Biz eksenel optik cımbız ile yardım ve bu el yazması onun uzanan bazı verilerin katkıda Dr Yih-Fan Chen ederim. Bu çalışma NSF hibe FİZ-0957293 ve ODAK hibe FİZ-0114336 sponsor oldu.

1. Cımbızlar Kurulumu <ol><li> Bir 1064 nm lazer ışını iki ortogonal polarize ışınları ayrılmıştır. Bir başka (bakınız Şek. 2) kalibrasyon amacıyla kullanılan en biyomolekül işlemek için kullanılır. </li><li> Her bir kiriş pozisyon ve odak bağımsız olarak, sırasıyla, ışın yönlendirme aynası ve optik teleskoplar ile kontrol edilir manipülasyon ışın yoğunluğu, bir akusto-optik deflektör (ATH) tarafından kontrol edilir. </li><li> Kirişler sonra başka bir polarize ışın ayırıcı ile recombined ve biraz mikroskop objektif arkasına diyafram doldurmayın için teleskop optik bir final seti daha da klimalıdır. Manipülasyon kiriş için biraz daha küçük bir faktörü, yaklaşık% 20, lineer potansiyel büyük bir çalışılabilir bölgeye çeviren bir sığ odak verirken kalibrasyon ışını için% 50 fazla doldurmayın, sıkı bir optik tuzağına götürür. Kirişler sıkıca PlanApo 60x/1.4 yağ immersiyon obj tarafından duruldunumune hücresi üzerine uygulamada etkili. </li><li> Bu cımbız kurulum bir kondansatör tarafından numune odacığı üzerine odaklanmış bir Halojen lamba aydınlatma sağlar bir ev inşa aydınlık mikroskop ile birleştirilmiştir. Aydınlık görüntü bir dikroik ayna tarafından lazer ışık ayrılır ve daha sonra iki CCD kamera üzerinde görüntülenmektedir. Diğer CCD görüntü olan pozisyon mikroskop sürüklenme telafi etmek için bir geri besleme kontrol sistemi olarak hizmet tek bir sıkışmış referans mikroküre için kullanılırken, biri CCD veri edinme bizim birincil aracı olarak görür ve, hassas örnekleme oranları elde etmek için tetiklenir yazılımdır. </li><li> Örnek kabaca bir XY aşama ile objektif ile ilgili olarak konumlandırılır ve daha sonra tam gömülü bir üç boyutlu bir piezo-katı ile yerleştirilebilir. </li><li> Öne saçılan ve yayılan lazer ışığı aydınlık kondenser tarafından toplanan ve bir fotodetektör üzerine odaklanmıştır. Elde edilen sinyal, 100 kHz bir yumuşatma filtre içinden süzülmüş amplifiye edilir ve birBir DAQ kartı kullanarak 200 kHz&#39;de cquired. </li></ol> 2. Eksenel Pozisyon Boncuk Görünür Büyüklüğü Kalibre <ol><li> Bir fosfat içinde seyreltilmiş 800 nm çaplı polistren mikroküre çözümü Dispers bir örnek odası 9 yükleyin tamponlu salin. 10-15 dakika bekletin ve sonra hafifçe aşırı mikroküreler kaldırmak için tamponu ile yıkayın edelim. </li><li> Rastgele coverglass yapışmış bir mikroküre bulup mikroküre bir defocused görüntü oluşturmak için odak altında yaklaşık 1 mikron kadar numune odasının yüksekliğini ayarlayın. </li><li> Resmin görünen boyutunu ölçmek için, ilk LabView eşleşen fonksiyonu geometrik desen kullanarak mikroküre merkezi bulabilirsiniz. </li><li> Daha sonra, her bir enine kesit merkezine yaklaşık 360 ° ortalaması alınarak mikrosfer, radyal bir yoğunluk profili oluşturmak. Aydınlık görüntülerin her bir