وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للشيخوخة (AG04418) ، المعهد الوطني لتعاطي المخدرات ، والمعهد الوطني للصحة من معهد كارولينسكا برنامج الشراكات العليا ، معهد كارولينسكا ، مجلس البحوث السويدية والسويدية كهربائية الدماغ ، والسويدية مؤسسة الدماغ. شكرا جزيلا لKarlen والدكتور ماتياس Coppotelli جوزيبي للحصول على الدعم الخلاق مع الشكل 1 و 2 ، على التوالي ؛ كارين Pernold للحصول على المساعدة التقنية ، والدكاترة. باري ج. هوفر ، لارس أولسون ، ونيلز لارسون ، غوران لنصائح مفيدة كثيرا والمناقشة.

1. التحضير لأنسجة cryosectioning <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الحيوانية إما خلع عنق الرحم أو قطع الرأس ، وفقا لتصريح الأخلاقية المتاحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الأنسجة بسرعة من الفائدة (على سبيل المثال. الدماغ) ، وتجميد بسرعة على الثلج الجاف (الأنسجة قد تتطلب درجة التجمد في isopentane أو البروبان المبردة مع النتروجين السائل للحصول على التشكل الأمثل). تخزينها في الأنسجة رقائق الألومنيوم في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للمقطع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضمين الأنسجة المجمدة تمهيدا لcryosectioning. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المقاطع ناظم البرد 14 ميكرومتر في -21 درجة مئوية (قد تحتاج إلى ضبط درجة الحرارة ± 1-2 درجة مئوية). ذوبان الجليد على أبواب الشرائح باستخدام كتلة التدفئة ، والشرائح في مخزن دون coverslipping -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 2. كوكس الكيمياء النسيجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. خفض وضع الشرائح في غرفة الشريحة تلطيخ مع ورق الترشيح الرطب ، إلى شرائح. للحصول على consistenالنتائج طنا في كل تجربة ، فمن المستحسن أن العملية بحد أقصى عشرة شرائح في تجربة لتقليل فترات التأخير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السيتوكروم 100 ميكرومتر تعد تحت DAB الكيميائية 1X هود ، ج 0.1 درجة الحموضة في برنامج تلفزيوني M = 7.0. الدوامة بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكروغرام البقري الكاتلاز (2 ميكروغرام مل -1 أو IU حوالي 4 مل -1). مزيج جيد من قبل vortexing لتفريق جميع الحبوب من الكاتلاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 150 -- إلى كل شريحة من 200 ميكرولتر المتوسطة الحضانة ، واستخدام ماصة للطرف موزعة بالتساوي على جميع الأقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الزائدة من الشرائح. تغسل الشرائح 4 مرات ، و 10 دقائق في كل مرة ، في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى الشريحة الشرائح تلطيخ الغرفة بشرائط الورق الرطب. </li></ol> 3. SDH الكيمياء النسيجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد تحت غطاء الكيميائية NBT 1.5 ملم ، 130 ملم سكسينات الصوديوم ، 0.2 PMS ملم ، و 1.0 ملي أزيد الصوديوم في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0. الحيطة والحذر لحمايةPMS بعيدا عن الضوء. الدوامة بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 150-200 ميكروليتر المتوسطة حضانة إلى كل الشرائح ، واستخدام ماصة للطرف موزعة بالتساوي على جميع الأقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل إزالة الزائدة من الشرائح. تغسل الشرائح 4 مرات ، و 10 دقائق في كل مرة ، في 0.1 درجة الحموضة PBS M = 7.