نشكر الدكتور Yih-مروحة تشن للمساعدة في ملاقط والبصرية والمحورية للمساهمة بعض بياناته تمتد إلى هذا المخطوط. وقد رعت هذا العمل عن طريق منحة NSF PHY-0957293 وFOCUS منحة PHY-0114336.

1. ملاقط الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تقسيم شعاع من ليزر 1064 نانومتر إلى شعاعين الاستقطاب orthogonally. ويستخدم واحد لمعالجة جزيء حيوي بينما يستخدم الآخر لأغراض المعايرة (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التحكم في شدة شعاع تلاعب من قبل منحرف صوتية البصرية (AOD)، في حين يتم التحكم بشكل مستقل الموقف وتركيز كل شعاع من شعاع توجيه المرايا والتلسكوبات البصرية، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ومعاد ثم الحزم مع آخر شعاع الاستقطاب والتقسيم مشروطة بمزيد من مجموعة نهائية من البصريات تصغير أملا قليلا الفتحة الخلفي من الهدف المجهر. A يفيض 50٪ للمعايرة شعاع يؤدي إلى فخ بصري ضيق، في حين أن عامل أصغر قليلا لشعاع تلاعب، ما يقرب من 20٪، ويعطي عمقا التركيز الذي يترجم إلى المنطقة أكبر عملية لإمكانية الخطية. وتركز أشعة بإحكام من قبل الكائنات PlanApo النفط 60x/1.4 المجهر الغمرECTIVE على عينة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الجمع بين هذا الإعداد مع ملاقط brightfield المجهر بني المنزل التي توفر الإضاءة من مصابيح الهالوجين ركزت على حجرة العينة من قبل المكثف. يتم فصل الصورة brightfield من ضوء الليزر بواسطة مرآة مزدوج اللون وتصويرها على كاميرات CCD ثم اثنين. احد اعمال CCD كوسيلة لدينا الرئيسي للحصول على البيانات وتشغيلها هو برنامج لانتاج معدلات أخذ العينات دقيقة، في حين يتم استخدام CCD صورة أخرى لمرجع واحد المكروية التي تمسك الموقف بمثابة نظام التغذية المرتدة لمراقبة للتعويض عن الانجراف في المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم وضع العينة بخشونة فيما يتعلق الهدف من مرحلة XY، ويمكن بعد ذلك وضع على وجه التحديد من قبل ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من مرحلة بيزو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم جمع ضوء الليزر إلى الأمام المتناثرة والتي أحالها المكثف brightfield وتركز في الصعود إلى photodetector. يتم تصفية الإشارة الناتجة من خلال عامل تصفية تنعيم عند 100 كيلو هرتز، وتضخيمcquired في 200 كيلو هرتز باستخدام بطاقة دق. </li></ol> 2. معايرة الحجم الظاهري للحبة لموقف المحورية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل حجرة العينة 9 مع تفريق حل قطرها 800 نانومتر المجهرية البوليسترين مخففة في الفوسفات مخزنة المالحة. اسمحوا الجلوس لمدة 10-15 دقيقة ثم مسح برفق مع العازلة لإزالة الزائدة المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع المكروية تمسك بشكل عشوائي إلى ساترة وضبط ارتفاع حجرة العينة حتى المكروية حوالي 1 ميكرومتر أدناه التركيز على توليد صورة امتبائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس حجم ما يبدو من الصورة، والعثور على أول مركز المكروية باستخدام نمط هندسي مطابقة ظيفة في ابفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، إنشاء ملف تعريف كثافة شعاعي للالمكروية عن طريق حساب متوسط ​​360 درجة حول مركز كل مقطع عرضي. يمكن تركيبها في الملف شعاعي، والتي تتطابق مع حلقة بيضاء في كل من الصور brightfield، مع وظيفة من الدرجة الثانية للعثور علىذروة السطوع. ويمكن استخدام هذه المسافة بين الذروة ومركز كمقياس لحجم الظاهرة للحبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام piezostage معايرة، وزيادة تدريجيا موقف محوري من المكروية والحصول على صورة في كل موقف محوري مع الكاميرا CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار تحليل الصور لكل صورة متتالية لربط حجم الظاهرة للالمكروية مع موقعها المحوري (انظر الشكل 3). القرار المحوري حصلت عليها الأسلوب هو حوالي 1.4 نانومتر 7. </li></ol> 3. رسم خرائط المحتملة البصرية من الحزم التلاعب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ عن طريق مواءمة collinearly شعاع شعاع تلاعب والمعايرة. شعاع المعايرة يجب أن يكون حوالي 50 ميجاوات في الفتحة الخلفي من الهدف في حين أن شعاع تلاعب ينبغي أن يكون أضعف بكثير، ويقول 10 ميغاواط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع