אנו מודים לד&quot;ר Yih-Fan חן לעזרה עם פינצטה האופטית הצירית ותורם לחלק מהנתונים של מתיחתו לכתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי מענק NSF PHY-0957293 ולהתמקד מענק PHY-0114336.

1. פינצטה התקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלומת ליזר מננומטר 1064 מחולקת לשתי אלומות orthogonally מקוטבות. אחד משמש כדי לתפעל את biomolecule ואילו השני משמש למטרות כיול (ראה איור. 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת קרן המניפולציה נשלטת על ידי הטיה acousto אופטית (AOD), ואילו מעמדו וההתמקדות של כל קרן נשלט באופן עצמאי על ידי ההיגוי מראה קורה וטלסקופים אופטיים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקורות מכן recombined עם מפצל עוד קרן קיטוב והתנו נוספים על ידי קבוצה סופית של אופטיקה המתקפלת מעט ימלא יותר מדי את הצמצם האחורי של מטרת מיקרוסקופ. תמלא יותר מדי 50% לקרן הכיול מוביל למלכודת אופטית הדוקה, בעוד גורם מעט קטן לקורת המניפולציה, כ 20%, נותן דגש רדוד שמיתרגם אזור עביד גדול יותר של הפוטנציאל לינארי. הקורות מתמקדות בחוזקה על ידי obj PlanApo 60x/1.4 שמן טבילת מיקרוסקופective אל תא המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת פינצטה זה בשילוב עם מיקרוסקופ הבית נבנה brightfield המספק תאורה ממנורת הלוגן הממוקד על תא המדגם על ידי קבל. תמונת brightfield מופרדת מאור הליזר על ידי מראה Dichroic ולאחר מכן צלמה בשתי מצלמות רגילות. אחד מעשי CCD כאמצעי העיקרי שלנו לרכישת נתונים ותוכנה מופעלת שיביא לשיעורי דגימה מדויקים, ואילו שני CCD משמש לתמונה אחת microsphere תקוע התייחסות תפקידו משמש כמערכת משוב בקרה כדי לפצות על היסחפות במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המדגם ממוקם גס ביחס למטרה על ידי במת XY, ואז יכול להיות ממוקם בדיוק על ידי 3 פייזו שלב ממדי מוטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור הליזר קדימה המפוזר ומועבר נאסף על ידי קבל brightfield וממוקד על photodetector. האות המתקבלת היא מסוננת דרך מסנן אנטי-aliasing ב 100 קילוהרץ, מוגבר וcquired ב 200 קילוהרץ באמצעות כרטיס DAQ. </li></ol> 2. כיול גודל גלוי של החרוז למיקום צירי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען קאמרי מדגם 9 עם פיזור הפתרון של 800 ננומטר קוטר הקלקר microspheres דילול בפוספט נאגר מלוח. תן לו לשבת במשך 10-15 דקות ולאחר מכן לשטוף עם חיץ קל להסיר microspheres העודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר microsphere התקוע באקראי לcoverglass ולהתאים את הגובה של חדר הדגימה עד microsphere הוא כ 1 מיקרומטר מתחת למוקד כדי ליצור תמונה מטושטשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את גודלו הנראה של התמונה, ראשון למצוא מרכז microsphere באמצעות הדגם הגיאומטרי התאמת פונקציה בLABVIEW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, ליצור פרופיל עוצמת הרדיאלי של microsphere על ידי ממוצעים של ° 360 על מרכזו של כל חתך. פרופיל רדיאלי, אשר תואם את הטבעת לבנה בכל אחת מתמונות brightfield, יכול להיות מצויד עם פונקציה ריבועית למצואשיא בהירות. מרחק בין השיא הזה והמרכז יכול לשמש כמדד לגודלו הנראה של החרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש piezostage המכויל, להגדיל בהדרגה את העמדה הצירית של microsphere ולרכוש תמונה בכל עמדה צירית עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הניתוח של כל תמונה ברציפות כדי לתאם את גודלו הנראה של microsphere עם המיקום הצירי שלה (ראה איור. 3). הרזולוציה הצירית מתקבלת על ידי שיטה היא כ -1.4 ננומטר 7. </li></ol> 3. מיפוי הפוטנציאל האופטי של קרן המניפולציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין על ידי יישור קורה המניפולציה וקרן כיול collinearly. קרן הכיול צריכה להיות סביב 50 mW בפתח האחורי של המטרה ואילו קרן המניפולציה צריכה להיות הרבה יותר חלשה, יניח 10 mW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קרן המניפולציה כבויה, להגביל