beyaz halka karşılık radyal profil, bulmak için ikinci dereceden bir fonksiyonu takılabilirparlaklık pik. Bu tepe noktası ile merkez arasındaki mesafe boncuk mevcut boyutlarını bir ölçü olarak kullanılabilir. </li><li> Kalibre piezostage kullanarak, yavaş yavaş mikroküre arasında eksenel pozisyonunu artırmak ve CCD kamera ile her eksenel konumda bir görüntü kazanır. </li><li> (Bkz. Şek. 3) eksenel konumu ile mikroküre belirgin boyutu ilişkilendirmek için birbirini izleyen her görüntü için görüntü analizi tekrarlayın. Yöntemi ile elde edilen eksenel çözünürlüğü yaklaşık 1,4 mil 7&#39;dir. </li></ol> 3. Manipülasyon Işın Optik Potansiyeli <ol><li> Collinearly manipülasyon ışını ve kalibrasyon ışın hizalayarak başlayın. Manipülasyon ışın çok zayıf olmalı iken kalibrasyon ışın hedefi arka diyafram yaklaşık 50 mW olmalıdır, 10 mW söylüyorlar. </li><li> Manipülasyon ışını kapalı olan, kalibrasyon ışının çok sert tuzak içinde bir serbest mikroküre sınırlandırmak. </li><li> Şimdi, mani açınpulation kiriş. Bu sayede, manipülasyon ışın demeti kalibrasyon çok daha zayıf olduğu için, bir mikrosfer eksenel pozisyonunu biraz bozulursa olacaktır. Eksenel konumda çıkan değişiklik olarak daha önce tarif odak dışı aydınlık alan görüntüleri ölçülebilir. </li><li> Manipülasyon ışını kapatın ve hala kalibrasyon kiriş içinde sıkışıp mikroküre ile teleskopik lens ayarlayarak kalibrasyon kirişin eksenel odak kayması. , Manipülasyon kiriş açın mikroküre ve tekrarın sonraki deplasman ölçer. </li><li> Değiştirmeler ΔX kalibrasyon ışının odak eksenel pozisyonunu karşı çizilebilir. Mikrosfer en büyük deplasman karşılık gelen eksenel pozisyonunu optik tuzak doğrusal bölgede (bakınız Şek. 4) merkezi belirler. </li><li> Eksenel konumunun bir fonksiyonu olarak manipülasyon kiriş optik güç elde son adım sertliğinin dikkatli bir şekilde ölçülmesi gereklidirkalibrasyon kiriş. Bunu elde etmek için, manipülasyon ışını kapalıyken teleskopik lens ayarlayarak yüzeyinden bir mikrometre civarına kalibrasyon ışını tarafından tuzağa mikroküre, hareket. </li><li> Bir fotodetektör ile iletilen ışığın yoğunluğunu ölçerek mikrosfer bir termal eksenel hareket kaydedin. </li><li> Sinyalin otokorelasyon, dalgalanmalar zaman sabitini vermek için tek bir üstel bozulma fonksiyonu takılabilir. Τ z </li><li> Hidrodinamik sürtünme katsayısı ζ, mikrosfer bir yüzey 5,10, mikrosferler yakınlık için düzeltilebilir. Kalibrasyon tuzak sertliği sonra κ z = ζ / τ z (bkz. Yardımcı Malzeme A ve B) tarafından verilir. </li><li> Kalibrasyon tuzak sertliği bilmek tek bir kuvvet ƒ içine thi z = κ z ΔX Entegrasyon önce ölçülen eksenel deplasman dönüştürmek sağlars eğri manipülasyon kiriş eksenel optik potansiyeli (bakınız Şek. 4) konumsal bir eşleme verir. </li></ol> 4. Bir DNA Sample Stretching <ol><li> Odasının 9 içeren yüzey gergin DNA molekülleri (&lt;1 kbp) monte ve aydınlık görüntü dikkat ederek, teleskop ayarlayarak hafifçe gerilmemiş mikrosferler