شعاع التلاعب مغلقا، وحصر المكروية الحرة داخل مصيدة أشد بكثير من الحزم المعايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن، تشغيل مانيpulation شعاع. منذ شعاع التلاعب أضعف بكثير من شعاع المعايرة، فإن الموقف المحوري للالمكروية يكون مضطرب قليلا. ويمكن قياس التغيير مما أدى إلى موقف محوري من الصور brightfield امتبائر بالفعل كما هو موضح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إيقاف شعاع التلاعب ومع المكروية الذين لا يزالون محاصرين في شعاع المعايرة، تحويل التركيز المحوري لشعاع المعايرة عن طريق ضبط عدسة تلسكوبية. بدوره على شعاع التلاعب، وقياس الإزاحة لاحقة من المكروية وتكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن رسم ΔX التشريد ضد الموقف المحوري للتركيز شعاع المعايرة. الموقف المحوري المقابلة لتهجير أكبر المكروية يحدد مركز المنطقة خطية من فخ الضوئية (انظر الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة الأخيرة في الحصول على القوة البصرية من الحزم التلاعب بوصفها وظيفة للموقف المحوري يتطلب قياس دقيق للصلابة منشعاع المعايرة. للحصول على هذا، نقل المكروية، محاصرين من قبل شعاع المعايرة، إلى نحو ميكرومتر فوق سطح العدسة من خلال تعديل تلسكوبية أثناء إغلاق شعاع من التلاعب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الحركة الحرارية المحورية للالمكروية عن طريق قياس شدة الضوء المرسل مع photodetector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تركيبها على الارتباط الذاتي للإشارة إلى وظيفة واحدة تسوس الأسي لإتاحة الوقت للتقلبات المستمرة. τ Z </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تصحيح معامل الاحتكاك الهيدروديناميكية ζ، من المكروية لقربها المجهرية إلى 5،10 السطح. ثم يتم إعطاء صلابة من فخ المعايرة بواسطة (A المواد التكميلية رؤية وB) = Z ζ / τ κ Z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معرفة صلابة من فخ المعايرة يسمح احد لتحويل التشريد قياس سابقا المحوري في ƒ القوة Z = Z κ التكامل ΔX من ثيق منحنى غلة تعيين المكاني للإمكانات البصرية المحورية من الحزم التلاعب (انظر الشكل 4). </li></ol> 4. تمتد على عينة من الحمض النووي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تحتوي على جزيئات غرفة 9 سطح DNA المربوطة (&lt;1 KBP) و، مع مراعاة الصورة brightfield، ضع تركيز شعاع التلاعب قليلا فوق المجهرية غير المتمدد عن طريق ضبط التلسكوب. ثم ضبط الموقف من مرحلة حتى يتم المحاصرين واحدة من المجهرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف تقريبا المكروية في وسط الطائرة XY من فخ البصرية. توليد سلسلة من موجات مربع في ابفيف وإرسالها إلى AOD متكررة لتحويل شعاع الليزر وخارجها. التحكم بعناية شدة الليزر ومدة الولاية يوم لمنع التدفئة للغرفة العينة. عادة، استخدم حوالي 2 ميغاواط من الطاقة ليزر (قياس فتحة في الجزء الخلفي من الهدف) وإرسال نبضات من 200 مللي ثانية (على) و 500 مللي (إيقاف). اتساع ث مربعيجب افي إرسالها إلى AOD يكون نحو 0.5 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة المكروية كما يتم تشغيل بشكل متكرر في فخ وخارجها، وملاحظة إذا كان ليزر يدفع أي اتجاه تفضيلية لتحريك الكرة المكروية في. حين تعديل تكرارا موقف المكروية في كل من X والاتجاه Y، من خلال التحكم في piezostage، ينبغي أن الحركة العشوائية للالمكروية تصبح موحد الخواص في الطائرة XY، على الرغم من تقييد ملحوظ عندما ليزر على. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل، محاذاة حبة في الاتجاه Z. نبض مرة أخرى شعاع الليزر وإيقاف الوقت، هذا الوقت، وقياس الإزاحة المحورية في نفس الوقت المجهرية في الوقت الحقيقي. مركز المرحلة في المنطقة الخطية، التي هي النقطة التي تشريد Z هو أعظم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد محاذاة دقيق في الاتجاه Z، لا بد من التحقق من أن يتركز في فخ لا تزال في الطائرة XY. إذا محاذاة XY قد تغير، يجب تكرار كل من XY Z والمواءمة حتى يتم توسيط المكروية بشكل صحيح على طول كل ثلاثةمحاور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتمتد DNA، المنحدر من شدة الليزر عن طريق إرسال إشارة إلى الجهد AOD، من 0 إلى 0.5 V V في الخطوات من 0،025 V. في كل خطوة، وسجل 400 في 100 إطارا