Cells

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). Therefore, assessing mitochondrial function in primary TECs may provide valuable insight into the bioenergetic status of the cells, providing insight into the pathophysiology of CKD. While there are a number of complex protocols available for the isolation and purification of proximal tubules in different species, the field lacks a cost-effective method optimized for&#160;tubular cell isolation without the need for purification. Here, we provide an isolation protocol that allows for studies focusing on both primary mouse proximal and distal renal TECs. In addition to cost-effective reagents and minimal animal procedures required in this protocol, the isolated cells maintain high energy levels after isolation and can be sub-cultured up to four&#160;passages, allowing for continuous studies. Furthermore, using a high throughput extracellular flux analyzer, we assess the mitochondrial respiration directly in the isolated TECs in a 96-well plate for which we provide recommendations for the optimization of cell density and compound concentration. These observations suggest that this protocol can be used for renal tubular ex vivo studies with a consistent, well-standardized production of renal TECs. This protocol may have broader future applications to study mitochondrial dysfunction associated with renal disorders for drug discovery or drug characterization purposes.

This protocol provides a cost-effective approach to isolate and characterize mouse primary renal tubular cells that can subsequently be sub-cultured to assess renal biological functions ex vivo, including mitochondrial bioenergetics.

ניתוח השטף חוץ-תאי בידוד, אפיון, תפוקה גבוהה של העכבר הראשי כליות צינורי בתאי אפיתל

Mitochondrial dysfunction in the renal tubular epithelial cells (TECs) can lead to renal fibrosis, a major cause of&#160;chronic kidney disease (CKD). ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

אוסף תאים בודדים של תאי טרופוביסט בעוברים אנושיים שלב השתלה פרי

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...