이 작품은 네이와 NIMH에 의해 재정 지원되었다.

1. VideoSwitcher 1.1. 컴퓨터에 VideoSwitcher를 연결 VideoSwitcher (그림 1)은 아날로그 비디오 (VGA) 입력을 받아 음극 선관 (CRT) 컬러 모니터를 운전하는 데 사용됩니다. VideoSwitcher를 사용하기 전에, 컴퓨터 그래픽 카드 중 VGA 포트 (그림 2A) 또는 디지털 비주얼 인터페이스 (DVI-I)을 모두 디지털 및 아날로그 비디오 신호를 전송 포트 (그림 2B)를 가지고 있는지 확인하십시오. DVI 대 VGA 어댑터 (그림 2C)은 VideoSwitcher에 DVI-I 포트를 연결할 필요가 있습니다. 컴퓨터를 끄고 컴퓨터의 그래픽 카드에서 모니터를 모니터링하고 분리하십시오. 제공된 VGA 케이블을 사용하여 VideoSwitcher의 입력 포트에 VGA 또는 컴퓨터 그래픽 카드의 DVI-I 포트를 연결합니다. 연결을 확보하기 위해 소형 나사 드라이버를 사용하십시오. VideoSwitcher의 출력 포트에 모니터의 VGA 케이블을 연결합니다ND는 연결을 확보. 제공된 전원 어댑터를 사용하여 전원 VideoSwitcher를 연결합니다. 컴퓨터와 모니터를 켜십시오. 1.2. 비디오 스위처의 두 가지 디스플레이 모드 VideoSwitcher의 스위치 버튼은 사용자가 두 개의 디스플레이 모드에서 다시 앤 변경할 수 있습니다. 컬러 모드에서 VideoSwitcher는 컴퓨터 그래픽 카드에서 비디오 신호를 변경하지 않습니다. 그레이 스케일 모드에서는 디스플레이가 약간 빨간색 채널의 신호에 의해 영향을 그래픽 카드의 푸른 채널, 그리고 녹색 채널로부터 기여로부터 비디오 신호에 의해 주로 결정의 휘도로, 단색이된다. VideoSwitcher 내부 저항 네트워크 전혀 기여하지 않는 128 약 계수, 그리고 녹색 채널의 신호에 의해 적색 채널에서 신호를 attenuates 때문입니다. 파란의 기부금의 비율VideoSwitcher의 출력으로 D 빨강 채널 블루 - 투 - 붉은 비율 (BRratio)이라고합니다. BRratio는 디스플레이 설정의 독립적인 비디오 스위처의 재산입니다. 그것은 각 VideoSwitcher (1.3 참조)에 대해 실험적으로 결정하실 수 있습니다. 디스플레이 모드는 또한 Matlab의 함수 호출을 사용하여 그래픽 카드의 녹색 채널을 통해 특별한 신호를 보내는 방식으로 전환한 수있다 : PsychVideoSwitcher ( &#39;SwitchMode&#39;, whichScreen, ToGrayMode); 어디 1 또는 0 수단 ToGrayMode 그레이 스케일이나 컬러 모드로 전환합니다. 그림 3은 VideoSwitcher의 개략도를 보여줍니다. 1.3. BRratio 측정 BRratio는 사각형 웨이브 격자 탐지 작업을 사용하여 각 VideoSwitcher에 대해 측정할 수 있습니다. 광장 파도의 두 가지 수준 같은 (0, 0, 40)와 같은 RGB 값을 할당하고 (X, 0, 39). 있습니다 하나는 사각 파 격자까지 X의 값을 조정할 수 있습니다어느 시점에서 X 값이 BRratio입니다 --- B 채널의 신호 중 하나를 단위로 생산되는 강도로 연결 R 채널의 신호의 크기, 사라집니다. 한 전자 BRratio를 측정할 수 있지만, RGB의의 값 (0, 0, 255) 및 (255, 0, 0)에서 VideoSwitcher의 전압 출력의 비율을 측정하기 위해 예를 들어, 여기에 설명된 psychophysical 방법은 매우 간단하며 정확하게. 1.4. 보정 표시 대부분의 모니터의 경우, 표시 휘도는 컴퓨터 그래픽 카드에 의해 지정된 픽셀의 그레이 레벨로 선형적으로 증가하지 않습니다. 관계이라고 할 수있다 : <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq1.jpg" alt="등식 1" /> 내가 어디 최대, L 분, γ는 어느 photometers를 사용하거나 psychophysical 절차 및 광도계의 측정 7,8의 조합에 의해, 감마 보정 절차와 결정됩니다. 