وقد تم تمويل هذا العمل من قبل NEI وNIMH.

1. VideoSwitcher 1.1. ربط VideoSwitcher إلى كمبيوتر وVideoSwitcher (الشكل 1) يتلقى الفيديو التناظرية (VGA) المدخلات وتستخدم لدفع أنبوب أشعة الكاثود (CRT) مراقبين اللون. قبل استخدام VideoSwitcher، تأكد من أن بطاقة الرسومات الكمبيوتر لديه أي منفذ VGA (الشكل 2A) أو واجهة بصرية رقمية (DVI-I) ميناء (الشكل 2B) التي تنقل كل من إشارات الفيديو الرقمية والتناظرية. محول DVI إلى VGA (الشكل 2C) ضروري لربط ميناء DVI-I إلى VideoSwitcher. إيقاف تشغيل الكمبيوتر، ورصد وفصل جهاز العرض من بطاقة رسومات الكمبيوتر. توصيل VGA أو منفذ DVI-I للكمبيوتر بطاقة الرسومات الى ميناء مدخلات VideoSwitcher باستخدام كابل VGA المقدمة. استخدام برنامج تشغيل برغي صغير لتأمين الاتصالات. توصيل كابل للشاشة VGA الى ميناء الناتج من 1 VideoSwitcherالثانية وتأمين الاتصالات. ربط VideoSwitcher إلى مصدر طاقة باستخدام محول الكهرباء المقدمة. تشغيل الكمبيوتر وجهاز العرض. 1.2. أوضاع العرض اثنين من وحدات التحويل والفيديو زر التبديل على VideoSwitcher يسمح للمستخدم التبديل ذهابا وإيابا في أوضاع العرض اثنين. في وضع اللون، وVideoSwitcher لا يغير من إشارة الفيديو من بطاقة رسومات الكمبيوتر. في وضع الرمادي، ويصبح العرض أحادية اللون، مع تحديد الإنارة في الغالب إشارة الفيديو من القناة الزرقاء في بطاقة الرسومات، وتأثرت بصورة طفيفة الإشارة من قناة أحمر، وأي مساهمة من قناة خضراء. وذلك لأن شبكة المقاوم داخل VideoSwitcher خفف من إشارة من القناة الحمراء من قبل عامل من نحو 128، وإشارة من قناة خضراء لا يسهم على الإطلاق. نسبة مساهمات الزرقاء 1ويسمى د قنوات أحمر إلى إخراج VideoSwitcher الأزرق إلى الأحمر نسبة (BRratio). وBRratio هو خاصية الجلاد الفيديو، بغض النظر عن إعداد العرض. ويمكن تحديد ذلك بشكل تجريبي لكل VideoSwitcher (انظر 1.3). ويمكن أيضا وضع العرض يمكن تبديل عن طريق إرسال إشارة خاصة من خلال قناة خضراء من بطاقة الرسومات باستخدام استدعاء دالة في Matlab: PsychVideoSwitcher (&#39;SwitchMode&#39;، whichScreen، ToGrayMode)؛ حيث ToGrayMode من 1 أو 0 وسيلة للانتقال إلى الرمادي أو وضع اللون. ويبين الشكل 3 التخطيطي لVideoSwitcher. 1.3. قياس BRratio يمكن قياس BRratio لكل VideoSwitcher استخدام مقضب موجة مربع مهمة الكشف. يتم تعيين مستويات اثنين من موجة مربع قيم RGB مثل (0، 0، 40) و (س، 0، 39) يمكن للمرء أن ضبط قيمة x حتى صريف موجة مربعيختفي، وعند هذه النقطة قيمة x هو BRratio --- ضخامة إشارة في قناة-R الذي يؤدي إلى كثافة التي تنتجها وحدة واحدة من الإشارات في قناة-B. على الرغم من أن يمكن لأحد أن يقيس BRratio إلكترونيا، على سبيل المثال لقياس نسبة من نواتج الجهد لVideoSwitcher في قيم RGB (0، 0، 255) و (255، 0، 0)، وطريقة النفسية الموصوفة هنا هو بسيط جدا و دقيقة. 1.4. عرض المعايرة بالنسبة لمعظم المراقبين، الإنارة العرض لا زيادة خطيا مع مستوى اللون الرمادي بكسل المحدد من قبل جهاز الكمبيوتر بطاقة رسومات. ويمكن وصف العلاقة على النحو التالي: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> حيث يتم تحديد حد أقصى L، L دقيقة و γ مع إجراء تصحيح غاما، إما عن طريق استخدام photometers أو من قبل مجموعة من الإجراءات النفسية والقياسات الضوئية 7،8. معايرة جاما مهمتي لانتاج التناقضات دقيقة على شاشة، ويجب أن يتم تنفيذ ذلك من أجل كل جهاز العرض. مع مضواء، يمكن للمرء ببساطة عرض مربع موحد كبير في graylevels بكسل مختلفة (على سبيل المثال، من 0 إلى 255)، وقياس الإنارة في وسط الميدان، وتناسب النتائج مع المعادلة 1 للحصول على γ. الإجراء النفسية تتضمن إنشاء، في منطقة واحدة من سطح المشاهدة، وموحدة كما مزيج محتمل (في المكان والزمان) من كميات متساوية من الصفر، وبكسل كامل كثافة وتحديد القيمة graylevel من بكسل في منطقة 1 متجانس المجاورة ( في كل بكسل التي لديها نفس الكثافة) التي تنتج مباراة النفسية إلى الإنارة في منطقة مختلطة بكسل. المباراة الأولى يحدد قيمة graylevel عن 1/2 من الإنارة أقصى. ويتم استخدام خليط من بكسل مع شدة الإنارة 1/2 و 1 لتحديد قيمة 3/4، ويتكرر هذا الإجراء حتى 7 و القيموقد تم تحديد القرص 1/8 إلى 7/8. وتتكرر هذه المباريات، ويتم إجراء الفحوصات المختلفة من أجل التناسق، مثل التحقق من أن مزيجا من 3/4 و 1/4 مباريات 1/2. في هذا الإجراء، يتم ضبط كل من وباء مستويات R من منطقة واحدة متجانسة، و U = B + R / BRratio يمكن أن يكون لائقا النتائج مع المعادلة 1 للحصول على γ. بعد نحصل على قيم دقيقة L، ماكس لام وγ، فإننا يمكن أن يحدد الإنارة الخلفية L 0 = (L ماكس + L دقيقة) / 2، والعلاقة بين ج تباين بكسل (U) بكسل واللون الرمادي يو مستوى هو: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> يمكننا كتابة المعادلة في حل لمستوى رمادي المطلوبة للحصول على النقيض الممنوحة: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="المعادلة 3" /> حيث يو عادة عددا غير صحيح. قيمة RGB من بكسل المقابلة هو: R = BRratio * [U-INT (U)]، G = 0، B =مادبا (U)، حيث كثافة العمليات () يأخذ قيمة عددية من مدخلاتها. 