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى الشرائح لمدة 2 دقيقة في تركيزات التالية من الايثانول : 70 ٪ ، 70 ٪ ، 95 ٪ ، 95 ٪ ، 99.5 ٪. السماح ثم 10 دقيقة في خطوة إضافية 99.5 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الشرائح في الزيلين لمدة 10 دقائق. جبل مع Entellan وساترة. السماح للشرائح حتى يجف ساعات خلال الليل ، أو على الأقل 1-2 في منطقة جيدة التهوية. </li></ol> 4. تحديد الخلل الميتوكوندريا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يشار إلى ضعف كمية الميتوكوندريا بمقدار تلطيخ الزرقاء الخلوية. إلى شبه تحديد هذه المبالغ ، ينبغي ترميز الشرائح وتصور تحت المجهر مشرق الميدان. ينبغي أن يقوم على القياس الكمي شبه أعمى<html> باستخدام مقياس أساس ، على سبيل المثال 0-4 (0 ، أي تلطيخ الأزرق ؛ 4 ، تلوين فقط أزرق). فمن الأفضل لتنفيذ هذا النوع من القياس الكمي شبه على عدة أقسام من موضوع معين / الحيوان لحساب القيمة المتوسطة لكل موضوع / الحيوانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب أن يتم تنفيذ الإحصاءات باستخدام اختبار غير المعلمية ، مثل مان ويتني أو كروسكال واليس. </li></ol> 5. ضوابط خصوصية المناسبة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضوابط خصوصية للنشاط كوكس ، كرر &quot;كوكس الكيمياء النسيجية&quot; خطوات ، وإضافة 2.5 ملي أزيد الصوديوم ، سلسلة تنفسية مثبط المحطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضوابط خصوصية للنشاط SDH ، كرر &quot;SDH الكيمياء النسيجية&quot; خطوات مع إزالة سكسينات الصوديوم وإضافة المالونات 50 مم ، والمانع التنافسية للSDH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ويجفف المقاطع في سلسلة الإيثانول ، وإعداد العدة ثم ساترة الشرائح كما هو موضح في الخطوات 3،4-3،6. </li></ol> 6. ممثل النتائج : خيمة &quot;&gt; وترد الخطة الشاملة للالأمثلة الممثل كوكس / SDH المزدوج العلامات مقايسة النسيجية هو موضح في الشكل 2. كوكس من الكيمياء النسيجية / SDH المزدوج وضع العلامات المناسبة في أقسام الدماغ من النوع البري والشيخوخة قبل الأوان الفئران mutator و mtDNA في الشكل 3. أظهرت تلوين بني غامق في البرية من نوع الفئران (الشكل 3 ، لوحة على اليسار) العادي كوكس نشاط الخلايا مع سلسلة القصور التنفسي ، التي أشار إليها تلطيخ الأزرق ، والذي كشف في 12 أسبوع من العمر و mtDNA mutator الفئران ، وأصبحت هذه العيوب أكثر انتشارا في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين mutator و mtDNA إلى 46 أسابيع (الشكل 3 ، ومركز اللوحة اليمنى). وترد أمثلة كوكس / SDH مناسبة مزدوجة وضع العلامات في أقسام الدماغ من الفئران من النوع البري بسبب عدم كفاية العلامات كوكس في الشكل 4. عدم كفاية الوقت لاحتضان هذه التظاهرة من النشاط كوكس ، أو الحد من توافر الأكسجين الجزيئي التي coverslipping الشريحة أثناء الحضانة ، أسفرت عن خفض ترسب من رد فعل DABايون المنتج ، وبالتالي السماح لتشكيل المنتج الأزرق نهاية formazan خلال حضانة SDH. ويمكن أيضا كوكس SDH وأنشطة يتم التحقيق بشكل منفصل (الشكل رقم 5 ، واليسار والوسط) ، إلا أن العلامات متسلسلة مفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على أوجه القصور كوكس ، ويرجع ذلك إلى تشكيل ليعجل الزرقاء خلال الاحتضان SDH (الشكل 3 ، ومركز اليمين). ويمكن أيضا ضوابط لأنشطة خصوصية كوكس وSDH ينبغي القيام به (الشكل رقم 5 ، والحق). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig1.jpg" /> الشكل 1. الميتوكوندريا التنفسي المجمعات الرابع. وتقع سلسلة تنفسية الميتوكوندريا داخل الغشاء الداخلي وتشمل خمسة مجمعات. الغرض من هذه السلسلة هو الجهاز التنفسي لنقل الإلكترونات من مجمع من الأول إلى الرابع ، وبذلك يخلق تدرج البروتونات عبر الغشاء الداخلي المستخدمة من قبل مجمع الخامس (أتباز) لإنتاج ATP. أحمر السداسي represeمفارز المشفرة بواسطة NT و mtDNA. السداسي بيضاء تمثل مفارز المشفرة بواسطة الحمض النووي (لاحظ أنه يتم ترميز تماما مجمع الثاني من الجينوم النووي). وبالتالي ، يمكن أن طفرات في الجينوم الميتوكوندريا تسبب خلل في الجهاز التنفسي بسبب سلسلة الطفرات في مفارز من سلسلة مجمعات في الجهاز التنفسي. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig2.jpg" /> الشكل 2. الرسم البياني للمقايسة كوكس / SDH المزدوج العلامات النسيجية. تشريح أجهزة الفائدة ، وتجميد الأنسجة بسرعة على الثلج الجاف ، وتخزينها في -- 80 درجة مئوية. جمع المقاطع ناظم البرد والحفاظ على -- 20 درجة مئوية حتى الاستخدام. السماح ليجف المقاطع في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إعداد المتوسطة حضانة الكيمياء النسيجية كوكس ، وتطبيق ذلك على الشرائح ، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغسل المقاطع في برنامج تلفزيوني 4 مرات لمدة 10 دقيقة كل غسل. إعداد المتوسطة حضانة الكيمياء النسيجية SDH ، تطبيقه على سليقصر ، واحتضان مرة أخرى لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغسل المقاطع مرة أخرى في برنامج تلفزيوني ، يذوى في سلسلة من الإيثانول ، ومن ثم تحميل وساترة الشرائح. كوكس / SDH المزدوج المسمى المقاطع على استعداد لعرض تحت المجهر مشرق الميدان في غضون 1-2 ساعات. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig3.jpg" /> الشكل 3 أمثلة ممثل كوكس / SDH المزدوج التوسيم. وصفت بالتسلسل أقسام الدماغ من النوع البري والشيخوخة قبل الأوان الفئران mutator و mtDNA لأنشطة كوكس وSDH. وقد ظهر نشاط عادي كوكس (المشار إليها بواسطة اللون البني الداكن) في قرن آمون من الفئران البرية من نوع (اليسار) : (200 ميكرون شريط مقياس). تم الكشف عن أوجه القصور كوكس (المشار إليها باللون الأزرق) في قرن آمون من الفئران mutator و mtDNA (الوسط واليمين). كان هناك مزيد من الانخفاض في النشاط كوكس بنسبة 46 أسابيع من العمر في الفئران mutator و mtDNA ، مما يشير إلى تفاقم الخلل واسع النطاق للسلسلة في الجهاز التنفسي. لاحظ ميتوسبب الخلل في chondrial و mtDNA mutator الفئران 12 من مستويات عالية من الطفرات نقطة و mtDNA فضلا عن زيادة مستويات الحذف الخطية 5. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig4.jpg" /> الشكل 4. أمثلة من غير الملائم كوكس / SDH المزدوج التوسيم. وصفت بالتسلسل أقسام الدماغ من الفئران من النوع البري للأنشطة كوكس وSDH. (شريط القياس : 200 ميكرون) أدى عدم كفاية حضانة مرات (10 و 25 دقيقة) للمظاهرة النشاط كوكس في ترسب خفض رد الفعل الناتج البني DAB ، بالمقارنة مع فترة حضانة لمدة 40 دقيقة (يسار ووسط). أوقات حضانة تقصير سمح لتشكيل المنتج الأزرق نهاية formazan خلال حضانة SDH ، مما يوحي بشكل مضلل وجود خلايا مع القصور كوكس. Coverslipping الشرائح خلال حضانة كوكس أسفرت أيضا عن تشكيل غير دقيقة وترسب من رد فعل DABايون المنتج (يمين). <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3266/3266fig5.jpg" /> الشكل 5. أنا ndividual كوكس SDH ووضع العلامات والسيطرة النوعية. وصفت بشكل منفصل من أقسام الدماغ من النوع البري الفئران لأنشطة كوكس والمحددات ، وأشارت حسب اللون البني الداكن واللون الأزرق ، على التوالي (يسار ووسط). بالرغم من أنه يمكن كوكس والأنشطة SDH المسمى بشكل فردي ، أثبت التوسيم متتابعة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا. وأظهر مثال على السيطرة النوعية للأنشطة كوكس وSDH في الدماغ من ماوس البرية من نوع غياب العلامات (يمين). (شريط القياس : 200 ميكرون)