في الثانية إطارات ومتوسط ​​لهم للحصول على الإزاحة المحورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن الآن تمديد منحنيات القوة يمكن رسم ونموذج يصلح لتعديل WLC 11 (انظر المواد التكميلية B). </li></ol> 5. ممثل النتائج: نقدم منحنيات التمديد للقوة تسلسل الحمض النووي الثاني: BP 1298 وتسلسل BP 247، وهذا الأخير هو أقصر تسلسل استطعنا أن تمتد بتكاثر. لفترات قصيرة من الحمض النووي، ودودة التقليدية على غرار سلسلة (WLC) النموذج لا يفسر تماما العلاقة تمديد قوة لأنه في هذه المقاييس يجب على المرء أن طول تشكل محدود الحجم والآثار صفر تمديد قوة الناشئ عن القيود الحدودية. القياسات تمديد القوة، لذلك، يجب أن يكون لائقا باستخدام نموذج WLC المحور الذي يحتوي على effectiهاء طول استمرار وامتداد القوة صفر كمعلمات مناسبا، كذلك ورد في المواد التكميلية. كفاف لفترات كبيرة من dsDNA، وطول استمرار فعالية هو ببساطة استمرار طول الاسمية (~ 50 نانومتر)، وتوسيع قوة الصفر يمكن إهمالها. لكن، وكما طول محيط يصبح أقصر من طول استمرار انخفاض فعالية أقل بكثير من 50 نانومتر والحمض النووي، وحتى في ظل قوة الصفر، ويظهر على تمديد مهمة. وتظهر البيانات ويناسب المقابلة من منحنيات التمديد القوة في الشكل. (5) لمتواليات اثنين. من WLC تعديل تناسبها، فقد قررنا أطوال فعالة لاستمرار منها 35 نانومتر لDNA بي بي 1298 و 25 نانومتر لDNA BP 247. لأغراض التوضيح، نحن نقدم واحدة من التدابير تمديد منحنيات القوة لكل سلسة. في الممارسة العملية، فإن المرء تكرار القياسات عدة مرات والحصول على نتائج متوسط ​​جنبا إلى جنب مع الأخطاء المعيارية. يجب أن يلاحظ أيضا ثار بعد الحصول على كل منحنى لا بد من التأكد من أن يبقى محاصرا المكروية وضعه بشكل صحيح داخل المنطقة الخطية، وإلا يجب إعادة ترتيب المكروية كما هو موضح سابقا في البروتوكول. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> الشكل 1 مبدأ ملاقط بصرية المحوري. (يسار) التقليدية فخ ملاقط بصرية بالقرب من التركيز. ثم يتم نقل حبة الجانبي إلى ساترة لممارسة التوتر. (الحق) في ملاقط بصرية المحوري، هو المحاصرين في المكروية بعيدا عن التركيز، في المنطقة الخطية من إمكانيات البصرية. في هذا التكوين، الذي عقد تحت البوليمر توتر دائم لمجموعة من الملحقات. وعلاوة على ذلك، وزيادة كثافة الليزر يحرك المكروية في الاتجاه المحوري. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> التمثيل التخطيطي الرقم 2 منوانقسم الى اثنين من الحزم تمر الخائن شعاع الاستقطاب (PBS): ملاقط بصرية المحوري ضوء الليزر (ايفو 4 1064nm بدون تاريخ). شعاع التلاعب، ويمر من خلال منحرف صوتية البصرية (AOD) ويمكن تعديلها بشكل مستقل شعاع المعايرة باستخدام عدسات تلسكوبية. ومعاد ثم شعاعين باستخدام آخر PBS وركز على عينة من هدف NA عالية. في نفس الوقت، brightfield الإضاءة تستخدم لتعقب المكروية، ويمر من خلال عينة، هو الأشعة تحت الحمراء (IR) وتمت تصفيتها ثم تصويرها بواسطة كاميرات CCD اثنين، واحد من القياسات التي تأخذ في حين أن غيرها من الأعمال كجزء من التقييم نظام التحكم. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> الشكل 3 معايرة الوظيفة المحورية. لمعايرة موقف محوري، ونحن الحصول على صور من امتبائر حبة تمسك ساترة غرفة في مواقف مختلفة المحوري للمرحلة. حجم مايكروونوتعطى من قبل فيري المسافة بين مركزها وموقف كثافة الذروة عن حلقة مشرقة تشكلت حول صورة المكروية. وأقحم يعرض توزيع كثافة شعاعي الذي يعطي حجم حبة. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> الشكل 4 المبدأ الكامن وراء رسم خريطة المحتملة البصرية. لرسم القوة البصرية من الحزم التلاعب، يتم قياس الإزاحة المحورية أنه يدفع على المكروية محاصرين داخل شعاع المعايرة أقوى بكثير. يقع وسط المنطقة حيث الخطي هذا النزوح هو الحد الأقصى. يمكن أن تكون متكاملة قوة البصرية مقابل منحنى الوظيفة المحورية للعثور على إمكانية البصرية. <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> يظهر الرقم ملحق بقوة 5 المنحنى. البيانات لبي بي 1298 بي بي العشوائية و 247 (أقحم) segmenامتدت طن من dsDNA بواسطة ملاقط بصرية المحوري. وتناسب نقاط البيانات لنموذج WLC معدلة من المعادلة. أسفرت 3 (خطوط متصلة) وأطوال استمرار فعالة من 34 نانومتر ونانومتر على التوالي 25 ل1298bp و247bp.

