עבודה זו מומנה על ידי ניי ו NIMH.

1. VideoSwitcher 1.1. חבר VideoSwitcher למחשב VideoSwitcher (איור 1) מקבל אנלוגי (VGA) כניסות וידאו ומשמש לנהוג שפופרת קרן קתודית (CRT) מסכי צבע. לפני השימוש VideoSwitcher, לוודא את כרטיס גרפיקה ממוחשבת יש גם יציאת VGA (איור 2 א) או ממשק ויזואלי דיגיטלי (DVI-I) נמל (איור 2 ב) המעביר את שני אותות וידאו דיגיטליים ואנלוגיים. מתאם DVI ל-VGA (איור 2 ג) יש צורך לחבר את יציאת DVI-I ל VideoSwitcher. כבה את המחשב, למעקב לנתק את המסך מכרטיס גרפיקה ממוחשבת. חברו את יציאת ה-VGA או DVI-I של כרטיס גרפיקה ממוחשבת לנמל הקלט של VideoSwitcher באמצעות כבל VGA סיפק. השתמש מברג קטן כדי להבטיח את הקשרים. חיבור כבל ה-VGA של הצג ליציאת הפלט של VideoSwitcherND לאבטח את החיבורים. חבר את VideoSwitcher למקור חשמל באמצעות ספק הכוח המסופק. הפעל את המחשב ואת הצג. 1.2. שני מצבי תצוגה של וידאו switcher כפתור בורר על VideoSwitcher מאפשרת למשתמש לחזור-and-הלאה בשני מצבי תצוגה. במצב צבע, VideoSwitcher אינו משנה את אות וידאו מכרטיס גרפיקה ממוחשבת. במצב גווני אפור, המסך הופך להיות חד גוני, עם בהיקות שלו נקבע בעיקר על ידי אות וידאו מערוץ הכחול של כרטיס המסך, השפיעה מעט על ידי האות מערוץ אדום, ולא תרומה מן המסלול הירוק. הסיבה לכך היא רשת המתנגד בתוך VideoSwitcher פוחתת האות מערוץ אדום בפקטור של כ - 128, ואת האות מערוץ הירוק אינו תורם כלל. היחס בין התרומות של כחולד ערוצי אדומים לתפוקה של VideoSwitcher נקרא כחול על אדום תפעוליות (BRratio). BRratio הוא רכוש של Switcher וידאו, ללא הגדרת התצוגה. ניתן לקבוע באופן ניסיוני עבור כל VideoSwitcher (ראה 1.3). מצב תצוגה יכול גם להיות מופעל על ידי שליחת אות מיוחד דרך המסלול הירוק, של כרטיס המסך באמצעות קריאה לפונקציה ב-Matlab: PsychVideoSwitcher (&quot;SwitchMode&quot;, whichScreen, ToGrayMode); שם ToGrayMode של 1 או 0 באמצעים כדי לעבור בגווני אפור או מצב הצבע. איור 3 מציג את סכימטי של VideoSwitcher. 1.3. למדוד BRratio BRratio ניתן למדוד עבור כל VideoSwitcher באמצעות גל מרובע פומפיה המשימה זיהוי. שתי רמות של גל מרובע מוקצים ערכי RGB, כגון (0, 0, 40) ו - (x, 0, 39). אפשר לשנות את הערך של x עד הסורג גל מרובענעלם, ובנקודה ערך x הוא BRratio --- את גודל האות בערוץ-R המוביל עוצמה המיוצר על ידי יחידה אחת של האות בערוץ-B. אם כי אפשר למדוד את BRratio אלקטרונית, למשל למדוד את היחס בין התפוקות של מתח VideoSwitcher על ערכי RGB של (0, 0, 255) ו (255, 0, 0), שיטה פסיכו שתואר כאן הוא מאוד פשוט מדויק. 