microsphere חינם בתוך המלכודת הרבה יותר הנוקשה של קורה הכיול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, הפעל את מאניקרן pulation. מאז קרן המניפולציה היא חלשה בהרבה מקורה הכיול, העמדה הצירית של microsphere תהיה מעט מוטרדת. כתוצאה מכך לשנות את העמדה צירית ניתן למדידה מתמונות brightfield defocused כפי שכבר תארו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את קורה מניפולציה ועם microsphere עדיין לכוד בקרן הכיול, להעביר את המיקוד הצירי של קרן הכיול על ידי התאמת העדשה טלסקופית. הפעל את קרן המניפולציה, למדוד את העקירה הבאה של microsphere וחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ΔX ההתקות ניתן להתוות נגד העמדה הצירית של המיקוד של קרן הכיול. התפקיד המקביל לתזוזה הגדולה ביותר של microsphere הצירי קובע מרכז אזור יניארית של המלכודת האופטית (ראה איור. 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב האחרון בקבלת הכח האופטי של קרן המניפולציה כפונקציה של מיקום צירי דורש מדידה קפדנית של הנוקשות שלקרן כיול. כדי להשיג את זה, להעביר את microsphere, נלכד על ידי קרן הכיול, לכ מיקרומטר מעל פני השטח על ידי התאמת העדשה טלסקופית תוך קורה המניפולציה כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט את התנועה הצירית התרמית של microsphere על ידי מדידת עוצמת האור מועבר עם photodetector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Autocorrelation של האות ניתן להתאים לפונקצית דעיכה מעריכית יחידה לתת את הזמן המתמיד של התנודות,. Τ z </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקדם החיכוך הידרודינמית ζ, של microsphere ניתן לתקן לקרבת microspheres ל5,10 שטח. הנוקשות של מלכודת כיול אז ניתן על ידי κ (ראו חומרים משלימים ו-B) z = ζ / τ z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידיעת הנוקשות של מלכודת הכיול מאפשרת לאדם להמיר את ההתקות הציריות נמדדו בעבר בכוח ƒ z = κ z אינטגרצית ΔX של thiשל עקום תשואות מיפוי מרחבים של הפוטנציאל האופטי הצירי של קרן המניפולציה (ראה איור. 4). </li></ol> 4. מתיחת דגימת DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרי 9 מולקולות המכילות משטח כבולים DNA (&lt;1 KBP) ובעודו צופה בתמונת brightfield, למקם את המיקוד של אלומת המניפולציה מעט מעל microspheres unstretched ידי התאמת טלסקופ. ואז להתאים את המיקום של הבמה עד שאחד מmicrospheres לכודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בערך למקם microsphere במרכז מטוס XY של המלכודת האופטית. לייצר סדרה של גלים מרובעים בLabVIEW ולשלוח אותם לAOD שוב ושוב להפוך את קרן הליזר וכיבוי. זהירות לשלוט על עוצמת הליזר ואת משך הזמן של המדינה על מנת למנוע חימום של חדר המדגם. בדרך כלל, להשתמש סביב 2 mW של ליזר כוח (נמדד בפתח האחורי של אובייקטיבי) ולשלוח פולסים של 200 מילישניות (ב) ו500 מילים (כבוי). המשרעת של הכיכר wשד &#39;נשלח לAOD צריך להיות סביב 0.5 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה microsphere כמלכודת פנתה שוב ושוב לסירוגין ולשים לב אם הליזר גורם לכל כיוון מועדף לתנועה של microsphere. בעוד ערוך את התאמת עמדת microsphere בשניהם X ו Y הכיוון, על ידי שליטה על piezostage, התנועה האקראית של microsphere צריכה להיות איזוטרופי במישור XY, אם כי מוגבלת במידה ניכרת כאשר הליזר מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, ליישר את החרוז בכיוון Z. שוב דופק את קרן הליזר וכיבוי בזמן, הפעם, במקביל למדידת תזוזת microspheres הצירי בזמן אמת. מרכז הבמה באזור ליניארי, המהווה את הנקודה שבה עקירת Z היא גדולה ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יישור זהיר בכיוון Z, זה הכרחי כדי לבדוק שהמלכודת עדיין מרוכזת במישור XY. אם יישור XY השתנה, יש לחזור על שניהם XY ויישור Z עד microsphere מרוכז כראוי לאורך כל שלושצירים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתיחת ה-DNA, להגביר את עוצמת הליזר על ידי שליחת אות מתח לAOD, בין 0 ל 0.5 V V בצעדים של 0.025 V. בכל