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ملاقط البصرية التقليدية تعتمد على التغذية المرتدة إما التناظرية أو الكمبيوتر التي تسيطر عليها لتطبيق قوة ثابتة على كائن سهل الانكسار. هذه النظم ملاحظات بالموقع يجدون صعوبة في أداء حيث ظل ظروف التغيرات المفاجئة في تمديد العينة يحدث، على سبيل المثال، من من البروتين م...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> كاشف / معدات </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> الثاني: YVO4 الليزر </td><td> أطياف الفيزياء </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> صوتية البصرية منحرف </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> المجهر الهدف </td><td> OLYMPUS </td><td> PlanApo </td><td> 60X، NA 1.4 </td></tr><tr><td> بيزو المرحلة </td><td> جنون مدينة مختبرات </td><td> نانو LP100 </td><td> XYZ المرحلة </td></tr><tr><td> CCD كاميرا </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodetector </td><td> الكهربائية والبصريات التكنولوجيا </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> البوليسترين الخرز </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm، streptavidin مطلي </td></tr><tr><td> مكافحة digoxigenin </td><td> روش </TD&gt; <td> 11333089001 </td><td> من الأغنام </td></tr><tr><td> الاشعال </td><td> MWG OPERON </td><td> مخصص oligos </td><td> واحد التمهيدي: البيوتين الأخرى: digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR الكواشف </td><td> نيو إنجلاند Biolabs </td><td> طق بوليميريز، dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> ساترة </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> غيرها من المواد الكيميائية ل العازلة </td><td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> مواد تكميلية A. معامل الاحتكاك هيدرودينامي لتحديد معامل الاحتكاك الهيدروديناميكية من المكروية بالقرب من سطح يمكن للمرء استخدام 5،10 التوسع التالية: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="المعادلة 1" /> حيث ح الاختزال التاليةكما تم إدخال: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="المعادلة 2" /> يتم تعريف معامل الاحتكاك من حيث اللزوجة η السائل ونصف قطر الكرة المكروية، مع المركز المكروية في يقع على مسافة η فوق السطح. والجمع يتقاطع بشكل معقول عندما توسعت لحوالي عشرة شروط. B. تأثير الوظيفة المحورية على معايرة تصلب معايرة صلابة فخ المفاضلة بين ينطوي على دقة المعايرة، مما يزيد المسافة مع زيادة من السطح، وموقف الفعلي المحوري حيث يتم استخدام فخ تجريبيا. بشكل عام، يتم معايرة في فخ عند حوالي 800-1000 نانومتر من السطح، وهي نسبة أعلى من حالة التجريبية الفعلية. C. التعديل دودة على غرار سلسلة (WLC) نموذج يمكن تناسب منحنيات التمديد لقوة WLC م المعدلةodel التي تمثل آثار الإقصاء حجم القوة البصرية في صفر على النحو التالي: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="المعادلة 3" /> حيث F هي القوة الأراضي الفلسطينية المحتلة البصرية، X س معلمة صالح لتمديد قوة الصفر، X الأراضي الفلسطينية المحتلة هو امتداد تحت قوة، l هو طول كفاف من DNA، ول * ع معلمة الثاني لصالح فعالة &quot; ويرد &quot;طول المثابرة. WLC F من طراز WLC المعتاد 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="المعادلة 4" /> حيث ε هو امتداد DNA النسبية.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