1.4. הצגת כיול עבור רוב המסכים, בהירות התצוגה אינו מעלה באופן ליניארי עם רמת אפור פיקסל מוגדר באמצעות כרטיס גרפיקה ממוחשבת. הקשר ניתן לתאר: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> איפה אני מקס, L דקות ו γ נקבעים בהליך תיקון גמא, או באמצעות photometers או על ידי שילוב של נהלים פסיכופיסיות ומדידות photometric 7,8. כיול גמא היא importanלא לייצר ניגודים מדויקים על הצג, אלא יש לבצע עבור כל התקן התצוגה. עם פוטומטר, אפשר פשוט להציג מרובע מדי גדול graylevels פיקסלים שונים (למשל, מ 0 עד 255), למדוד את עוצמת ההארה של מרכז הכיכר, ולהתאים את התוצאות עם משוואה 1 להשיג γ. ההליך כרוך ביצירת פסיכו, בתחום אחד של משטח הצפייה, כמו מדים כתערובת אפשרית (במרחב ובזמן) של כמויות שוות של אפס לבין עוצמת מלא פיקסלים בקביעת ערך graylevel של פיקסלים באזור הסמוך הומוגנית ( שבו כל הפיקסלים יש את העוצמה אותה) המייצרת התאמה פסיכו כדי בהיקות של אזור מעורב פיקסל. במשחק הראשון קובע את הערך graylevel עבור 1/2 של בהירות מקסימלית. תערובת של פיקסלים עם עוצמות בהיקות 1/2 1 משמש כדי לקבוע את הערך 3/4, ועל הליך זה חוזר על עצמו עד שבעה ערכים פריץROM 1/8 to 7/8 נקבעו. התאמות אלה חוזרים על עצמם, בדיקות שונות עקביות עשויים, כגון אימות כי תערובת של 3/4 ו 1/4 משחקים 1/2. בהליך זה, הן ב &#39;ורמות מחקר של האזור הומוגנית מותאמים, ו-U = B + R / BRratio. את התוצאות ניתן להתאים את המשוואה 1 להשיג γ. לאחר נקבל ערכים של L דקות, L מקס γ, אנו יכולים להגדיר את בהירות הרקע L 0 = (L + L max min) / 2, לעומת זאת הקשר בין ג פיקסל (U) ו פיקסל ברמת אפור U הוא: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> אנחנו יכולים לשכתב את המשוואה כדי לפתור את רמת האפור הנדרשת לעומת נתון: <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="המשוואה 3" /> שם U הוא בדרך כלל מספר לא שלם. ערך RGB של הפיקסל המתאים הוא: R = BRratio * [U-int (U)], G = 0, B =int (U), כאשר int () לוקח מספר שלם של הקלט שלה. 1.5. הדגמה של פומפיה גל סינוס ההשפעה של ההחלטה בגווני אפור יותר ניתן להראות על ידי השוואת שני גלי סינוס gratings. פומפיה משמאל משתמש תפוסה מלאה של VideoSwitcher בעוצמה כל פיקסל שצוין על ידי R מתאים ערכים ב &#39;. הסורג מימין היא זהה לזו השמאלית אלא רק U מעוגל משמש כערך ב &#39;של כל פיקסל, מחקה את הפלט של המכשיר 8-bit התצוגה. 2. RTbox 2.1. חבר את RTbox למחשב חבר את RTbox (איור 4) ליציאת ה-USB של המחשב באמצעות כבל מסופק. במידת הצורך, להוריד את מנהל ההתקן של המכשיר מ <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . להתקין את מנהל ההתקן ביצוע ההוראות המופיעות באתר. 2.2. השתמש RTתיבת למדוד את זמן התגובה RTbox ניתן להשתמש בשתי דרכים שונות. אם התוכנית של המשתמש יכול לחזור אמינים התפרצות גירוי הזמנים, כגון זמן חזר על ידי מסך (&quot;הפוך&quot;) ו PsychPortAudio ב Psychtoolbox [8], RTbox ניתן להשתמש בדיוק כמו המקלדת. בגלל