שלב, שיא 400 מסגרות ב100 FPS והממוצעים להשיג עקירה הצירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העקומות המאריכות הכח עכשיו ניתן להתוות ותתאמנה למודל modified WLC 11 (ראה חומרים משלימים B). </li></ol> 5. נציג תוצאות: אנו מציגים עקומות הארכת תוקף למשך רצפי DNA: 1298 BP ורצף 247 נ&quot;ב, האחרון להיות רצף הקצר ביותר שהצלחנו למתוח reproducibly. לפרקים קצרים של דנ&quot;א, השרשרת הקונבנציונלית דמוית תולעת (WLC) מודל אינו מסבירה באופן מלא את יחסי הארכת התוקף כי בסולמות אורך אלה יש להסביר תופעות סופית בגודל ובהארכת תוקף אפס נובעת מאילוצי גבול. המדידות המאריכות הכח, ולכן, צריכות להיות בכושר תוך שימוש במודל שונה WLC שיש effective אורך התמדה וסיומת כוח אפס כפרמטרים לנכון, שתוארו בהרחבה בחומרים המשלימים. עבור אורכי גובה גדולים של dsDNA, אורך ההתמדה היעיל הוא פשוט האורך הנומינלי ההתמדה (~ 50 ננומטר) וסיומת הכח אפס יכול להיות מוזנחת. עם זאת, כאורך קווי המתאר מתקצר אורך ההתמדה האפקטיבית פוחת הרבה מתחת 50 ננומטר ו-DNA, גם בכוח אפס, מראה הרחבה משמעותית. את הנתונים ואת ההתקפים המקבילים של עקומי המאריכים הכח מוצגים באיור. 5 עבור שני הרצפים. מעדכון WLC המתאים, קבע את אורכי ההתמדה היעילים להיות 35 ננומטר ל1298 BP-DNA ו25 ננומטר לדנ&quot;א 247 נ&quot;ב. לשם המחשה, אנו מציגים אמצעים יחידים של העקומות המאריכות הכח לכל רצף. בפועל, אפשר הייתה לחזור על המדידות מספר פעמים ולקבל את התוצאות הממוצעות יחד עם סטיות ההתקן. זה חייב גם לציין thaלא לאחר הקבלה כל עקומה זה הכרחי כדי להבטיח שנשאר לכודי microsphere וממוקם כראוי בתוך אזור יניארית, אחרת microsphere יש realigned כפי שתואר לעיל בפרוטוקול. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> עיקרון איור 1 מתוך פינצטה אופטית צירית. (שמאל) מלכודת פינצטה אופטית קונבנציונלית קרובה למוקד. החרוז ולאחר מכן עבר לרוחב לcoverslip להפעיל מתח. (מימין) בפינצטה אופטית צירית, microsphere לכוד הרחק מהפוקוס, באזור ליניארית של הפוטנציאל האופטי. בתצורה זו, הפולימר מתקיים במתח מתמיד למגוון סיומות. יתר על כן, להגדיל את עוצמת הליזר נע microsphere בכיוון הצירי. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> ייצוג סכמטי של איור 2מלקט צירי אופטי ליזר אור (1064nm Nd: YvO 4). מחולק לשתי אלומות על ידי עובר דרך מקטב האלומה ספליטר (PBS). קרן המניפולציה, עוברת דרך הטיה acousto אופטית (AOD) וקרן הכיול יכולה להיות מותאמת באופן עצמאי באמצעות עדשות טלסקופיות. שתי הקורות מכן recombined שימוש אחר PBS וממוקד על ידי המדגם אובייקטיבי NA גבוה. במקביל, brightfield תאורה משמשת למעקב microsphere, עובר דרך הדגימה, הוא אינפרא אדום (IR) המסונן ולאחר מכן הוא צלם בשתי מצלמות, אחת מהן לוקחת מדידות ואילו מעשים האחרים, כחלק ממערכת בקרת משוב. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> איור כיול מיקום 3 צירי. כדי לכייל את העמדה הצירית, אנו לרכוש תמונות מטושטשות של חרוז הדבוק לcoverslip הקאמרי בשינוי עמדות ציריות של הבמה. הגודל של מייקרוphere ניתן על ידי את המרחק בין המרכז שלה ועמדתה של עוצמת שיא על הטבעת הבהירה נוצרה סביב דמותו של microsphere. ההבלעה מציגה את התפלגות העוצמת הרדיאלי אשר נותנת את הגודל של החרוז. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> איור 4 עיקרון מאחורי מיפוי הפוטנציאל האופטי. כדי למפות את הכח האופטי של קרן המניפולציה, העקירה הצירית שהוא גורם בmicrosphere לכוד בתוך אלומת כיול הרבה יותר חזקה נמדדת. מרכז אזור יניארי שבו ההעברה הזאת מקסימום הוא ממוקם. החיל האופטי לעומת עקומת עמדה צירית יכול להיות משולב כדי למצוא את הפוטנציאל האופטי. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Curve האיור 5 חיל הארכה. נתונים יוצג למשך 1298 נ&quot;ב אקראי ו247 BP (הבלעה) segmenלא של dsDNA נמתח על ידי פינצטה אופטית צירית. נקודתי הנתונים שתתאמנה לעדכון WLC המודל של משוואה. 3 (קווים מלאים) והניבו אורכי התמדה אפקטיביות של 34 ננומטר ו 25 ננומטר לבהתאמה 1298bp ו247bp.