yukarıda manipülasyon kiriş odağı yerleştirin. Daha sonra mikro biri tutulur kadar aşamasının konumunu ayarlamak. </li><li> Kabaca optik tuzak XY düzlemi merkezinde mikrosfer yerleştirin. LabView kare dalgalar bir dizi oluşturun ve tekrarlayan lazer ışını ve kapatmak için AOD gönderebilirsiniz. Dikkatlice lazer ve numune odasının ısınmasını önlemek için üzerindeki hal süresini yoğunluğunu kontrol. Genellikle, lazer güç (objektif arkasındaki diyafram ölçülen) 2 mW etrafında kullanımı ve 200 ms (açık) ve 500 ms (açık) ve bakliyat gönderebilirsiniz. Kare w genliğiave AOD gönderilen 0.5 civarında olmalıdır V. </li><li> Tuzak defalarca açılıp kapandığında olarak mikroküre İzle ve lazer mikroküre en hareketine herhangi bir tercihli yöne yönlendiren, unutmayın. Iteratif X ve Y yönünde hem mikroküre konumunu ayarlarken, piezostage kontrol ederek, mikroküre ve rasgele hareket lazer açıkken bile fark yoktur, XY düzleminde izotropik haline gelmelidir. </li><li> Sonra, Z doğrultusunda boncuk hizalanır. , Bu kez, aynı anda gerçek zamanlı mikroküreler eksenel deplasman ölçüm yaparken tekrar lazer ışını darbeli ve kapatır. Lineer bölge içinde merkezi aşama, ki Z deplasman yüksek olduğu noktadır. </li><li> Z yönünde dikkatli bir hizalama sonra, tuzak hala XY düzleminde merkezli olup olmadığını kontrol etmek şarttır. XY hizalama değiştirilmişse mikroküre üç boyunca düzgün ortalanmış kadar, XY ve Z hizalama hem tekrarlanmalıdıreksenleri. </li><li> DNA germe için, onları eksenel deplasman elde etmek için kayıt, 0.025 adımlarla V. Her adımda 0 V 0.5 V, AOD 400 100 fps kare ve ortalama bir voltaj sinyali göndererek lazer yoğunluğu rampa. </li><li> Kuvvet-uzama eğrileri şimdi (B Yardımcı Malzemeler bakınız) çizilen ve modifiye WLC modeli 11 için uygun olabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Bir 1298 bp ve 247 bp dizisi, biz tekrarlanabilir germek mümkün olmuştur kısa dizisi olmanın ikincisi: Biz iki DNA dizileri için yürürlüğe uzatma eğrileri sunuyoruz. Bu uzunluk ölçeklerinde tek sonlu boyutlu efektler ve sınır kısıtlamaları kaynaklanan sıfır kuvvete uzantısı için hesap gerekir, çünkü DNA kısa menziller için, konvansiyonel Worm-beğendiniz Zincir (WLC) modeli tam kuvvet uzantısı ilişkisini açıklamaz. Kuvvet-uzama ölçümleri, bu nedenle, etkin bir e sahip bir modifiye WLC modeli kullanılarak uygun olması gerekirsebat uzunluğu ve ek materyalleri de açıklanan uyum parametreleri, bir sıfır kuvvete uzantısı ettik. DsDNA büyük kontur uzunlukları için, etkili bir kalıcılık süresini sadece nominal sebat uzunluğu (~ 50 nm) ve sıfır kuvvete uzantısı ihmal edilebilir. Bununla birlikte, çevre uzunluğu daha kısa hale olarak, etkili kalıcılık uzunluğu da 50 nm ve DNA altına düştüğünde hatta sıfır kuvvet altında, belirgin bir uzantı göstermektedir. Kuvvet-uzama eğrisi verileri ve ilgili uyan Şekil &#39;de gösterilmiştir. İki dizileri için 5. Modifiye WLC uyuyor, biz etkili kalıcılık uzunlukları 1298 bp DNA ve 