감마 교정 importan입니다디스플레이에 정확한 대조를 생산하기 위해 t, 그것은 각 디스플레이 장치를 위해 수행되어야합니다. 광도계를 통해 하나가 단순히 서로 다른 픽셀 graylevels (예, 0부터 255까지)에 대규모의 균일한 사각형을 표시할 수, 사각형의 중심의 휘도를 측정하고, γ를 얻기 위해 수식 1의 결과를 맞습니다. psychophysical 절차는 제로 및 풀 강도 픽셀과 인접한 균질 영역에서 픽셀의 graylevel 가치를 결정하는 동등한 양의 가능한 혼합 (공간과 시간에 ()로 균일한으로 볼 표면의 한 분야에서 창조를 포함 있는 모든 픽셀은 혼합 픽셀 영역의 휘도에 psychophysical 일치가 생성) 같은 강도 있습니다. 첫 번째 경기는 최대 휘도의 1 / 2 graylevel 값을 결정합니다. 휘도 농도 2분의 1과 1 픽셀의 혼합물은 4분의 3 가치를 결정하는 데 사용되며,이 절차가 반복 때까지 일곱 값 F롬 팔분의 일 to 팔분의 칠이 결정되었습니다. 이러한 일치가 반복되며, 일관성을위한 다양한 검사 같은 확인으로 만들어진 그 4분의 3 및 4분의 1 경기 2분의 1의 혼합물. 이 절차에서는 B와 균질 지역의 R 레벨 모두가 조정되며, U = B + R / BRratio. 결과는 γ를 얻기 위해 수식 1로 들어갈 수 있습니다. 우리가 패 분, L 맥스와 γ의 가치를 얻는 후, 우리는 L 0 = (패 최대 + L 분) / 2, 픽셀 대조 C (U) 및 픽셀 회색 수준의 U 사이의 관계는 배경 휘도를 설정할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq2.jpg" alt="등식이" /> 우리는 주어진 대조에 필요한 회색 레벨을위한 해결하기 위해 방정식을 다시 작성할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/3312/3312eq3.jpg" alt="등식 3" /> U는 일반적으로 아닌 정수입니다. 해당 픽셀의 RGB 값은 다음과 같습니다 : R = BRratio * [U-INT (U)], G = 0, B =INT는 ()의 입력의 정수 값을 걸립니다 INT (U). 1.5. 사인 파 격자의 데모 증가 회색조 해상도의 영향은 두 개의 사인 웨이브 gratings을 비교하여 표시 할 수 있습니다. 왼쪽에있는 격자는 적절한 R과 B 값에 의해 지정된 각 픽셀 강도로 VideoSwitcher의 전체 용량을 사용합니다. 오른쪽의 격자만이 둥근 U는 8 비트 디스플레이 장치의 출력을 흉내낸, 각 픽셀의 B 값으로 사용됩니다 제외 왼쪽 것과 동일합니다. 2. RTbox 2.1. 컴퓨터에 RTbox를 연결 제공된 케이블로 컴퓨터의 USB 포트에 RTbox합니다 (그림 4)에 연결합니다. 필요한 경우에서 장치의 드라이버를 다운로드 <a href="http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm">http://www.ftdichip.com/Drivers/VCP.htm</a> . 웹 사이트의 지시에 따라 드라이버를 설치합니다. 2.2. RT를 사용응답 시간을 측정하기위한 상자 RTbox는 두 가지 다른 방법으로 사용할 수 있습니다. 사용자의 프로그램과 같은 화면에서 반환 시간과 같은 신뢰할 수있는 자극 발병 시간을 되돌릴 수있다면하는 것이 Psychtoolbox에서 ( &#39;플립&#39;)와 PsychPortAudio [8] RTbox 방금 키보드처럼 사용할 수 있습니다. 자극 발병 시간 및 RTbox 버튼 시간은 호스트 컴퓨터와 RTbox의 시계를 기반으로하기 때문에, 각각, 우리는 두 개의 시계를 동기화해야합니다. 