نشكر لوري وسارة Destroismaisons بيرار للدعم التقني المتميز وDr.Alexandre برات للوصول إلى تدفق عداد الكريات. ونود أيضا أن نعترف الدكتور تيموثي ميلر لمساهمته بشأن إزالة المايلين من التحضيرات. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث (CIHR) الشراكة الصحة العضلية بحوث، المؤسسة الكندية للإبداع، جمعية ALS كندا، ومؤسسة فريك للبحوث ALS، مؤسسة CHUM وFONDS دي لا سانتيه بحوث في كيبيك (CVV). كلا CVV وNA هم علماء البحوث في FONDS للبحوث أون سانتيه كيبيك وCIHR المحققون جديد. ويدعم SP من قبل تيم نويل Studentship من جمعية ALS كندا.

تم علاج الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة وفقا الصارم لبروتوكول (N08001CVsr) التي وافق عليها دو مركز HOSPITALIER DE L&#39;جامعة مونتريال (CRCHUM) لجنة مركز البحوث المؤسسية لحماية الحيوانات التي تتبع المعايير الوطنية كما حددها الكندية مجلس رعاية الحيوان (CCAC). إعداد جميع الكواشف اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول (الجدول 1). جميع التفاصيل الأخرى المتعلقة المعدات والإمدادات والموردين يمكن العثور عليها في قائمة المواد. <img alt="الجدول 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51887/51887table1.jpg" width="500" /> الجدول 1. العازلة التراكيب. 1. مجموعة من الفئران الحبل الشوكي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعمق تخدير الفئران (سبراغ داولي) مع 4٪ isoflorane. تحقق تخدير بسبب نقص المنعكس على معسر من عشرالبريد forepaw. الموت ببطء الفئران عن طريق قطع الرأس عن طريق المقصلة. ويفضل هذه الطريقة من القتل الرحيم على الآخرين، والتي قد تشوه النخاع الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد من الجزء الخلفي لفضح العمود الفقري. قطع العمود الفقري مع مقص العظام فقط فوق عظم الحوض. تصور افتتاح العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج حقنة 10 مل، مع ماصة غيض 200 ميكرولتر (مرفق عبر ذوبان قليلا على لهب)، مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، في العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرد الحبل الشوكي من خلال تطبيق كمية متوسطة من الضغط على المكبس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أي دم موجود على الحبل الشوكي، وشطف مع برنامج تلفزيوني قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. ملاحظة: تم أيضا التحقق من صحة هذه الطريقة لالدماغ والكبد. إذا بما في ذلك هذه الأنسجة، وجمع نصف الدماغ من الفئران الموت الرحيم وقطعة من الكبد على قدم المساواة في الوزن إلى الحبل الشوكي. تظل جميع خطوات أخرى مماثلة. </li></ol> 2. عزل الحبل الشوكي ميتochondria (مقتبس من فاند فيلد وآخرون. 4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الحبل الشوكي سليمة كله ومكان في 5 مل زجاج الخالط مع 5 مجلدات (~ 3.25 مل) التجانس العازلة (HB). لاسترداد الأمثل للالميتوكوندريا المعزولة، تنفيذ جميع الخطوات على الجليد أو في غرفة باردة. التجانس الأنسجة باليد حتى لا تظل قطع كبيرة من الأنسجة، ما يقرب من ثمانية السكتات الدماغية. ضع جناسة في اثنين (2 مل) أو ثلاثة (1.7 مل) أنابيب microcentrifuge. الطرد المركزي 1،300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge الفوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استعادة طاف ومكان في أنبوب نابذة فائقة السرعة 5 مل. إضافة 750 ميكرولتر (~ 0.5 مجلدات) HB إلى أنبوب microcentrifuge التي تحتوي على بيليه و resuspend بلطف بيليه. كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق الخطوات مرتين أخريين. تجمع كل supernatants (S1A وS1B) في نفس نابذة فائقة السرعة 5 مل أنبوب أعلاه. تخدم هذه الخطوة لإزالة الحطام صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع أجهزة الطرد المركزي S1 باستخدام نابذة فائقة السرعة مجهزة تعفن الدلو المتأرجحأو والطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء طاف (S2) لمزيد من المعالجة إذا كان جزء عصاري خلوي هو من مصلحة (على سبيل المثال لتحليل لطخة غربية). resuspend الكرية (P2)، وجزء الميتوكوندريا الخام، في 4 مل HB + 50 ملي بوكل. الطرد المركزي 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية في الدوار الدلو المتأرجح. تجاهل طاف و resuspend بلطف بيليه (P3) في 800 ميكرولتر HB. يتم غسلها الميتوكوندريا مع HB + 50 ملي بوكل لإزالة أي ملوثات غير محددة المرتبطة mitochondrially: ملاحظة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 5 مل أنبوب جديد نابذة فائقة السرعة، إضافة بالضبط 800 ميكرولتر من بيليه معلق (P3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لهذا الأنبوب إضافة 200 ميكرولتر من Iodixanol (التدرج الكثافة المتوسطة)، وبالتالي خلق تركيز النهائي من 12٪ Iodixanol. خلط محتويات الأنبوب بلطف، ولكن بدقة عبر pipetting لمع P1000. إضافة Iodixanol أولا، ومن ثم بيليه معلق (P3) قد يكون من الأفضل لتسهيل خلط دقيق. أجهزة الطرد المركزي في ULTracentrifuge مجهزة يتأرجح دلو الدوار في 17،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة: الكبد لا يحتوي على المايلين وبالتالي هذه الخطوة ليست ضرورية إذا كان يتم تجهيزها إلا الكبد. ومع ذلك، إذا يتم معالجة الكبد بالتزامن مع الميتوكوندريا CNS، فمن المستحسن لعلاج جميع الأنسجة بالتساوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طبقة المايلين في الجزء العلوي من الأنبوب وإزالة بعناية وتجاهل طاف. بيليه قد تكون فضفاضة. Resuspend وبيليه في 4 مل HB. الطرد المركزي مرة أخرى في 17،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 4 مل HB. تكرار الطرد المركزي وإزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية النهائي (P7) في 100-200 ميكرولتر HB ونقل إلى أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. تحتوي هذه العينة الميتوكوندريا المعزولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى البروتين الكمي. تمييع عينات والمنحنى القياسي في 2٪ دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) لضمان ذوبان كافية من الميتوكوندريا الدورينانوغرام البروتين الكمي. </li></ol> 3. Immunolabeling من الميتوكوندريا المعزولة عن التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل مزيج تلطيخ لفحصها، ماصة 25 ميكروغرام من الميتوكوندريا المعزولة في أنبوب 1.7 مل ميكروسنتريفوج. تشمل عينة غير ملوثين في كل تجربة. ولكل الأجسام المضادة، تأكد من تضمين عينة لisotype السيطرة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية في microcentrifuge مقعد بين كبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف و resuspend الميتوكوندريا المعزولة في 50 ميكرولتر الميتوكوندريا العازلة (M الاحتياطي) تستكمل مع 10٪ الدهنية حمض BSA مجانا لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (الخطوة حجب). ملاحظة: أثناء وضع العلامات، وأداء حضانات في الثلاجة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الأولية (أرنب المضادة للMfn2، 20 ميكروغرام لكل مل) في أنبوب واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: تحديد تركيز الأمثل لكل الأجسام المضادة تجريبيا بواسطة المعايرة. بسبب التباين في تركيز و / أو صurity، والكثير مختلفة من نفس الأجسام المضادة من نفس الشركة المصنعة قد يؤدي إلى نتائج مختلفة؛ وبالتالي هناك حاجة المعايرة لكل دفعة جديدة من الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الأجسام المضادة الأولية غير منضم: الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بلطف بيليه في 200 ميكرولتر M العازلة. الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 50 ميكرولتر M العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأجسام المضادة الثانوية (حمار المضادة للأرنب مفتش فيكوإيريترين (PE)، و 0.5 ميكروغرام لكل مل) في أنبوب واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الضد الثانوية غير منضم: الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 200 ميكرولتر M العازلة. الطرد المركزي في 17،000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر M العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان الأحداث في الميتوكوندريا الواقع، وصمة عار عزل الميتوكوندريا معالميتوكوندريا صبغة الفلورسنت معين لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. إذا كان المطلوب من المعلمات تلطيخ الفنية الأخرى (إمكانات عبر الغشاء الميتوكوندريا أو إنتاج الفائق)، انتقل إلى الخطوة 4. إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة 5 لاكتساب. ملاحظة: من المهم التحقق من أن طيف الانبعاث من الأجسام المضادة الثانوية متوافق مع أن من الأصباغ وظيفية. على سبيل المثال، إذا التحقق من نقاء الميتوكوندريا مع صبغة تجارية مع الخصائص الطيفية مماثلة لإمكانات FITC والغشاء مع Tetramethylrhodamine استر الميثيل (TMRM)، والضد الثانوية قابلة للحياة سيتم allophycocyanin (APC: تحويلة 650 نانومتر / إم 660 نانومتر). إضافة ضوابط التعويضات، أي عينة immunolabeled أو الملون مع fluorophore واحد، عندما المعمول به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب مناسبة لتدفق تحميل عداد الكريات. (لتسهيل صغر حجم العينة، يتم وضع أنبوب داخل عيار مكروي 3 مل تدفق عداد الكريات الأنبوب.) حافظ على عينات الجليد والشروع فوراتدفق عداد الكريات لاكتساب. </li></ol> 4. يعاير عبر الغشاء الميتوكوندريا الميتوكوندريا المحتملة وفوق الأكسيد الإنتاج عن طريق التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة لديها إمكانات عبر الغشاء سليمة بواسطة تلطيخ مع 100 نانومتر TMRM (تحويلة 548 نانومتر / إم 574 نانومتر) 5، في خطوة 3.8، لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. للمقارنة بين إمكانات عبر الغشاء بين العينات والسكان، واستخدام تركيزات أقل / تبريد غير TMRM من (1 إلى 30 نانومتر)، قد يكون أكثر ملاءمة 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كعنصر تحكم لTMRM تلطيخ، وصمة عار الميتوكوندريا المعزولة مع 100 نانومتر TMRM بحضور 100 ميكرومتر الكربونيل السيانيد م كلورو فينيل الهيدرازين (CCCP)، وuncoupler الميتوكوندريا التي سوف يزيل الاستقطاب الميتوكوندريا. تركيز CCCP المطلوبة ليزيل الاستقطاب الميتوكوندريا قد تكون أقل في حالة استخدام تركيزات أقل من الصبغة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من أن الميتوكوندريا المعزولة تنتج الفائق الميتوكوندريا بواسطة الحاديaining مع مؤشر مناسب الفائق الميتوكوندريا 7، كما في الخطوة 3.8، لمدة 15 دقيقة في RT، محمية من الضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كعنصر تحكم لإنتاج الفائق الميتوكوندريا، وصمة عار الميتوكوندريا المعزولة مع صبغة بحضور 10 ميكرومتر Antimycin A، مثبط لمجمع الثالث من السلسلة التنفسية التي من شأنها زيادة الانتاج الفائق الميتوكوندريا. </li></ol></li></ol> 5. اقتناء وتحليل Immunolabeled الميتوكوندريا المعزولة بواسطة التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الأداة حتى: تحويل الفولتية من الخطية إلى وضع تسجيل لتسهيل تحليل الميتوكوندريا المعزولة وتحديد الفولتية (FSC: 450، SSC: 250). ضمان أن يتم جمع الأحداث في FSC-A (منطقة) واسطة وكذلك FSC-W (العرض) وFSC-H (الارتفاع)، لتكون قادرة على استبعاد الحلل (أي حدثين، مرورا كشف في نفس الوقت ) في جمع ما بعد تحليل البيانات. تعيين عدد من الفعاليات التي سيتم جمعها إلى 100،000. اكتساب ضوابط التعويض، إن وجدت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البيانات: قبل الحصول على البيانات، وتجنب vortexing لعينات. مزيج بدلا من التنصت بلطف أنبوب. في البداية جمع الأحداث عند ضغط منخفض، خلال النابضة. البوابة على مجموع السكان. ضبط الفولتية من رسوم بيانية وفقا لذلك، عادة ذروة العينة غير ملوثين سوف تتوافق مع العقد الثاني (10 2). مرة واحدة يتم إنشاء البوابات، ويتم معالجتها العينات، يمكن أن تحول الضغط إلى الأعلى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل: تصور الحلل بواسطة بالتآمر FSC-W مقابل FSC. تحديد singlets والحلل. البوابة على singlets. تحديد السكان الميتوكوندريا المعزولة من قبل على الأحداث التي يتم الملون بشكل إيجابي مع صبغ الميتوكوندريا انتقائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد وضع العلامات الخلفية من isotype السيطرة. باستخدام عينة isotype السيطرة، وتحديد النسبة المئوية للسكان الميتوكوندريا وضع العلامات الإيجابية لMfn2 الأجسام المضادة. </li></ol>