واحدة جزيء DNA تقنيات لتمتد أطوال محيط أقل من كيلو قاعدة محفوفة الصعوبات التجريبية. ومع ذلك، العديد من الأحداث البيولوجية مثيرة للاهتمام مثل هيستون والبروتين ملزمة بوساطة حلقات من DNA 1،2، تحدث على هذا النطاق طول. في السنوات الأخيرة، وقد تبين الخواص الميكانيكية للDNA للعب دورا هاما في العمليات الخلوية الأساسية مثل التعبئة والتغليف من الحمض النووي في Nucleosomes للألياف الكروماتين المدمجة و3،4. بوضوح، ومن ثم من المهم أن نفهم الخواص الميكانيكية للمسافات قصيرة من الحمض النووي. في هذه الورقة، ونحن نقدم دليل عملي لتقنية واحدة جزيء البصرية نتف الريش التي قمنا بتطويرها لدراسة السلوك الميكانيكي للDNA مع أطوال قصيرة قدر كفاف لbasepairs بضع مئات. العقبة الرئيسية في قطاعات تمتد قصيرة من الحمض النووي هو التي تم تصميمها بشكل عام ملاقط البصرية التقليدية لاستخدام القوة في directioن الجانبي إلى المرحلة 5،6، (انظر الشكل 1). في هذه الهندسة، والزاوية بين حبة وساترة، والتي يتم ربط الحمض النووي، ويصبح حاد جدا لطول DNA submicron. ويجب الآن أن الموقف المحوري تمثل، والذي يمكن أن يشكل تحديا، ومنذ التمديد للالمكروية تستمر أقرب إلى ساترة، وتعزيز الآثار الفراغية. وعلاوة على ذلك، نتيجة لعدم التكافؤ في المجهرية، وتمديد الجانبي توليد مستويات مختلفة من عزم الدوران بسبب دوران الكرة المكروية في فخ البصرية منذ اتجاه التغييرات قوة رد الفعل خلال فترة التمديد. طرق بديلة لتشغيل DNA submicron تمتد حتى ضد حواجز فريدة خاصة بهم. على سبيل المثال، يقتصر فخ مزدوج الحزمة الضوئية لتمتد من DNA حول الطول الموجي، والذي آثار التدخل نقطة بين اثنين والفخاخ من تشتت الضوء بين المجهرية تبدأ تشكل مشكلة كبيرة. استبدال واحدة من الفخاخومع micropipette على الأرجح تعاني من تحديات مماثلة. في حين يمكن للمرء أن استخدام مباشرة المحتملة المحوري لتمتد DNA سوف تكون هناك حاجة إلى وجود مخطط التقييم بالموقع لتطبيق قوة ثابتة وعرض النطاق الترددي لهذا ستكون محدودة للغاية، وخاصة في القوات منخفضة. نحن الالتفاف على هذه المشاكل الأساسية عن طريق سحب مباشرة DNA بعيدا عن ساترة باستخدام قوة ثابتة المحوري البصرية ملاقط 7،8. ويتحقق ذلك من خلال محاصرة حبة في منطقة خطية من الإمكانات البصرية، حيث القوة البصرية يمكن ضبطها ثابت قوة التي من خلال تعديل قوة الليزر. محاصرة داخل المنطقة الخطية أيضا بمثابة المشبك القوة البصرية على جميع DNA الذي يمتد لقرابة 350 نيوتن متر في الاتجاه المحوري. نحن في وقت واحد لتعويض الانجراف الحرارية والميكانيكية عن طريق ضبط دقة موقف المرحلة بحيث المكروية إشارة إلى تمسك ساترة لا يزال في نفس الموقف والتركيز، وهوالنماذج التالية لفترة غير محدودة تقريبا المراقبة.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