<ol>
	<li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mitochondrial+DNA+mutations+in+mammalian+aging.">Somatic mitochondrial DNA mutations in mammalian aging.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 683-706 (2010).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging.">Role of mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> Ann. NY Acad. Sci. 908, 199-207 (2000).</li><li>Harman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biologic+clock:+the+mitochondria.">The biologic clock: the mitochondria.</a> J. Am. Geriatr. Soc. 20, 145-147 (1972).</li><li>Wallace, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+genetics+-+a+paradigm+for+aging+and+degenerative+diseases.">Mitochondrial genetics - a paradigm for aging and degenerative diseases.</a> Science. 256, 628-632 (1992).</li><li>Trifunovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+ageing+in+mice+expressing+defective+mitochondrial+DNA+polymerase.">Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase.</a> Nature. 429, 417-423 (2004).</li><li>Ameur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-deep+sequencing+of+mouse+mitochondrial+DNA:+mutational+patterns+and+their+origins.">Ultra-deep sequencing of mouse mitochondrial DNA: mutational patterns and their origins.</a> PLoS Genet. 7, e1002028-e1002028 (2011).</li><li>Safdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endurance+exercise+rescues+progeroid+aging+and+induces+systemic+mitochondrial+rejuvenation+in+mtDNA+mutator+mice.">Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 4135-4140 (2011).</li><li>DiMauro, S., Bonilla, E., Zeviani, M., Nakagawa, M., DeVivo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+myopathies.">Mitochondrial myopathies.</a> Ann. Neurol. 17, 521-538 (1985).</li><li>Old, S. L., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+microphotometric+assay+of+succinate+dehydrogenase+and+cytochrome+c+oxidase+activities+for+use+on+human+skeletal+muscle.">Methods of microphotometric assay of succinate dehydrogenase and cytochrome c oxidase activities for use on human skeletal muscle.</a> Histochem. J. 21, 545-555 (1989).</li><li>Chaturvedi, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+PGC-1alpha+function+in+muscle+in+Huntington's+disease.">Impaired PGC-1alpha function in muscle in Huntington's disease.</a> Hum. Mol. Genet. 18, 3048-3065 (2009).</li><li>Edgar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+point+mutations+with+major+effects+on+protein-coding+genes+are+the+driving+force+behind+premature+aging+in+mtDNA+mutator+mice.">Random point mutations with major effects on protein-coding genes are the driving force behind premature aging in mtDNA mutator mice.</a> Cell. Metab. 10, 131-138 (2009).</li><li>Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+brain+lactate+is+a+hallmark+of+aging+and+caused+by+a+shift+in+the+lactate+dehydrogenase+A/B+ratio.">High brain lactate is a hallmark of aging and caused by a shift in the lactate dehydrogenase A/B ratio.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20087-20092 (2010).</li><li>Crugnola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+chain+dysfunction+in+muscle+from+patients+with+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Mitochondrial respiratory chain dysfunction in muscle from patients with amyotrophic lateral sclerosis.</a> Arch. Neurol. 67, 849-854 (2010).</li><li>Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+pathology+in+cytochrome+c+oxidase+deficiency.">Muscle pathology in cytochrome c oxidase deficiency.</a> Acta. Neuropathol. 77, 152-160 (1988).</li><li>DiMauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+encephalomyopathies.">Mitochondrial encephalomyopathies.</a> Neurol. Clin. 8, 483-506 (1990).</li><li>Bonilla, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+morphological+approaches+to+the+study+of+mitochondrial+encephalomyopathies.">New morphological approaches to the study of mitochondrial encephalomyopathies.</a> Brain. Pathol. 2, 113-119 (1992).</li><li>Brierley, E. J., Johnson, M. A., Lightowlers, R. N., James, O. F., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+mitochondrial+DNA+mutations+in+human+aging:+implications+for+the+central+nervous+system+and+muscle.">Role of mitochondrial DNA mutations in human aging: implications for the central nervous system and muscle.