ويمكن استخدام هذه الطرق لتحديد العوامل التي تؤثر على غزو الترودوبياست التي قد توفر نظرة ثاقبة على النتائج الرئيسية السلبية للولادة. وميزة هذه التقنية هي أنها توفر تحليلا بصريا وكميا لعدة عوامل قد تؤثر على غزو الأرموست بما في ذلك الانتشار والهجرة. لبدء فحص الخدش، بذور العدد المناسب من الخلايا في لوحة 24-جيدا لتحقيق التقاء 100٪في 48 ساعة.
في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكملها الحرارة dextran الفحم المعطل جردت FBS. في يوم الصفر، أضف العلاج المطلوب إلى الوسائط في كل بئر للمعالجة المسبقة للخلايا لمدة 30 دقيقة. لإنشاء الجروح موحدة، مكان عقيمة 10 نصائح ماصة ميكرولتر على دبابيس أداة صانع الجرح.
خفض النصائح في الصف الأول من الآبار ونقل لوحة على طول المسار من صانع الجرح حتى نصائح ماصة تصل إلى الجانب الآخر من البئر. ثم نقل لوحة العودة إلى وضعية البداية لضمان جرح مستمر عبر قطر البئر. خفض النصائح في الصف التالي من الآبار وكرر حتى يتم خدش جميع الآبار.
تأكد من أن الخدش يغطي عرض البئر من خلال مراقبة اللوحة تحت المجهر. المقبل، بعناية التعرق وسائل الإعلام وغسل بلطف الخلايا مع 1X برنامج تلفزيوني مرتين. بعد غسل النهائي, إضافة مكملات الفينول الأحمر مجانا تجريد أو انخفاض وسائل الإعلام FBS مع العلاج المطلوب.
بعد ذلك، ضع اللوحة مع الآبار المخدوشة في صورة وقتية آلية تقع في حاضنة تحتوي على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪. صورة الخلايا على فترات منتظمة حسب الحاجة للسماح للخلايا لإكمال التئام الجروح. لبدء اختبار الغزو، بذور العدد المناسب من الخلايا في لوحات ستة آبار في حاضنة الذي يحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي رطوبة 95٪.
السماح للخلايا للوصول إلى التقاء 90٪في 48 ساعة. في اليوم التالي، تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكملها الحرارة dextran الفحم المعطل جردت FBS. وضع قارورة من 10 ملليغرام لكل ملليلتر مصفوفة خارج الخلية في ثلاجة على الجليد والسماح هو ذوبان بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي ، استخدم نصائح الماصات المبردة لتخفيف 10 ملليغرام لكل ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية مع سائل الدم المجاني المجاني للفينول الأحمر إلى تركيز نهائي قدره خمسة ملليغرام لكل ملليلتر. ثم إضافة 100 ملليلتر من المصفوفة خارج الخلية المخففة إلى إدراج المبردة التي تم وضعها في لوحة 24-well المبردة. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية للسماح للمصفوفة لتصلب.
لإعداد الخلايا لإجراء فحص الغزو، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 1X PBS. ثم الطامح برنامج تلفزيوني وإضافة 500 ميكرولترات من 1x تريبسين EDTA إلى كل بئر. ضع لوحة الستة بئراً في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪ حتى تنفصل جميع الخلايا عن قاع اللوحة.
مرة واحدة قد فصلت الخلايا، إضافة 500 ميكرولترات من سائل الدم الحرة الحمراء الفينول إلى كل بئر من الخلايا التربسينized. ثم نقل 1000 ميكرولترات من الخلايا المنفصلة إلى أنبوبrifuge microcentوس وتدور لمدة خمس دقائق في 400 مرة ز في أربع درجات مئوية. المقبل, التعرق وسائل الإعلام وإعادة تعليق الخلايا في الفينول الأحمر حر مصل وسائل الإعلام الحرة.
عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا التلقائي وضبط حجم تعليق الخلية لتركيز نهائي من 0.5 مليون خلية لكل ملليلتر. إضافة 600 ميكرولترات من وسائل الإعلام النمو الكامل إلى كل بئر من لوحة 24-well ووضع إدراج قبل المغلفة في ذلك. ثم إضافة 200 ميكرولترات من الخلايا على رأس كل إدراج الخلايا المغلفة مسبقا لما مجموعه 0.1 مليون خلية.
ضع اللوح الذي 24 بئرًا في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة بنسبة 95٪ لمدة 24 ساعة. بعد الحضانة بين عشية وضحاها، شفط وسائل الإعلام المتبقية من الغرف العلوية والسفلى دون إزعاج المصفوفة خارج الخلية. ثم إزالة بعناية مصفوفة خارج الخلية والخلايا غير الغازية من الجزء العلوي من إدراج مع مسحة القطن.