<ol>
	<li>Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dynamics+in+neurodegeneration.">Mitochondrial dynamics in neurodegeneration.</a> Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).</li><li>Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+intracellular+organelle+function+using+fluorescent+probes:+from+animalcules+to+quantum+dots.">Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots.</a> Circ Res. 95, 239-252 (2004).</li><li>Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+association+of+misfolded+ALS-linked+mutant+SOD1+with+the+cytoplasmic+face+of+mitochondria.">Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).</li><li>Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+five+dimensions:+time-dependent+membrane+potentials+in+individual+mitochondria.">Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria.</a> Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).</li><li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient:+a+practical+usage+guide.">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50, 98-115 (2011).</li><li>Xu, X., Arriaga, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+determination+of+superoxide+release+at+both+sides+of+the+mitochondrial+inner+membrane+by+capillary+electrophoretic+analysis+of+the+oxidation+products+of+triphenylphosphonium+hydroethidine.">Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine.</a> Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).</li><li>Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+function+and+regulation+of+mitochondrial+fission.">New insights into the function and regulation of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+mitochondrial+heterogeneity+tell+us+about+mitochondrial+dynamics+and+autophagy.">What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy.</a> Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).</li><li>Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+damage+revealed+by+immunoselection+for+ALS-linked+misfolded+SOD1.">Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1.</a> Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).</li><li>Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamin-related+protein+1,+a+mediator+of+mitochondrial+fission,+in+apoptosis.">The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis.</a> Dev Cell. 1, 515-525 (2001).</li><li>West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS.">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li><li>Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalh&#227;es, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+pH+monitored+by+a+new+engineered+green+fluorescent+protein+mutant.">Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant.</a> J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).</li><li>Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria.">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).</li><li>Tantama, M., Martinez-Fran&#231;ois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio.">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4, 2550 (2013).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