</a> Ann. Neurol. 43, 217-223 (1998).</li><li>Borthwick, G. M., Johnson, M. A., Ince, P. G., Shaw, P. J., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+enzyme+activity+in+amyotrophic+lateral+sclerosis:+implications+for+the+role+of+mitochondria+in+neuronal+cell+death.">Mitochondrial enzyme activity in amyotrophic lateral sclerosis: implications for the role of mitochondria in neuronal cell death.</a> Ann. Neurol. 46, 787-790 (1999).</li><li>Gellerich, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+respiratory+rates+and+activities+of+respiratory+chain+complexes+correlate+linearly+with+heteroplasmy+of+deleted+mtDNA+without+threshold+and+independently+of+deletion+size.">Mitochondrial respiratory rates and activities of respiratory chain complexes correlate linearly with heteroplasmy of deleted mtDNA without threshold and independently of deletion size.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1556, 41-52 (2002).</li><li>Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+transcription+factor+A+is+necessary+for+mtDNA+maintenance+and+embryogenesis+in+mice.">Mitochondrial transcription factor A is necessary for mtDNA maintenance and embryogenesis in mice.</a> Nat. Genet. 18, 231-236 (1998).</li><li>Ekstrand, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+parkinsonism+in+mice+with+respiratory-chain-deficient+dopamine+neurons.">Progressive parkinsonism in mice with respiratory-chain-deficient dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1325-1330 (2007).</li><li>Seligman, A. M., Karnovsky, M. J., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondroplet+ultrastructural+demonstration+of+cytochrome+oxidase+activity+with+a+polymerizing+osmiophilic+reagent,+diaminobenzidine+(DAB).">Nondroplet ultrastructural demonstration of cytochrome oxidase activity with a polymerizing osmiophilic reagent, diaminobenzidine (DAB).</a> J. Cell. Biol. 38, 1-14 (1968).</li><li>Dubowitz, V., Brooke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+Biopsy:+A+Modern+Approach.">Muscle Biopsy: A Modern Approach.</a> , (1973).</li><li>Cottrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c+oxidase+deficient+cells+accumulate+in+the+hippocampus+and+choroid+plexus+with+age.">Cytochrome c oxidase deficient cells accumulate in the hippocampus and choroid plexus with age.</a> Neurobiol. Aging. 22, 265-272 (2001).</li><li>Blanco, C. E., Sieck, G. C., Edgerton, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+histochemical+determination+of+succinic+dehydrogenase+activity+in+skeletal+muscle+fibres.">Quantitative histochemical determination of succinic dehydrogenase activity in skeletal muscle fibres.</a> Histochem. J. 20, 230-243 (1988).</li><li>Moraes, C. T., Ricci, E., Bonilla, E., DiMauro, S., Schon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+tRNA(Leu(UUR))+mutation+in+mitochondrial+encephalomyopathy,+lactic+acidosis,+and+strokelike+episodes+(MELAS):+genetic,+biochemical,+and+morphological+correlations+in+skeletal+muscle.">The mitochondrial tRNA(Leu(UUR)) mutation in mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes (MELAS): genetic, biochemical, and morphological correlations in skeletal muscle.</a> Am. J. Hum. Genet. 50, 934-949 (1992).</li><li>Petruzzella, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high+levels+of+mutant+mtDNAs+co-localize+with+cytochrome+c+oxidase-negative+ragged-red+fibers+in+patients+harboring+a+point+mutation+at+nt+3243.">Extremely high levels of mutant mtDNAs co-localize with cytochrome c oxidase-negative ragged-red fibers in patients harboring a point mutation at nt 3243.</a> Hum. Mol. Genet. 3, 449-454 (1994).</li><li>Tulinius, M. H., Holme, E., Kristiansson, B., Larsson, N. G., Oldfors, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+encephalomyopathies+in+childhood.+I.+Biochemical+and+morphologic+investigations.">Mitochondrial encephalomyopathies in childhood. I. Biochemical and morphologic investigations.</a> J. Pediatr. 119, 242-250 (1991).</li><li>Haas, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in-depth+evaluation+of+suspected+mitochondrial+disease.">The in-depth evaluation of suspected mitochondrial disease.</a> Mol. Genet. Metab. 94, 16-37 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