247 bp DNA için 25 nm 35 nm olarak belirlenmiştir. Amaçlıdır, her sıra için güç uzatma eğrileri tek önlemleri sunuyoruz. Uygulamada, bir ölçüm birden çok kez tekrarlayın ve standart hataları ile birlikte ortalama sonuçlar elde ederim. Bu tha da belirtmek gerekirt her bir eğri elde etmek sonra mikrosfer önceden protokolde tarif edildiği gibi başka bir mikrosfer yeniden hizalanmalıdır, lineer bölge içinde sıkışmış ve uygun bir şekilde yerleştirilmiş olmasını sağlamak için zorunludur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> Eksenel Optik cımbız Şekil 1. İlke. (Sol) Odak yakınındaki Konvansiyonel optik cımbız tuzak. Boncuk sonra gerilim uygulamak için lamel yanal hareket ettirilir. (Sağ) eksenel optik cımbız, bir mikroküre optik potansiyel doğrusal bölgede, odak uzak tutulur. Bu düzenlemede, polimer uzantılar için bir dizi sabit gerilim altında tutulur. Ayrıca, lazer yoğunluğu artan eksenel yönde mikrosfer hareket eder. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> Şekil 2 Şematik GösterimiEksenel Optik cımbız Lazer ışığı (1064nm Nd: Yvo 4). Polarize ışın ayırıcı (PBS) üzerinden geçerek iki kiriş ayrılmıştır. Manipülasyon ışın, bir acousto-optik saptırıcı (AOD) geçer ve kalibrasyon kiriş teleskopik lens kullanan bağımsız olarak ayarlanabilir. İki ışın, sonra yüksek bir NA objektif ile bir başka PBS ile yeniden birleştirilmesi, ve numune üzerine odaklanmıştır. Aynı zamanda, aydınlık alan aydınlatma mikrosfer izlemek için kullanılabilir, örnek geçen süzülmüş kızılötesi (IR) ve daha sonra bir geri besleme kontrol sisteminin bir parçası olarak diğer işlemler sırasında ölçüm yapar ve bunlardan biri iki CCD kamera tarafından görüntülenmektedir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> 3 Eksenel Pozisyon Kalibrasyon Şekil. Eksenel pozisyonunu kalibre etmek için, biz sahne eksenel pozisyonları değişen odasına lamel yapışmış bir boncuk defocused görüntüler elde. Mikro boyutuphere merkezinde ve mikroküre bir görüntü etrafında oluşan parlak halka yaklaşık doruk şiddeti pozisyonu arasındaki mesafe tarafından verilir. Içerlek boncuk boyutunu verir radyal yoğunluğu dağılımını göstermektedir. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> Optik Potansiyeli ardında 4. İlke Şekil. Manipülasyon ışının optik kuvveti eşleştirmek için, daha güçlü bir kalibrasyon demeti içinde sıkışmış bir mikroküre üzerine uyardığını eksenel deplasman ölçülür. Bu yer değiştirme, bir maksimum olduğu doğrusal bölgenin merkezinde yer almaktadır. Eksenel Pozisyon eğrisi vs Optik Kuvvetleri optik potansiyel bulmak için entegre edilebilir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Şekil 5 Kuvvet Uzatma Eğrisi. Veriler rasgele 1298 bp ve 247 bp (inset) segmen için gösterilirdsDNA t eksenel optik cımbız tarafından gerilir. Veri noktaları denkleminin modifiye WLC modeli için uygun bulundular. 3 (katı çizgiler) ve 1298bp ve 247bp sırasıyla 34 nm ve 25 nm etkili sebat uzunlukları vermiştir.