ومن الواضح بشكل متزايد أن الميتوكوندريا هي اللاعبين الرئيسيين في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض العادي. بينما immunoblotting يمكن تحديد البروتينات التي توجد داخل الميتوكوندريا أو على سطح الميتوكوندريا في حالة معينة، وهذه الطريقة تقارير في المتوسط ​​من مجموع السكان. هذه ?...

الميتوكوندريا هي عضيات ديناميكية للغاية التي تخضع لجولات متعددة من الانشطار والانصهار، ويتم نقلها إلى مواقع من ارتفاع الطلب على الطاقة والاستجابة السريعة لمحفزات الفسيولوجية 1. لأنه يتزايد الاعتراف بأن الميتوكوندريا داخل الأنسجة المختلفة، مقصورات الخلوية حتى مختلفة، لديها ملامح وظيفية متميزة، وهناك حاجة إلى أساليب جديدة لتحديد هذه الميتوكوندريا مجموعات فرعية متميزة. يوفر المجهري وسيلة يمكن من خلالها تصور الميتوكوندريا الفردية ووجود بروتين في أو في الميتوكوندريا يمكن تحديده من خلال المناعي 2. ومع ذلك، والتحليل الكمي من هذا الأسلوب هو عمالة كثيفة وأكثر ملاءمة للتجارب باستخدام خطوط الخلايا خلد أو الأولية. دراسة الميتوكوندريا الفردية المستمدة من الأنسجة بشكل ملحوظ أكثر صعوبة ومعظم الطرق لا تسمح لسهولة تحديد مجموعات فرعية الميتوكوندريا بالتزامن مع evaluأوجه من وظيفة الميتوكوندريا 3. من أجل معالجة هذه العقبة، طريقة جديدة لimmunolabel الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها لاحقا من قبل التدفق الخلوي تم تطويره. وهذا يسمح للكشف السريع والكمي للبروتينات مترجمة إلى الغشاء الخارجي الميتوكوندريا، مما مقارنة التحليل المجهري، هو أقل بكثير كثيفة العمالة ويسمح تحليل الآلاف من الميتوكوندريا في عينة واحدة. ويمكن تطبيق هذا الاختبار لمراقبة مصير وقدر نسبي من الميتوكوندريا بروتينات الغشاء الخارجي التي يعتقد أن تكون موجودة جوهري في الميتوكوندريا، وتعيين من البروتينات على سطح الميتوكوندريا، أو الكشف عن البروتينات mislocalized إلى الميتوكوندريا في الحالات المرضية. وعلاوة على ذلك، فإن إدماج التقليدية الأصباغ الفلورية مؤشر يسمح بتقييم وقت واحد من جوانب معينة من وظيفة الميتوكوندريا في الميتوكوندريا متميزةمجموعات سكانية فرعية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1276">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:349px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:543px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:267px;">Rats</td>
			<td style="width:349px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;">Strain code 400</td>
			<td style="width:543px;">Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:349px;">Kontes Glass Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">885450-0022</td>
			<td>Duall 22</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall Legend Micro 17 R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:349px;">Beckman Coultier</td>
			<td style="width:119px;">344057</td>
			<td>Transparent, thin walled&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sorvall Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sorvall WX UltraSeries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">AH-650 rotor and buckets&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:267px;">Opti-prep</td>
			<td style="width:349px;">Axis-Shield</td>
			<td style="width:119px;">1114542</td>
			<td>Iodixanol, density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Fatty acid free Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8806</td>
			<td>Must be fatty acid free for mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Sodium succinate dibasic hexahydrate&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:267px;">Rabbit anti-Mitofusin2 antibody</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M6319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:267px;">Rabbit IgG</td>
			<td style="width:349px;">Jackson Immuno Research&#160;</td>
			<td style="width:119px;">011-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Anti-Rabbit IgG PE</td>
			<td style="width:349px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">12-4739-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Micro titer tube</td>
			<td style="width:349px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">223-9391</td>
			<td>For sample acquisition by flow cytometry&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoTrackerGreen (MTG)</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M7514</td>
			<td>100 nM: Ex490 nm/Em516 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">TMRM</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T668</td>
			<td>100 nM: Ex548 nm/Em574 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">CCCP</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">MitoSOX Red</td>
			<td style="width:349px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">M36008</td>
			<td>5 &#181;M: Ex540 nm/Em600 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">Antimycin A</td>
			<td style="width:349px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">LSR II flow cytometer</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">BS FACSDiva Software</td>
			<td style="width:349px;">BD</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:267px;">FlowJo</td>
			<td style="width:349px;">TreeStar Inc.&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software used for analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:267px;">BCA protein assay kit&#160;&#160;</td>
			<td style="width:349px;">Pierce/Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td style="width:543px;">Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunodetection of outer membrane proteins by flow cytometry of isolated mitochondria