مجتمعة كوكس / SDH النسيجية طريقة تمكن من الخلايا التصور مع ضعف الميتوكوندريا. هذه التقنية ، مع دراسات في وقت مبكر يعود إلى عام 1968 ، لا يزال يتمتع بشعبية ، مع العديد من معتبرا انه &quot;المعيار الذهبي&quot; لتحديد أمراض الميتوكوندريا في المرضى 14،19،26،27. الآن أنها كثيرا م?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري) </td></tr><tr><td> الثلج الجاف </td><td> AGA AB الغاز </td><td> كتلة النموذج </td><td></td></tr><tr><td> Isopentane (2 - methylbutane) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 277258 CAS : 78-78-4 </td><td></td></tr><tr><td> Cyrostat تضمين الحل </td><td> ساكورا Finetek </td><td> الأنسجة تك 4583 </td><td></td></tr><tr><td> ناظم البرد </td><td> Microm </td><td> Microm النموذجي جلالة 500M </td><td></td></tr><tr><td> الشرائح </td><td> الحرارية العلمية </td><td> سوبر بلس فروست منزل جلاسر J1800AMWZ </td><td></td></tr><tr><td> تغطية النظارات البورسليكات الزجاج </td><td> VWR الدولية </td><td> 16004-098 </td><td> 24 × 50 مم </td></tr><tr><td> مرشح ورقة </td><td> Munktell تصفية AB </td><td> جودة : 1350 مقالةرقم : 242 001 </td><td> 430 X 430 مم </td></tr><tr><td> 3،3 &#39;- diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> سيغما النظام الركيزة السائل ، D7304 </td><td></td></tr><tr><td> ج السيتوكروم (النوع الثالث ، من القلب الخيول) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C2506 CAS : 9007-43-6 </td><td></td></tr><tr><td> الكاتلاز البقري (من الكبد) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C9322 CAS : 9001-05-2 </td><td></td></tr><tr><td> زرقة النتروتترازوليوم (NBT) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> N6876 CAS : 298-83-9 </td><td></td></tr><tr><td> سكسينات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S2378 CAS : 6106-21-4 </td><td></td></tr><tr><td> Phenazine methosulfate (PMS) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> P9625 CAS : 299-11-6 </td><td> PMS حساس الضوء. درع من الضوء. </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S8032 CAS : 26628-22-8 </td><td></td></tr><tص&gt; <td> الزيلين </td><td> VWR الدولية </td><td> EM - XX0060 - 4 </td><td></td></tr><tr><td> Entellan </td><td> VWR الدولية </td><td> 100503-870 </td><td></td></tr><tr><td> المالونات (حمض المالونيك) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M1296 CAS : 141-82-2 </td><td></td></tr></table>