<ol>
	<li>Halford, S. E., Welsh, A. J., Szczelkun, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+DNA+looping.">Enzyme-mediated DNA looping.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 33, 1-24 (2004).</li><li>Allemand, J. F., Cocco, S., Douarche, N., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loops+in+DNA:+an+overview+of+experimental+and+theoretical+approaches.">Loops in DNA: an overview of experimental and theoretical approaches.</a> Eur. Phys. J. E. Soft. Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Konvansiyonel optik cımbız bir refraktil nesne üzerinde sabit bir kuvvet uygulamak için analog ya da bilgisayar kontrollü geribildirim güvenmek. Bu aktif geri besleme sistemleri, bir protein bağlama gelen DNA ya da bir filaman boyunca bir moleküler motorun hızlı bir atlama için, örneğin, zorluk numune bir uzantısı olarak ani değişiklikler meydana koşullar altında icra var. Sabit kuvvetlerinin uygulanması için çeşitli pasif yöntemler son zamanlarda geliştirilmiştir. Basepair çözünürlükte RN...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / Ekipman </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Nd: YVO4 lazer </td><td> Spectra Physics </td><td> T40-Z-106c </td><td></td></tr><tr><td> Acousto-optik saptırıcı </td><td> IntraAction </td><td> DTD-274HA6 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop Amaç </td><td> Olimpos </td><td> PlanApo </td><td> 60X, NA 1.4 </td></tr><tr><td> Piezo sahne </td><td> Mad City Labs </td><td> Nano-LP100 </td><td> XYZ sahne </td></tr><tr><td> CCD kamera </td><td> PixeLink </td><td> PL-A741 </td><td></td></tr><tr><td> Fotodetektör </td><td> Elektro-Optik Tech </td><td> ET-3020 </td><td></td></tr><tr><td> Polistiren Boncuk </td><td> Spherotech </td><td> SVP-08-10 </td><td> 800nm, streptavidin kaplı </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin </td><td> Roche </td&gt; <td> 11333089001 </td><td> Koyun Gönderen </td></tr><tr><td> Astarlar </td><td> MWG operon </td><td> Özel Oligolar </td><td> Bir astar: biotin Diğer: digoxigenin </td></tr><tr><td> PCR </td><td> New England Biolabs </td><td> Taq polimeraz, dNTP </td><td></td></tr><tr><td> Coverglass </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diğer kimyasallar için tampon </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Yardımcı Malzemeler A. Hidrodinamik Sürtünme Katsayısı Bir yüzeyine yakın bir mikrosfer bir hidrodinamik sürtünme katsayısını belirlemek için bir genişleme aşağıdaki 5,10 kullanılabilir: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Denklem 1" /> burada aşağıdaki kısaltma solarak ortaya konmuştur: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Denklem 2" /> Sürtünme katsayısı yüzeyi üzerinde bir mesafede yer alır η mikrosfer merkezine sahip, sıvı viskozite η ve mikroküre çapının bakımından tanımlanmıştır. Yaklaşık on şartları genişletilmiş zaman toplamı gayet iyi yakınsar. Sertlik Kalibrasyonu Eksenel Pozisyon B. Etkisi Sertlik kapanı ayarlama yüzeyinden artan uzaklık ile artar kalibrasyon doğruluğu, ve tuzak deneysel olarak kullanılan gerçek bir eksenel pozisyon arasında bir değiş tokuş içerir. Genel olarak, tuzak gerçek deneysel koşul daha yüksek yüzey gelen 800-1000 nm etrafında kalibre edilmiştir. C. Worm-beğendiniz Zincir (WLC) Model Modifiye Kuvvet-uzama eğrileri modifiye WLC m için uygun olabilirodel aşağıda gösterildiği gibi sıfır optik kuvvetinde hacmi dışlama etkileri hesapları: <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Denklem 3" /> F opt optik kuvvet nerede, x o sıfır kuvvete uzantısı için uygun bir parametre olduğunu, x opt kuvvet altında uzantısı, l DNA kontur uzunluğu, ve l * p &quot;etkili ikinci bir uygun parametre &quot;sebat uzunluğu. F WLC zamanki WLC modeli 11 ile verilir <img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Denklem 4" /> burada ε bağıl DNA uzantısıdır.