이것은 버퍼에 원치 않는 이벤트를 지우려면 각 자극 발병 이전 함수 호출 RTBox ( &#39;맑은&#39;)로 이루어집니다. 응답 시간은 단순히 측정할 수 t resp = t - T의 tonset는 사용자 프로그램에서 반환되는 자극이다 발병, 그리고 t는 함수 호출 [T 버튼]에 의해 반환된 버튼 시간 = RTBox (시간 초과). RTBox 드라이버가 자동으로 컴퓨터 시간을 호스팅 RTbox 시간에서 버튼 시간을 변환하기 때문입니다. 사용자의 프로그램이 불가능하다면신뢰할 수있는 자극 발병 시간을 반환, 경기 부양 onsets을 나타내는 트리거 신호 RTbox에게 제공해야합니다. 하나의 솔루션 자극의 발병이나 자극에 동기화됩니다 빛을 패치를 감지하는 광 센서를 사용하는 것입니다. 빛 센서의 출력은 RTbox의 빛을 포트에 연결되어 있습니다. 두 번째 솔루션은 VideoSwitcher의 트리거 출력을 사용하는 것입니다. 트리거는 직접 RTbox의 펄스 포트에 연결될 수 있습니다. 세 번째 해결책은 RTbox의 소리 포트로 호스트 컴퓨터의 오디오 신​​호를 연결하는 것입니다. VideoSwitcher에서 자극 증상 트리거를 생성하기 위해, 우리는 시각적 자극의 첫 번째 프레임의 중앙 부분에있는 픽셀의 녹색 채널 &quot;켜십시오.&quot; 그것이 저항 네트워크에 기여하지 않기 때문에, 녹색 채널에 신호가 사정에 보이지 않는 것입니다. 함수 호출 [T 버튼] &#39;펄스&#39;가 T를 계산하는 RTbox 지시 어디 = RTBox는 ( &#39;펄스&#39;, 시간 제한), 응답 시간을 반환<html> 그는 트리거에 상대적인 시간을 응답. 동일한 함수 호출은 사운드 트리거에 사용됩니다. 광 센서 트리거의 경우 함수 호출은 [T 버튼]입니다 = RTBox (시간 초과, &#39;빛&#39;). 3. VideoSwitcher 및 RTbox 통합 우리는 디스플레이, 정확한 응답 시간을 수집 RTbox 및 ERP 시스템에 이벤트 코드와 응답을 보낼 RTbox을 제어할 VideoSwitcher를 사용하는 데모 프로그램을 프로그래밍했습니다. 프로그램에서 다운로드할 수 있습니다 <a href="http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m">http://lobes.usc.edu/videoswitcher/VideoSwitcherRTBoxERP_demo.m</a> . 4. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 비디오 스위처의 그림. 그것은 VGA 입력 및 출력 포트 (모두 여성), 두 디스플레이 모드를 전환할 수있는 버튼과 트리거 출력 포트가 있습니다. ontent &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig2.jpg" alt="그림 2" /> VGA ()과 DVI-I (B) 포트와 DVI-I VGA 어댑터 (C)합니다.의 그림 2. 사진 <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 비디오 스위처의 개략도. 멀티플렉서는 전압 레벨에 의해 제어되는 두 입력 모드를 가지고 있습니다. 그것은 설계도에 표시된 모드에있을 때, 모니터의 RGB 채널이 동일한 신호를 수신, 표시 모드를 그레이 스케일에 있으므로. 스위칭 전압은 G-채널 및 스위치 버튼의 신호에 의해 제어 CPLD 칩에 의해 생성됩니다. 트리거는 또한 G-채널의 입력에 의해 제어됩니다. <img src="/files/ftp_upload/3312/3312fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. RTbox의 그림. 그것은 USB-B 포트, 광 입력 포트, 펄스 / 사운드 입력 포트, 외부 버튼의 입력 포트 및 TTL 출력 포트를 가지고 있습니다.