visualization of mitochondrial respiratory function using cytochrome c oxidase / succinate dehydrogenase (cox/sdh) double-labeling histochemistry

الميتوكوندريا الحمض النووي (و mtDNA) العيوب هي سبب هام للمرض ، وربما تكمن وراء الشيخوخة والشيخوخة ذات الصلة 1،2 التعديلات. نظرية الميتوكوندريا الشيخوخة يشير إلى وجود دور للطفرات و mtDNA ، الذي يمكن أن يغير توازن الطاقة الحيوية والوظيفة الخلوية ، في عملية الشيخوخة 3. وقد تم تجميع ثروة من الأدلة لدعم هذا 1،4 الناحية النظرية ، على سبيل المثال يجري mutator 5 و mtDNA الماوس ، ولكن الدور الدقيق للضرر و mtDNA في الشيخوخة ليست مفهومة تماما 6،7. مراقبة نشاط الانزيمات التنفسية هو نهج واضحة للتحقيق في ضعف الميتوكوندريا. رابعا معقدة ، أو السيتوكروم أوكسيديز ج (كوكس) ، أمر ضروري من أجل وظيفة الميتوكوندريا. يتم ترميز مفارز الحفاز كوكس و mtDNA والتي تعتبر ضرورية لتجميع المجمع (الشكل 1). وبالتالي ، تستند إلى حد كبير التوليف الصحيح والدالة على سلامة و mtDNA 2.رغم أن من الممكن تحقيق المجمعات التنفسية الأخرى ، المجمعات الرابع والثاني هم الأكثر قابلية للفحص النسيجية 8،9. يتم ترميز معقدة تماما الثاني ، أو نازعة سكسينات (SDH) ، عن طريق الحمض النووي (الشكل 1) ، وعادة ما يكون نشاطها لم تتأثر و mtDNA ضعاف ، على الرغم من زيادة قد تشير إلى نشوء حيوي الميتوكوندريا 10-12. لاحظ و mtDNA ضعف في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والأمراض المرتبطة بالعمر وغالبا ما يؤدي إلى وجود خلايا للنشاط COX منخفضة أو غائبة 2،12-14. على الرغم من أن يتم التحقيق كوكس وSDH أنشطة فردية ، أثبتت متتابعة المزدوج وسم 15،16 طريقة ليكون من المفيد في تحديد الخلايا التي تحتوي على ضعف الميتوكوندريا 12،17-21. وقد تم تحديد العديد من الدساتير الأمثل للمقايسة ، مثل تركيز الركيزة ، يقبلون الإلكترون / المتبرعين والناقلين الإلكترون وسيطة ، وتأثير درجة الحموضة ، والتفاعل طنIME 9،22،23. 3،3 &#39;- diaminobenzidine (DAB) هو المانحة الإلكترون فعالة وموثوق بها 22. في الخلايا التي تحتوي على سير كوكس ، فإن البوليمر الناتج البني indamine توطين في أعراف الميتوكوندريا وتشبع الخلايا 22. وبالتالي فإن هذه الخلايا مع كوكس مختلة لا تكون مشبعة بواسطة المنتج DAB ، والسماح للتصور النشاط SDH بتخفيض tetrazolium nitroblue (NBT) ، والمتقبلة الإلكترون ، إلى منتج الأزرق نهاية formazan 9،24. تضاف السيتوكروم ج سكسينات الصوديوم وركائز لتطبيع المستويات المحلية بين السيطرة والأنسجة المريضة / 9 متحولة. الكاتلاز يضاف كاجراء احترازي لتجنب ردود الفعل المحتملة من تلوث النشاط البيروكسيداز 9،22. يستخدم Phenazine methosulfate (PMS) ، حاملة الإلكترون الوسيطة ، بالاشتراك مع أزيد الصوديوم ، مثبط السلسلة التنفسية ، وزيادة في تشكيل منتجات التفاعل النهائي 9،25. على الرغم من ذلك إبلاغأوجه ، وبعض التفاصيل الهامة التي تؤثر على نتيجة الفحص هذه واضحة لائق ، بالإضافة إلى الضوابط المحددة والتقدم في التقنية ، لم يتم تقديمها حتى الآن.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