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Az kilobaz daha kontur uzunluklarda DNA germe için Tek molekül tekniklerin deneysel güçlüklerle doludur. Bununla birlikte, bu gibi histon ve DNA bağlayıcı protein, 1,2-aracılı döngü olarak çok ilginç biyolojik etkinlikleri, bu uzunluk ölçek üzerinde meydana gelir. Son yıllarda, DNA mekanik özelliklerini kompakt nükleozom ve kromatin ipliklerinin 3,4 içine DNA paketleme gibi temel hücresel süreçler önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Açıkçası, DNA&#39;nın kısa menziller mekanik özelliklerini anlamak için o önemlidir. Bu yazıda, biz birkaç yüz basepairs gibi kısa kontur uzunluktaki DNA&#39;nın mekanik davranışlarını incelemek için geliştirmiş olduğumuz tek-molekül optik tweezing tekniği için pratik bir kılavuz sağlamak. DNA&#39;nın kısa segmentlerinde gerilmelerde büyük engel, geleneksel optik cımbız genellikle directio kuvvet uygulamak için tasarlanmış olann, aşama 5,6 yanal, (bakınız Şek. 1). Bu geometri olarak, boncuk ve lamel arasındaki açı olan DNA gergin olduğu, mikron uzunlukta DNA için çok dik hale gelir. Eksenel pozisyonunu artık uzatma yakın lamel mikroküre sürükler yana, sterik etkiler geliştirilmiştir, bir meydan okuma olabilir, sorumluydu, ve olmalıdır. Buna ek olarak, mikro asimetri bir sonucu olarak, yan uzantılar oluşturur uzantı boyunca reaktif güç yönü değişirse beri optik tuzak içinde nedeniyle mikrosfer dönme momenti, değişen. Germe Mikronaltı DNA için alternatif yöntemlerin kendilerine özgü engellerin karşı çalıştırın. Örneğin, bir çift-kiriş optik tuzak hangi iki tuzak arasında ve mikroküreler arasında ışık saçılması ikinci nokta parazit etkileri önemli bir sorun teşkil başlar, bir dalga boyu yaklaşık DNA germe ile sınırlıdır. Tuzakları biri DeğiştirilmesiBir mikropipet ile büyük olasılıkla benzer sorunlar muzdarip olacaktır. Biri doğrudan DNA germek için eksenel potansiyel kullanabilirsiniz iken, aktif bir geribildirim düzeni sabit bir kuvvet ve bu bant genişliği özellikle düşük güçlerine, oldukça sınırlı olacaktır uygulamak için gerekli olacaktır. Biz doğrudan sabit bir kuvvet eksenel optik cımbız 7,8 kullanarak lamel uzak DNA çekerek bu temel sorunları aşmak. Bu, optik gücü sabit güç olan lazer gücü ayarlamak suretiyle ayarlanabilir olan optik potansiyel bir doğrusal bölgesinde, boncuk yakalama ile elde edilir. Doğrusal bölgede bindirme ayrıca eksenel yönde yaklaşık 350 nm boyunca uzanan DNA üzerinde bir bütün optik güç kelepçe olarak hizmet vermektedir. Lamel yapışmış bir referans mikroküre, aynı konumda ve odak kalır, böylece Biz aynı anda ince sahne konumunu ayarlayarak termal ve mekanik sürüklenme telafi birneredeyse sınırsız gözlem dönemi için llowing.

Watch this Scientific Journal Video about Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers at JoVE.com

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K Görüntüleme.  University of Michigan. Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Video: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Biyomühendislik

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Antibiyotik Dirençli Stafilokok bakteri tespiti için biyosensör

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Optik cımbız ile Tek RNA Moleküllerin Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...