1.5. عرض من شرط لا يليق موجة يمكن أن يظهر أثر قرار الرمادي المتزايد من قبل المقارنة بين اثنين من حواجز شبكية موجة جيبية. صريف على اليسار يستخدم السعة الكاملة للVideoSwitcher مع كل شدة بكسل المحدد من قبل R المناسبة والقيم B. صريف على اليمين هو نفس واحد فقط اليسار إلا أنه يتم استخدام يو تقريب وقيمة B من كل بيكسل، ومحاكاة الناتج من جهاز عرض 8 بت. 2. RTbox 2.1. ربط RTbox إلى كمبيوتر ربط RTbox (الشكل 4) بمنفذ USB من جهاز كمبيوتر مع كابل المقدمة. إذا لزم الأمر، تحميل برنامج التشغيل للجهاز من <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . تثبيت برنامج التشغيل اتباع التعليمات على الموقع. 2.2. استخدام RTصندوق لقياس زمن الاستجابة يمكن استخدام RTbox بطريقتين مختلفتين. إذا كان البرنامج المستخدم من العودة موثوق مرات بداية من الحوافز، مثل الوقت أرجعها شاشة (&#39;فليب&#39;) وPsychPortAudio في Psychtoolbox [8]، ويمكن استخدامها في RTbox تماما مثل لوحة المفاتيح. لأن تستند مرات بداية من الحوافز والأوقات زر RTbox الساعات من الكمبيوتر المضيف وRTbox، على التوالي، يجب علينا أن تزامن الساعات اثنين. يتم ذلك مع وظيفة RTBox الدعوة (&#39;واضح&#39;) قبل بداية كل حافز لمسح الأحداث غير المرغوب فيها في المنطقة العازلة. ويمكن قياس زمن الاستجابة ببساطة التركيب = تي تي - تي بداية، حيث tonset هو حافز عاد من البرنامج المستخدم، و t هو الوقت زر إرجاعها بواسطة استدعاء دالة [T، زر] = RTBox (المهلة). وذلك لأن السائق RTBox يحول تلقائيا في المرة زر من الوقت RTbox لاستضافة وقت الكمبيوتر. إذا كان البرنامج المستخدم لا يمكن أنعودة موثوق مرات بداية من الحوافز، يجب توفير إشارات الزناد مشيرا onsets حافزا لRTbox. حل واحد هو استخدام جهاز استشعار للضوء للكشف عن بداية التحفيز أو تصحيحا الضوء الذي يتزامن مع التحفيز. يرتبط الناتج من جهاز استشعار الضوء الى ميناء ضوء RTbox. والحل الثاني هو استخدام الناتج الزناد من VideoSwitcher. ويمكن على الزناد مرتبطة مباشرة الى ميناء نبض RTbox. والحل الثالث هو لتوصيل إشارة الصوت من الكمبيوتر المضيف إلى منفذ صوت RTbox. لإنشاء الزناد بداية التحفيز من VideoSwitcher، ونحن &quot;تشغيل&quot; قناة خضراء من بكسل في الجزء المركزي من الإطار الأول من التحفيز البصري. لأنها لا تساهم في شبكة المقاوم، في إشارة قناة خضراء غير مرئية لهذا الموضوع. استدعاء دالة [T، زر] = RTBox (&#39;نبض&#39;، مهلة) إرجاع زمن الاستجابة، حيث &quot;نبض&quot; يرشد RTbox لحساب T<html> انه استجابة لوقت قريب على الزناد. ويستخدم في استدعاء دالة نفسه عن الزناد الصوت. لمشغلات استشعار الضوء، والدعوة هي وظيفة [T، زر] = RTBox (&quot;خفيف&quot;، مهلة). 3. دمج VideoSwitcher وRTbox وقد برمجت لدينا برنامج التظاهرة التي تستخدم VideoSwitcher للسيطرة على العرض، وRTbox لجمع دقيق زمن الاستجابة، وRTbox لإرسال رمز الحدث والاستجابة لنظام تخطيط موارد المؤسسات. ويمكن تحميل البرنامج من <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. صورة من وحدات التحويل الفيديو. لديها تجهيز مرئي المدخلات والمخرجات الموانئ (من الإناث)، زر للتبديل بين أوضاع العرض 2، ومنفذ الإخراج الزناد. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. صور VGA (أ) و DVI-I (B) ومنافذ DVI-I. إلى محول VGA (C) <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="الشكل (3)" /> الشكل 3. وتخطيطي من وحدات التحويل الفيديو. ومعدد وسائط اثنين من المدخلات، التي تسيطر عليها على مستوى الجهد. عندما يكون في وضع يظهر في التخطيطي، وقنوات RGB من جهاز استقبال إشارة نفسه، وبالتالي فإن العرض هو في صيغة درجات الرمادي. يتم توليد التيار الكهربائي من قبل شريحة والتحول CPLD، التي تسيطر عليها اشارات في قناة-G والزر التبديل. وتسيطر أيضا على الزناد من قبل الإدخال في قناة-G. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. صورة لRTbox. لديه منفذ USB-B، منفذ إدخال الضوء، منفذ الإدخال نبضة / الصوت، ومدخلا زر منفذ خارجي، ومنفذ الإخراج TTL.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وحدات التحويل والفيديو يوفر طريقة التعاقد، وغير مكلفة، وسهلة الاستخدام لتوليد عالية الدقة الإنارة يعرض التقليدية باستخدام الكمبيوتر بطاقات الرسومات وشاشات لون التناظرية. كان متصلا بين مخرجات التناظرية من بطاقة الرسومات والشاشة. فإنه يمكن أيضا التبديل بين أوضاع ا?...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