والسيتوكروم أوكسيديز ج / نازعة الصوديوم (كوكس / SDH) المزدوج الوسم الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من الميتوكوندريا القصور التنفسي الانزيم في أقسام الأنسجة الطازجة المجمدة. هذا هو أسلوب مباشر النسيجية ومفيد في التحقيق في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والاضطرابات المتصلة بالشيخوخة.

تصور وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام السيتوكروم C أوكسيديز / سكسينات نازعة (كوكس / SDH) مزدوجة وضع العلامات الكيمياء النسيجية

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

visualization-mitochondrial-respiratory-function-using-cytochrome-c

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

36.5K Views.  Karolinska Institutet. والسيتوكروم أوكسيديز ج / نازعة الصوديوم (كوكس / SDH) المزدوج الوسم الأسلوب يسمح للرؤية مباشرة من الميتوكوندريا القصور التنفسي الانزيم في أقسام الأنسجة الطازجة المجمدة. هذا هو أسلوب مباشر النسيجية ومفيد في التحقيق في أمراض الميتوكوندريا ، والشيخوخة ، والاضطرابات ...

Video: Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

و خارج الحي متفرقة التحضير Microvessel الهيكل العظمي للتحقيق في التفاعل الأوعية الدموية

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC regulates mitochondrial function and cellular energy status. Numerous reports demonstrated that the activation of PKC-a and PKC-&epsilon; improves mitochondrial function in the ischemic heart and mediates cardioprotection. In contrast, we have demonstrated that PKC-&alpha; and PKC-&epsilon; are involved in nephrotoxicant-induced mitochondrial dysfunction and cell death in kidney cells. Therefore, the goal of this study was to develop an in vitro model of renal cells maintaining active mitochondrial functions in which PKC isozymes could be selectively activated or inhibited to determine their role in regulation of oxidative phosphorylation and cell survival. Primary cultures of renal proximal tubular cells (RPTC) were cultured in improved conditions resulting in mitochondrial respiration and activity of mitochondrial enzymes similar to those in RPTC in vivo. Because traditional transfection techniques (Lipofectamine, electroporation) are inefficient in primary cultures and have adverse effects on mitochondrial function, PKC-&epsilon; mutant cDNAs were delivered to RPTC through adenoviral vectors. This approach results in transfection of over 90% cultured RPTC.
Here, we present methods for assessing the role of PKC-&epsilon; in: 1. regulation of mitochondrial morphology and functions associated with ATP synthesis, and 2. survival of RPTC in primary culture. PKC-&epsilon; is activated by overexpressing the constitutively active PKC-&epsilon; mutant. PKC-&epsilon; is inhibited by overexpressing the inactive mutant of PKC-&epsilon;. Mitochondrial function is assessed by examining respiration, integrity of the respiratory chain, activities of respiratory complexes and F0F1-ATPase, ATP production rate, and ATP content. Respiration is assessed in digitonin-permeabilized RPTC as state 3 (maximum respiration in the presence of excess substrates and ADP) and uncoupled respirations. Integrity of the respiratory chain is assessed by measuring activities of all four complexes of the respiratory chain in isolated mitochondria. Capacity of oxidative phosphorylation is evaluated by measuring the mitochondrial membrane potential, ATP production rate, and activity of F0F1-ATPase. Energy status of RPTC is assessed by determining the intracellular ATP content. Mitochondrial morphology in live cells is visualized using MitoTracker Red 580, a fluorescent dye that specifically accumulates in mitochondria, and live monolayers are examined under a fluorescent microscope. RPTC viability is assessed using annexin V/propidium iodide staining followed by flow cytometry to determine apoptosis and oncosis.
These methods allow for a selective activation/inhibition of individual PKC isozymes to assess their role in cellular functions in a variety of physiological and pathological conditions that can be reproduced in in vitro.

The effects of activation of protein kinase C (PKC) isozymes on mitochondrial functions associated with respiration and oxidative phosphorylation and on cell viability are described. The approach adapts adenoviral technique to selectively overexpress PKC isozymes in primary cell culture and a variety of assays to determine mitochondrial functions and energy status of the cell.

تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

ضربة قاضية الجينات على نطاق واسع في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; استخدام المكتبات تغذية الرنا المزدوج الجديلة لتوليد قوية لتخفيف من وظيفة الظواهر

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative assessment of lung function in rodent models is an important tool in the development of future therapies. Commonly used techniques for assessing respiratory function including invasive plethysmography and forced oscillation. While these techniques provide valuable information, data collection can be fraught with artefacts and experimental variability due to the need for anesthesia and/or invasive instrumentation of the animal. In contrast, unrestrained whole-body plethysmography (UWBP) offers a precise, non-invasive, quantitative way by which to analyze respiratory parameters. This technique avoids the use of anesthesia and restraints, which is common to traditional plethysmography techniques. This video will demonstrate the UWBP procedure including the equipment set up, calibration and lung function recording. It will explain how to analyze the collected data, as well as identify experimental outliers and artefacts that results from animal movement. The respiratory parameters obtained using this technique include tidal volume, minute volume, inspiratory duty cycle, inspiratory flow rate and the ratio of inspiration time to expiration time. UWBP does not rely on specialized skills and is inexpensive to perform. A key feature of UWBP, and most appealing to potential users, is the ability to perform repeated measures of lung function on the same animal.

The assessment of respiratory physiology has traditionally relied upon techniques, which require restraint or sedation of the animal. Unrestrained whole-body plethysmography, however, provides precise, non-invasive, quantitative analysis of respiratory physiology in animal models. In addition, the technique allows repeated respiratory assessment of mice allowing for longitudinal studies.

قياس وظيفة الجهاز التنفسي في الفئران عن طريق تخطيط التحجم غير مقيد كامل الجسم

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المبايض

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.