התפרצות גירוי הזמנים והשעות RTbox כפתור מבוססים השעונים של המחשב המארח RTbox, בהתאמה, צריך לסנכרן את שני השעונים. זה נעשה עם RTBox פונקציה שיחה (&#39;ברור&#39;) לפני תחילת כל גירוי כדי לנקות אירועים לא רצויים במאגר. זמן התגובה ניתן למדוד פשוט לא שו&quot;ת = T - התחלה לא, שם tonset הוא גירוי חזר מתוכנית המשתמש, ו-T הוא הזמן חזר על כפתור הקריאה לפונקציה [t, לחצן] = RTBox (פסק זמן). הסיבה לכך היא כי הנהג RTBox ממיר באופן אוטומטי את הזמן על כפתור מרגע RTbox לארח את זמן המחשב. אם התוכנית של המשתמש יכוללחזור אמינים התפרצות פעמים תמריצים, אותות המעידים על ההדק onsets גירוי יש לספק RTbox. פתרון אחד הוא להשתמש חיישן אור כדי לזהות את הופעת גירוי או תיקון אור מסונכרן לגירוי. הפלט של חיישן האור מחובר ליציאת לאור RTbox. הפתרון השני הוא להשתמש בפלט ההדק של VideoSwitcher. טריגר יכול להיות מחובר ישירות ליציאת הדופק של RTbox. הפתרון השלישי הוא לחבר את אות השמע של המחשב המארח ליציאת קול RTbox. כדי ליצור הופעת גירוי ההדק מ VideoSwitcher, אנחנו &quot;להפעיל את&quot; המסלול הירוק של הפיקסלים בחלק המרכזי של המסגרת הראשונה של גירוי חזותי. כי זה לא תורם לרשת הנגד, את האות בערוץ הירוק הוא בלתי נראה לנושא. קריאה לפונקציה [t, לחצן] = RTBox (&quot;דופק&quot;, פסק זמן) מחזירה את זמן התגובה, איפה הדופק &quot;מורה RTbox לחשב t<html> הוא בתגובה יחסית זמן ההדק. שיחת אותה פונקציה משמש ההדק קול. עבור טריגרים חיישן אור, קריאה לפונקציה היא [t, לחצן] = RTBox (&#39;אור&#39;, פסק זמן). 3. שלב VideoSwitcher ו RTbox יש לנו תוכנית תוכנית הפגנה המשתמשת VideoSwitcher לשלוט על התצוגה, RTbox לאסוף את זמן התגובה מדויק RTbox לשלוח קוד האירוע והתגובות למערכת ה-ERP. התוכנית ניתן להוריד מאתר <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תמונה של switcher וידאו. יש לו כניסת VGA ויציאות תפוקה (הן נשים), כפתור לעבור בין שני מצבי תצוגה, וכן יציאת פלט ההדק. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="איור 2" /> באיור 2. תמונות של VGA () ו-DVI-I (ב &#39;) יציאות DVI-I מתאם VGA (ג). <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. סכימטי של switcher וידאו. מרבב יש שני מצבי קלט, הנשלט על ידי רמת מתח. כאשר הוא נמצא במצב המוצג סכמטית, את ערוצי RGB של המסך לקבל את האות אותו דבר, אז המסך נמצא במצב גווני אפור. מתח מיתוג מופק על ידי שבב CPLD, שבשליטת אותות בערוץ-G ואת כפתור בורר. ההדק נשלטת גם על ידי הזנה בערוץ-G. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תמונה של RTbox. יש לו יציאת USB-B, יציאת קלט אור, נמל הדופק / קול קלט, נמל חיצוני קלט כפתור, יציאת פלט TTL.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