طرق لكشف ورصد مكونات الميتوكوندريا البروتين الغشاء الخارجي في الأنسجة الحيوانية ضرورية لدراسة علم وظائف الأعضاء الميتوكوندريا والفيزيولوجيا المرضية. يصف هذا البروتوكول تقنية حيث يتم immunolabeled الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي. يتم عزل الميتوكوندريا من القوارض النخاع الشوكي وتعرض لخطوة تخصيب السريعة وذلك لإزالة النخاعين، ملوثا خطيرا الكسور الميتوكوندريا أعدت من النسيج العصبي. ثم وصفت الميتوكوندريا المعزولة مع الأجسام المضادة الاختيار ومجموعة الضد الثانوية مترافق fluorescently. تحليل التدفق الخلوي يتحقق نقاء النسبي الاستعدادات الميتوكوندريا بواسطة تلطيخ مع صبغة محددة الميتوكوندريا، تليها الكشف النوعي والكمي للبروتين immunolabeled. هذه التقنية هي سريعة، وقابلة للقياس الإنتاجية العالية، مما يسمح لتحليل مئات الآلاف من الميتوكوندريا في العينة. فإنه ينطبق على تقييم الرواية صroteins على سطح الميتوكوندريا تحت الظروف الفسيولوجية العادية وكذلك البروتينات التي قد تصبح mislocalized لهذه العضية خلال علم الأمراض. الأهم من ذلك، يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لمؤشر الأصباغ الفلورية أن يقدم تقريرا عن أنشطة بعض المجموعات السكانية الفرعية الميتوكوندريا وممكنا لالميتوكوندريا من الجهاز العصبي المركزي (الدماغ والحبل الشوكي)، وكذلك الكبد.

الميتوكوندريا المستمدة من الفئران النخاع الشوكي يمكن immunolabeled مع الأجسام المضادة التي تستهدف Mitofusin2 (Mfn2)، وهو بروتين المتورطين في الانصهار في الغشاء الخارجي للالميتوكوندريا 8. بعد العزلة ووضع العلامات مع الأجسام المضادة المحددة Mfn2 والضد الثانوية مترافق fluorescently?...

Watch this Scientific Journal Video about Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria at JoVE.com

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

الموصوفة هنا هي طريقة لكشف وقياس بروتينات الميتوكوندريا الغشاء الخارجي immunolabeling الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليل التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يمكن أن تمتد لتقييم الجوانب الفنية من مجموعات سكانية فرعية الميتوكوندريا.

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

immunodetection-outer-membrane-proteins-flow-cytometry-isolated

Research

JoVE Journal

Biology

15.4K Views.  Université de Montréal, CRCHUM.  الموصوفة هنا هي طريقة لكشف وقياس بروتينات الميتوكوندريا الغشاء الخارجي immunolabeling الميتوكوندريا المعزولة من أنسجة القوارض وتحليل التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يمكن أن تمتد لتقييم الجوانب الفنية من مجموعات سكانية فرعية الميتوكوندريا. 

Video: Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

استخدام روبوت لارتفاع الإنتاجية البلورة من بروتينات الغشاء في Mesophases شحمي

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

MitoCeption: نقل معزولة الإنسان MSC الميتوكوندريا إلى خلايا الجذعية ورم أرومي دبقي

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...