<ol>
	<li>Li, X., Lu, Z. -. L., Xu, P., Jin, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+high+gray-level+resolution+monochrome+displays+with+conventional+computer+graphics+cards+and+color+monitors.">Generating high gray-level resolution monochrome displays with conventional computer graphics cards and color monitors.</a> Journal of Neuroscience Methods. 130 (1), 9-18 (2003).</li><li>Pelli, D. G., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+control+of+contrast+on+microcomputer+displays.">Accurate control of contrast on microcomputer displays.</a> Vision Research. 31, 1337-1350 (1991).</li><li>Li, X., Liang, Z., Kleiner, M., Lu, Z. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RTbox:+A+device+for+highly+accurate+response+time+measurements.">RTbox: A device for highly accurate response time measurements.</a> Behavior Research Methods. 42 (1), 212-225 (2010).</li><li>Lu, Z. L., Sperling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-order+reversed+phi.">Second-order reversed phi.</a> Perception Psychophysics. 61, 1075-1088 (1999).</li><li>Colombo, E., Derrington, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+calibration+of+CRT+monitors.">Visual calibration of CRT monitors.</a> Displays. 22, 87-95 (2001).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

비디오 스위처는 높은 휘도 해상도가 기존의 컴퓨터 그래픽 카드 및 아날로그 컬러 모니터를 사용하여 표시 생성, 소형 저렴하고 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 이것은 그래픽 카드와 모니터의 아날로그 출력 사이에 연결됩니다. 그것은 또한 추가적인 편의를 제공 단색 및 반음계 디스플레이 모드 사이를 전환할 수 있습니다. 그것의 트리거 채널 연구자 시각적 디스플레이에 다른 장비를 동?...

enabling high grayscale resolution displays and accurate response time measurements on conventional computers

기존의 컴퓨터 그래픽 카드를 기반으로 디스플레이 시스템은 8 비트 그레이 레벨 해상도로 이미지를 생성할 수 있습니다. 그러나 비전 연구에 대부분의 실험은 휘도 해상도 이상의 12 비트로 디스플레이를 필요로합니다. 몇 가지 솔루션이 있습니다. 비트 + + 1과 DataPixx 2 아날로그 디스플레이 장치를 운전 (14 또는 16 비트) 디지털 - 아날로그 변환기 그래픽 카드와 고해상도의 디지털 비주얼 인터페이스 (DVI) 출력을 사용합니다. VideoSwitcher 3 수동적 저항 네트워크 4 컬러 모니터의 세 채널에 동일한 비디오 신호를 전달하는 능동 회로를 사용하여 서로 다른 가중치와 그래픽 카드의 적색과 청색 채널에서 아날로그 비디오 신호를 결합하여 여기에 설명했다. 방법은 기존의 그래픽 카드와 아날로그 모니터를 사용하는 고해상도 단색 디스플레이를 활성화하기 위해 저렴한 방법을 제공합니다. 또한 표시하는 데 사용할 수있는 트리거 신호를 제공할 수자극 onsets, 쉽게 생리적 녹음이나 응답 시간 측정과 함께 시각적인 디스플레이를 동기화하기. 컴퓨터 키보 드나 마우스를 자주 응답 시간 (RT)을 측정에 사용되고 있지만, 이러한 측정의 정확도가 매우 낮습니다. RTbox 정확한 RT 측정을위한 전문 하드웨어 및 소프트웨어 솔루션입니다. USB 연결을 통해 호스트 컴퓨터에 연결되어 RTbox의 드라이버는 모든 기존 운영 체제와 호환됩니다. 이것은 호스트 컴퓨터들을 검색 때까지​​ 버퍼되는 버튼 이벤트의 정체성과 타이밍을 기록하기 위해 마이크로 프로세서와 고해상도 클럭을 사용합니다. 기록된 버튼 이벤트는 잠재적인 타이밍 불확실성이나 호스트 컴퓨터에 데이터 전송 및 처리와 관련된 편견에 의해 영향을받지 않습니다. 비동기 스토리지는 크게 사용자 프로그램의 디자인을 단순화합니다. 몇 가지 방법 RTbox의 클럭과 호스트 comput를 동기화하는 데 사용할 수음. RTbox 또한 외부 트리거를받을 수 있으며, 외부의 사건과 관련하여 RT를 측정하는 데 사용됩니다. VideoSwitcher 및 RTbox 모두 사용자가 구입할 수 있습니다. 관련 정보와 다양한 시연 프로그램에서 찾을 수 <a href="http://lobes.usc.edu/">http://lobes.usc.edu/</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers at JoVE.com

Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

기존 컴퓨터 하드웨어 충분한 정확도와 해상도와 측정 응답 시간을 그레이 스케일 충분히 높은과 시각적 자극을 생성할 수 없습니다. 우리는 고해상도 단색 디스플레이를 생산하는 VideoSwitcher, 그리고 기존의 컴퓨터 하드웨어에서 높은 정확도와 응답 시간을 측정하는 RTbox를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

사용 높음 - 해상도 디스플레이와 종래의 컴퓨터에 정확한 응답 시간 측정 그레이 스케일

Display systems based on conventional computer graphics cards are capable of generating images with 8-bit gray level resolution. However, most experiments ...

enabling-high-grayscale-resolution-displays-accurate-response-time

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Electrical Engineering

Neuroscience

Unit 1

Transient and Steady-state Response Analysis

SCIENTISTS IN ACTION

9.3K 조회수.  The Ohio State University. 기존 컴퓨터 하드웨어 충분한 정확도와 해상도와 측정 응답 시간을 그레이 스케일 충분히 높은과 시각적 자극을 생성할 수 없습니다. 우리는 고해상도 단색 디스플레이를 생산하는 VideoSwitcher, 그리고 기존의 컴퓨터 하드웨어에서 높은 정확도와 응답 시간을 측정하는 RTbox를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

비디오: Enabling High Grayscale Resolution Displays and Accurate Response Time Measurements on Conventional Computers

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central nervous system (CNS). Although much is known about the molecular mechanisms that pattern the spinal cord and elicit neuronal differentiation1, 2, we lack a deep understanding of these early events at the level of cell behavior. It is thus critical to study the behavior of neural progenitors in real time as they undergo neurogenesis.
In the past, real-time imaging of early embryonic tissue has been limited by cell/tissue viability in culture as well as the phototoxic effects of fluorescent imaging. Here we present a novel assay for imaging such tissue for long periods of time, utilizing a novel ex vivo slice culture protocol and wide-field fluorescence microscopy (Fig. 1). This approach achieves long-term time-lapse monitoring of chick embryonic spinal cord progenitor cells with high spatial and temporal resolution.
This assay may be modified to image a range of embryonic tissues3, 4 In addition to the observation of cellular and sub-cellular behaviors, the development of novel and highly sensitive reporters for gene activity (for example, Notch signaling5) makes this assay a powerful tool with which to understand how signaling regulates cell behavior during embryonic development.

Imaging embryonic tissue in real-time is challenging over long periods of time. Here we present an assay for monitoring cellular and sub-cellular changes in chick spinal cord for long periods with high spatial and temporal resolution. This technique can be adapted for other regions of the nervous system and developing embryo.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

마우스 좌골 신경에 생체 전기 생리 측정에서

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

망막 리본 시냅스에서 막 수용체의 고해상도 양이 Immunogold 분석

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

기존의 UV 레이저 공 초점 현미경을 사용하여 트리거 세포 스트레스와 죽음

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

미세 전극 배열에서 신경 세포 배양의 자극에 대한 네트워크 반응의 시간 의존적 증가

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...