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פינצטה אופטית קונבנציונלית להסתמך על משוב או אנלוגי או מבוקר מחשב להפעיל כוח קבוע על אובייקט refractile. מערכות משוב פעילים אלו יש קושי בביצוע בתנאים שבו שינויים פתאומיים בהארכה את הדגימה מתרחשים, למשל, מההתקשרות של חלבון ל-DNA או הקפיצה המהירה של מנוע מולקולרי לאורך חוט. ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגים </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> Nd: ליזר YVO4 </td><td> ספקטרה פיסיקה </td><td> T40-Z-106C </td><td></td></tr><tr><td> Acousto אופטי מטה הטיה </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> מטרת מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> PlanApo </td><td> 60x, 1.4 NA </td></tr><tr><td> שלב Piezo </td><td> מעבדות עיר מטורפות </td><td> Nano-LP100 </td><td> שלב XYZ </td></tr><tr><td> מצלמת CCD </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Photodetector </td><td> אלקטרו אופטיקה טק </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> חרוזי פוליסטירן </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin מצופה </td></tr><tr><td> אנטי digoxigenin </td><td> רוש </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> מכבשים </td></tr><tr><td> Primers </td><td> MWG אופרון </td><td> oligos המותאם אישית </td><td> פריימר אחד: ביוטין אחר: digoxigenin </td></tr><tr><td> ריאגנטים PCR </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> פולימראז תקי, dNTPs </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כימיקלים אחרים עבור בלם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> חומרים משלימים מקדם חיכוך הידרודינמית א לקביעת מקדם החיכוך הידרודינמית של microsphere ליד משטח אחד ישתמש ב5,10 ההרחבה הבא: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="משוואה 1" /> שם קיצור השעות הבאותכפי שהציג: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="משוואה 2" /> מקדם החיכוך מוגדר במונחים של את צמיגות נוזל η והרדיוס של microsphere, עם המרכז של microsphere ממוקם מרחק η מעל פני השטח. הסיכום מתכנס סביר כאשר התרחבו לכ 10 מונחים. השפעה על מצב ב &#39;צירי על כיול נוקשות הכיול של קשיחות המלכודת כרוכה איזון בין דיוק הכיול, אשר מגביר במרחק גדל והולך משטח, והעמדה הצירית האמיתית שבו המלכודת משמשת בניסוי. באופן כללי, המלכודת מכוילת בסביבות 800-1000 ננומטר מהמשטח, שהוא גבוה יותר מתנאי הניסוי בפועל. ג השתנה שרשרת דגם דמוי תולעת (WLC) העקומות המאריכות הכח ניתן להתאים לעדכון WLC מ &#39;אודל, שמסביר את תופעות הדרת נפח בכוח אופטי אפס כדלקמן: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="משוואה 3" /> כאשר F הוא כוח opt האופטי, x o היא פרמטר ראוי להארכת התוקף אפס, x opt הוא ההארכה בכוח, אני הוא אורך קווי המתאר של ה-DNA, ואני * p הוא פרמטר שני לכושר &quot;יעיל &quot;אורך התמדה. F WLC ניתן על ידי המודל הרגיל WLC 11 <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="משוואה 4" /> בי ε היא הסיומת-DNA היחסית.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