نظم العرض التقليدية القائمة على الكمبيوتر بطاقات الرسومات قادرة على توليد الصور مع 8 بت القرار على مستوى اللون الرمادي. ومع ذلك، فإن معظم التجارب في مجال البحوث تتطلب رؤية يعرض مع أكثر من 12 بت من قرار الإنارة. تتوفر العديد من الحلول. بت + + 1 و 2 DataPixx استخدام واجهة البصرية الرقمية (DVI) خرج من بطاقات الرسومات ودقة عالية (14 أو 16 بت) محولات الرقمية إلى تناظرية لدفع أجهزة العرض التمثيلي. وصفت 3 VideoSwitcher هنا يجمع بين إشارات الفيديو التناظرية من القنوات الأحمر والأزرق من بطاقات الرسومات مع مختلف الأوزان باستخدام شبكة المقاوم السلبي (4) ودائرة نشط لتقديم إشارات الفيديو مطابقة لثلاث قنوات من المراقبين اللون. الأسلوب يوفر وسيلة غير مكلفة لتمكين عالية الدقة يعرض أحادية اللون التقليدية باستخدام بطاقات الرسومات وشاشات التناظرية. يمكن أن توفر أيضا إشارات الزناد التي يمكن استخدامها للاحتفالonsets التحفيز، مما يجعل من السهل لمزامنة العروض البصرية مع التسجيلات الفيزيولوجية أو قياس زمن الاستجابة. على الرغم من أن كثيرا ما تستخدم لوحة مفاتيح الحاسوب والفئران في قياس زمن الاستجابة (RT)، من دقة هذه القياسات هي منخفضة جدا. وRTbox هي الأجهزة المتخصصة والحلول البرمجية لإجراء قياسات دقيقة RT. المتصلة بجهاز الكمبيوتر المضيف من خلال اتصال USB، وسائق RTbox متوافق مع جميع أنظمة التشغيل التقليدية. ويستخدم على مدار الساعة الصغري وعالية الدقة لتسجيل الهويات وتوقيت الأحداث زر، والتي يتم تخزينها مؤقتا حتى الكمبيوتر المضيف يسترد لهم. لا تتأثر الأحداث الزر التي سجلتها الشكوك توقيت المحتملة أو التحيز المرتبطة نقل ومعالجة البيانات في الكمبيوتر المضيف. التخزين غير متزامن يبسط إلى حد كبير في تصميم برامج المستخدم. العديد من الطرق المتاحة لمزامنة الساعات من RTbox والحواسيب المضيفةإيه. يمكن أيضا الحصول على RTbox المشغلات الخارجية ويمكن استخدامها لقياس RT فيما يتعلق بالأحداث الخارجية. كلا VideoSwitcher وRTbox متاحة للمستخدمين لشراء. ويمكن الاطلاع على المعلومات ذات الصلة وبرامج عديدة في مظاهرة <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers at JoVE.com