וידאו switcher מספק שיטה קומפקטי, זול, קל לשימוש ליצור רזולוציה בהירות גבוהה מציג קונבנציונאלי באמצעות גרפיקה ממוחשבת כרטיסי וצגים צבע אנלוגיים. הוא מחובר בין אנלוגי פלטי של כרטיס המסך ואת הצג. זה גם יכול לעבור בין מצבי תצוגה מעומעמות ו כרומטית, לספק נוחות נוספת. ערוץ ההד...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

מערכות תצוגה המבוססות על כרטיסים גרפיים רגילים מחשב מסוגלים ליצור תמונות עם רזולוציה 8-bit רמת אפור. עם זאת, רוב הניסויים במחקר החזון דורשות מציג עם יותר מ 12 ביטים של רזולוציה בהירות. כמה פתרונות זמינים. קצת + + 1 ו - 2 DataPixx להשתמש חזותי דיגיטלי (DVI) פלט ממשק מכרטיסי גרפיקה ברזולוציה גבוהה (14 או 16-bit) Digital-to-הממירים האנלוגיים לנהוג להציג מכשירים אנלוגיים. 3 VideoSwitcher המתואר כאן משלב אותות וידאו אנלוגיים מן הערוצים אדום וכחול של כרטיסי מסך עם משקלים שונים באמצעות רשת המתנגד פסיבית 4 ו מעגל פעיל כדי לספק אותות וידאו זהים לשלושת ערוצי צגים צבעוניים. השיטה מספקת דרך זולה לאפשר בתצוגות ברזולוציה גבוהה מעומעמות באמצעות קונבנציונאלי כרטיסים גרפיים וצגים אנלוגיים. זה גם יכול לספק אותות ההדק, שניתן להשתמש בהם כדי לסמןגירוי onsets, מה שהופך אותו קל לסנכרן הצגה ויזואלית עם הקלטות פיזיולוגיים או מדידות זמן התגובה. למרות מקלדות ועכברים מחשבים משמשים לעתים קרובות במדידת זמני תגובה (RT), את הדיוק של מדידות אלו היא נמוכה למדי. RTbox הוא חומרה מיוחדת ו פתרון תוכנה עבור מדידות מדויקות RT. מחובר למחשב המארח דרך חיבור USB, נהג RTbox תואם את כל מערכות ההפעלה המקובלות. היא משתמשת בשעון המיקרו ו ברזולוציה גבוהה כדי להקליט את זהותם ואת משך הזמן של האירועים כפתור, אשר שנאגרו עד המחשב המארח מאחזר אותם. האירועים כפתור שנרשמו אינם מושפעים הוודאות תזמון פוטנציאליים או דעות קדומות הקשורות העברת נתונים ועיבוד של המחשב המארח. אחסון אסינכרוני מאוד מפשט את העיצוב של תוכניות המשתמש. קיימות מספר שיטות כדי לסנכרן את השעונים של RTbox ו comput מארחאה. RTbox יכול לקבל גם גורמים חיצוניים להשתמש כדי למדוד RT בנוגע לאירועים חיצוניים. שניהם VideoSwitcher ו RTbox זמינים למשתמשים לרכוש. מידע רלוונטי תוכניות הדגמה רבים ניתן למצוא בכתובת <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers at JoVE.com

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

חומרת מחשב רגיל לא יכול ליצור גירויים חזותיים עם גווני אפור ברזולוציה גבוהה מספיק ולמדוד זמני תגובה עם דיוק מספקת. אנו מתארים כיצד להשתמש VideoSwitcher לייצר בתצוגות ברזולוציה גבוהה בצבע אחיד, מלוות ו RTbox למדוד זמני תגובה עם דיוק גבוה על חומרת המחשב קונבנציונאלי.

הפעלת גווני אפור מציג ברזולוציה גבוהה ומדויקת זמן תגובה מדידות על במחשבים רגילים

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

enabling-high-grayscale-resolution-displays-accurate-response-time

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Neuroscience

Unit 1

Transient and Steady-state Response Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K Views.  The Ohio State University. חומרת מחשב רגיל לא יכול ליצור גירויים חזותיים עם גווני אפור ברזולוציה גבוהה מספיק ולמדוד זמני תגובה עם דיוק מספקת. אנו מתארים כיצד להשתמש VideoSwitcher לייצר בתצוגות ברזולוציה גבוהה בצבע אחיד, מלוות ו RTbox למדוד זמני תגובה עם דיוק גבוה על חומרת המחשב קונבנציונאלי.

Video: Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

Assay Slice Organotypic עבור זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה נדידת הנוירונים במוח אחרי לידה

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

גישה מהירה הדמיה ברזולוציה גבוהה הקרינה חצי עבה פרוסות המוח

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

במדידות Vivo אלקטרו על עצבים העכבר השת

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

הדמיית תהודה מגנטית מבנית ברזולוציה גבוהה של תת-הקליפה&quot; האדם<I&gt; In vivo</I&gt; ולאחר המוות

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

ניתוח ברזולוציה גבוהה כמותי immunogold של קולטני קרום ב סינפסות רצועת הכלים רשתית

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...