غسل كل إدراج ثلاث مرات عن طريق إضافة 1X برنامج تلفزيوني إلى كل من الغرف العليا والسفلى من البئر. سبيريت برنامج تلفزيوني بعد كل غسل. لإصلاح الخلايا تعلق على إدراج، ضع إدراج في 100٪ الميثانول الباردة الجليد في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
غسل إدراج ثلاث مرات مع 1X برنامج تلفزيوني وإزالة برنامج تلفزيوني بعد الغسيل النهائي. وصمة عار الخلايا المرفقة إدراج مع 0.2٪ البنفسجي الكريستال في 20٪ الإيثانول لمدة 10 دقيقة. شطف مع الماء غير المؤين ثلاث مرات وpirate المياه غير المؤين بعد الغسيل النهائي.
إدراج الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. وأخيرا باستخدام ملقط وشفرة حلاقة، وقطع بعناية الغشاء السفلي من إدراج وجبل على شريحة زجاجية مع الجانب السفلي التي تواجه لأعلى. باستخدام مجهر خفيف مع هدف 20X، الحصول على ما لا يقل عن أربع صور فريدة من الخلايا غزا لكل عينة.
لبدء التشايس الانتشار، استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا التربسينية من القارورة. بذور الخلايا في لوحات ستة آبار في كثافة 0.2 مليون خلية في بئر في وسائل الإعلام القياسية النمو. ثم ضع الخلايا في الحاضنة التي تحافظ على 37 درجة مئوية ودرجة الحرارة و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 95٪ جو الرطوبة لمدة أربع ساعات أو حتى الخلايا قد التزمت.
المقبل, تغيير وسائل الإعلام إلى الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكمل مع الحرارة تنشيط الفحم dextran جردت FBS والعلاج المطلوب. ضع صفيحة الستة في الحاضنة التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في جو الرطوبة 95٪. ثم استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام الطازجة تكمل مع العلاج المطلوب كل 48 ساعة.
بعد 24، 48، أو 72 ساعة من العلاج، وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من 1X PBS وإضافة 500 ميكرولترات من تريبسين EDTA إلى كل بئر. ضع لوحة ستة بئر في الحاضنة حتى تنفصل الخلايا عن اللوحة. مرة واحدة الخلايا قد فصلت من لوحة, إضافة 500 ميكرولترات من الفينول الأحمر وسائل الإعلام الحرة تكميلية لتعطيل تريبسين.
وأخيرا إضافة خمسة microliters من الخلايا التربسينized إلى خمسة microliters من الأزرق Trypan في أنبوب منفصل ومزيج عن طريق الأنابيب. استخدام عداد خلية تلقائي لحساب الخلايا من كل بئر في مكررة. خلدت الإنسان الثلث الأول trophoblast البجعة.
71 تم علاج الخلايا 0، ثماني، و 18 ساعة مع مركبة 1x PBS أو 100 micromolar من ديكساميثازون جليكوكورتيكويد الاصطناعية في الخدش. قياس حجم الجرح وكثافة الجرح في سوان. 71 وHTR-8/SVneo الخلايا المعالجة مع السيارة أو 100 نانومولار ديكس أظهرت أن العلاج ديكس خفض معدل إغلاق الجرح مما يدل على أن الجلوكوكورتيكويدات يمكن أن تمنع هجرة الخلايا.
بعد فحص الغزو ، قلل علاج الجلوكوكورتيكويد من غزو الخلايا كما يتضح من انخفاض بنسبة 15٪ في عدد البجعة الغازية. 71 وخلايا HTR-8/SVneo تم علاجها بـ 100 نانومولار ديكس لمدة 24 ساعة مقارنة بالخلايا المعالجة بالمركبات. بعد فحص انتشار الخلايا ، قلل علاج الجلوكوكورتيكويد من انتشار الخلايا كما يشير إلى انخفاض البجعة.
71 وخلايا HTR-8/SVneo تعالج بـ 100 من الخلايا النانوية المُعالجة بالخلايا التي تعالج بالمركبات. يمكن استخدام طرق تقييم موت الخلايا بالاقتران مع هذا الإجراء لتحديد ما إذا كان المبرمج أو النخر يساهم في وظائف trophoblast المعدلة. لقد اعتمدنا بشكل فريد استخدام التقنيات القياسية المستخدمة بشكل روتيني في بيولوجيا السرطان لدراسة وظيفة trophoblast.
لا توجد مخاطر مرتبطة بهذه الطرق. الاحتياط الوحيد الذي يجب على المشاهدين اتخاذها هو استخدام تقنية عقيمة لثقافة الأنسجة.