טכניקות מולקולה בודדה למתיחת DNA של אורכי גובה פחות מkilobase הן כרוכות בקשיים ניסיוניים. עם זאת, מספר רבים של אירועים ביולוגיים מעניינים כגון מחייב היסטון וחלבון בתיווך לולאות של DNA 1,2, מתרחשים בקנה מידת אורך זו. בשנים האחרונות, את התכונות המכאניות של ה-DNA הוכחו לשחק תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים בסיסיים כמו האריזה של ה-DNA לתוך nucleosomes הקומפקטי וסיבי הכרומטין 3,4. ברור, אז זה חשוב להבין את התכונות המכאניות של מותחים קצרה של ה-DNA. במאמר זה, אנו מספקים מדריך מעשי לטכניקת מריטות חוזרת ונשנית מולקולה בודדה אופטית שפתחנו כדי ללמוד את ההתנהגות המכאנית של ה-DNA באורכי גובה זמן הקצר של כמה מאה basepairs. המשוכה העיקרית במתיחת קטעים קצרים של DNA היא שפינצטה אופטית קונבנציונלית נועדה בדרך כלל להפעלת כוח בdirection לרוחב לשלב 5,6, (ראה איור. 1). בגיאומטריה זה, הזווית בין החרוז וcoverslip, כדי שהדנ&quot;א הוא קשור, הופכת תלולה מאוד לדנ&quot;א אורך submicron. העמדה הצירית עכשיו יש בחשבון, שיכול להיות אתגר, ומאז ההארכה גוררת microsphere קרוב יותר לcoverslip, אפקטים סטריים משופרים. יתר על כן, כתוצאה מהסימטריה של microspheres, רחבות לרוחב תפקנה רמות שונות של מומנט עקב סיבוב של microsphere בתוך המלכודת האופטית מאז הכיוון של שינויי הכח תגובתי במהלך ההארכה. שיטות חלופיות לדנ&quot;א submicron מתיחה נתקלות מכשולים הייחודיים משלהם. לדוגמה, מלכודת קורה כפול אופטית מוגבלת למתיחות סביב ה-DNA של גל, שבו השפעות התערבות נקודות בין שתי מלכודות ומפיזור האור בין microspheres מתחילות להוות בעיה משמעותית. החלפה אחת מהמלכודותעם micropipette היית כנראה סובל מאתגרים דומים. בעוד אחד יכול להשתמש ישירות את הפוטנציאל הצירי למתוח את ה-DNA, סכימת משוב פעילה, תהיה צורך להפעיל כוח קבוע ורוחב הפס של זה יהיה מוגבל למדי, במיוחד בכוחות נמוכים. אנו לעקוף בעיות יסוד אלה על ידי משייכת ישירות את ה-DNA מcoverslip באמצעות כוח קבוע הצירית האופטית פינצטה 7,8. זו מושגת על ידי לכידת החרוז באזור ינארית של הפוטנציאל האופטי, שבו הכח האופטי הוא הכח קבוע, אשר יכול להיות מכוון על ידי התאמת כוח הליזר. השמנה באזור יניארי משמשת גם ככוח-מהדק כל אופטי בדנ&quot;א המשתרע על כמעט 350 ננומטר בכיוון הצירי. אנחנו במקביל לפצות על סחיפה תרמית ומכאנית על ידי התאמת העמדה של השלב דק, כך שההתייחסות microsphere הדבוק לcoverslip נשאר באותה העמדה ומיקוד,llowing לתקופת תצפית בלתי מוגבלת כמעט.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ&quot;א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ&quot;א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

מתיחת רצפים קצרים של DNA עם פינצטה חיל הצירי האופטית קבועה

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Views.  University of Michigan. אנו מדגימים את השימוש בפינצטה אופטית צירית קבועה כוח כדי לחקור את התכונות המכאניות של מולקולות דנ"א קצרות. על ידי מתיחת DNA axially, אנחנו למזער מכשולים וממצאים שמקורם במניפולצית רוחב קונבנציונלית סטריים, ומאפשרים לנו לחקור מולקולות דנ"א קצרה כמו ~ 100 ננומטר.

Video: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

חוקר מערכות קולטן ליגנד של Cellulosome עם המולקולה בודדת מבוססת AFM חיל ספקטרוסקופיה

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

מיקרוסקופיה אופטית כמותי: מדידה נייד Biophysical תכונות עם תקן מיקרוסקופ אופטי

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

מלקחיים מגנטיים למדידה של טוויסט ומומנט

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

כימות ארגון קולגן פיברילאר עם כלים מבוססי המרה של Curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...