نحن توضيح استخدام القوة البصرية ملاقط ثابتة المحوري لاستكشاف الخواص الميكانيكية للجزيئات DNA قصيرة. بواسطة DNA تمتد محوريا، ونحن تقليل العوائق الفراغية والتحف التي تنشأ في التلاعب الجانبية التقليدية، مما يسمح لنا لدراسة جزيئات DNA قصيرة قدر نانومتر 100 ~.

تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  University of Michigan. نحن توضيح استخدام القوة البصرية ملاقط ثابتة المحوري لاستكشاف الخواص الميكانيكية للجزيئات DNA قصيرة. بواسطة DNA تمتد محوريا، ونحن تقليل العوائق الفراغية والتحف التي تنشأ في التلاعب الجانبية التقليدية، مما يسمح لنا لدراسة جزيئات DNA قصيرة قدر نانومتر 100 ~.

Video: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

قياس الخواص الميكانيكية للالكنان السكري غشائي مع مجهر القوة الذرية

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن المضادات الحيوية البكتيريا العنقودية الذهبية المقاومة لل

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

المجهر الضوئي الكمية: قياس الخلوية البيوفيزيائية الميزات مع مجهر بصري قياسي

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

الملقط المغناطيسي لقياس تطور وعزم الدوران

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

قياس القياس فيبريلار منظمة الكولاجين مع Curvelet تحويل القائم على أدوات

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...