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

يمكن أن أجهزة الكمبيوتر التقليدية لا تولد مع محفزات بصرية عالية بما فيه الكفاية الرمادي أوقات الاستجابة القرار والتدبير بما يكفي من الدقة. ونحن تصف كيفية استخدام VideoSwitcher لانتاج عالية الدقة يعرض أحادية اللون، وRTbox لقياس زمن الاستجابة بدقة عالية على أجهزة الكمبيوتر التقليدية.

مما يعرض القرار السامي درجات الرمادي وقياسات دقيقة وقت الاستجابة على أجهزة الكمبيوتر التقليدية

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

enabling-high-grayscale-resolution-displays-accurate-response-time

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Neuroscience

Unit 1

Transient and Steady-state Response Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Views.  The Ohio State University. يمكن أن أجهزة الكمبيوتر التقليدية لا تولد مع محفزات بصرية عالية بما فيه الكفاية الرمادي أوقات الاستجابة القرار والتدبير بما يكفي من الدقة. ونحن تصف كيفية استخدام VideoSwitcher لانتاج عالية الدقة يعرض أحادية اللون، وRTbox لقياس زمن الاستجابة بدقة عالية على أجهزة الكمبي?...

Video: Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

والفحص عن عضوي النمط شريحة الوقت الفاصل بين التصوير عالية الدقة للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ بعد الولادة

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

نهج السريع إلى التصوير الإسفار عالية الدقة في الدماغ شرائح شبه سميكة

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي للطرق الدماغ المتوسط ​​الإنسان

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

في القياسات الكهربية فيفو على الأعصاب ماوس الوركي

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

الكشف عن Axonally المترجمة من mRNAs في أقسام المخ باستخدام عالية الدقة<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

عالية الدقة الهيكلي التصوير بالرنين المغناطيسي من تحت القشرة الإنسان<I&gt; في فيفو</I&gt; وتشريح الجثث

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

عالية الدقة التحليل الكمي Immunogold من غشاء المستقبلات في الشبكية نقاط الاشتباك العصبي الشريط

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

أثار الإجهاد خلية والموت عن طريق التقليدية للأشعة فوق البنفسجية ليزر متحد البؤر المجهر

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...