This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1. إعداد RNA الجزيئات لجزيء واحدة نتف الريش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استنساخ تسلسل الفائدة. استنساخ تسلسل الحمض النووي المقابلة لبنية الحمض النووي الريبي في ناقلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التوليف وتنقية من القالب النسخ. تجميع قالب النسخ بواسطة PCR. [المائدة 1 مكان هنا] التالي، وتنقية المنتجات PCR باستخدام طقم تنقية PCR، وتركيز العينة ل&gt; 200 نانوغرام / ميكرولتر. لأنه يتم استخدام الحمض النووي لتنقية النسخ، ريبونوكلياز المياه مجانا وينبغي أن تستخدم في شطف وتركيز الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في النسخ المختبر. توليف الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ عند 37 درجة مئوية خلال الليل لتعظيم العائد الحمض النووي الريبي. [المائدة 2 مكان هنا] بعد النسخ، إضافة 1 ميكرولتر الدناز أنا لهضم قالب الحمض النووي لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تنقية RNA باستخدام عمود السيليكا زيادة ونقصان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب المقبض المعقدة البيروكسيديز A. الأولى، ينتج مقبض معدلة A عن طريق PCR باستخدام بادئات آف وعار واضربentrate تضخيم الحمض النووي ل&gt; 200 نانوغرام / ميكرولتر. المقبل، تتضمن التعديلات البيوتين في المنتج باستخدام PCR رد فعل تمديد التمهيدي. [المكان الجدول 3 هنا] ملاحظة: المؤشر المعقدة البيروكسيديز ألف (البيوتين-HA) يمكن استخدامها مباشرة في الصلب دون تنقية. كما البيوتين-HA هو أن صلب مع RNA، من المهم جدا لاستخدام ريبونوكلياز المياه مجانا في كل الخطوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيب المقبض المعدلة digoxigenin B. توليف digoxigenin تعديل مقبض B (DIG-HB) بواسطة PCR باستخدام التمهيدي فرنك بلجيكي وتعديل digoxigenin بنسبة ضئيلة حفر-BR (الشكل 3). المقبل، تنقية المنتج PCR وتركيز العينة ل&gt; 200 نانوغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصلب RNA إلى مقابض. يصلب RNA مع مقابض. [مكان الجداول 4 و 5 هنا] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية عينة صلب. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول من العينة صلب وتخلط جيدا. تخزين الخليط في -70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل. تدور باستمرار على 15،800 XG وتجاهل طاف. تجفيف بيليه باستخدام مجفاد. حل بيليه في100 ميكرولتر ريبونوكلياز المياه مجانا. ملاحظة: عينة جاهزة لاستخدامها ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. </li></ol> 2. معايرة وتشغيل ملاقط بصرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة بكسل حجم شاشة فيديو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة مع قطر معروف (حجم قياسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور لحبة المحاصرين باستخدام برامج التصوير (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد قطر حبة باستخدام برامج التصوير على أساس طريقة النقطه الوسطى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذا الإجراء لتحديد أقطار حبات من حجم مختلف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب أقطار قياس ويعرف من الخرز من قبل الانحدار الخطي للحصول على الحجم الفعلي بكسل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من معايرة القطر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام فخ البصرية إلى اعتراض حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف بكسل النقطه الوسطى من خلال البرنامج التقاط الصور وتسجيل موقفها باستخدام Minitweezers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه حبة لزراعية مختلفة<html> استئجار المواقف وتكرار تحديد الموقف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل مواقف X و Y من حبة من بكسل إلى m الوحدة باستخدام حجم بكسل معايرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة X و Y بين المواقف تقاس الفيديو والتي Minitweezers. يجب مجموعتين من القيم نوافق على ذلك. ودقة وضوح الصورة هو&gt; 0.1 ميكرون، حرك حبة أكثر من 1 ميكرون بين القياسات لضمان الدقة. إذا معايرة المسافة ليست مماثلة لتلك المخزنة في Minitweezers، إعادة ضبط الصك. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فخ تصلب المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط حبة باستخدام فخ البصرية والاحتفاظ بها حتى الآن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل قوة في فخ باستخدام الحصول على البيانات بسرعة الالتفافية بمعدل&gt; 5 كيلو هرتز لمدة 3 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد الطاقة من الطيف تسجيل حركة حبة باستخدام البرمجيات. تناسب الطيف السلطة إلى Lorentzian (الشكل 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;العرض =&quot; 200 &quot;/&gt; (المعادلة 1) حيث S (و) هي قوة في تواتر و، ج و هي تردد الزاوية، وS 0 هي قوة مقارب. تردد الزاوية، و ج، هو التردد حيث انخفضت قوة الحركة الحرارية لنصف قيمة مقارب. كما و ج يختلف مع قوة الليزر وحجم حبة، حبة المحاصرين معايرة كل على حدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ثابت الربيع من فخ، κ، من و ج: <img alt="المعادلة 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (المعادلة 2) التي γ هو معامل السحب من حبة (المعادلة 3). استخدام ثابت الربيع لتحديد التغييرات امتداد لRNA من التغيير بالقوة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار قانون ستوكس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط حبة باستخدام فخ البصرية. نقل حبة ذهابا والقوة بسرعة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل حركة حبة وإجبار باستخدام Minitweezers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب نصف قطر حبة. ملاحظة: قوة الاحتكاك، F د، الناتجة عن حركة الجسيمات كروية في السوائل يمكن وصف بموجب القانون ستوكس: <img alt="المعادلة 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (المعادلة 3) حيث r هي نصف قطر الكرة، والخامس هو السرعة، و h هو اللزوجة الديناميكية للسوائل، والتي يمكن العثور عليها في الجداول المرجعية. باستخدام القوة تقاس على أنها F د، نصف قطر حبة يمكن حسابها باستخدام المعادلة. 3 (الشكل 6)، وينبغي أن يتفق مع يحددها البرنامج الحصول على الصور. وستوكس اختبار اختبارات القانون بشكل فعال المعايرة الشاملة والأداء الصك. </li></ol></li></ol> 3. Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل fluidics. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ستة ثقوب (2 مم لكل منهما) على الغطاء الزجاجي رقم 2 (الشكل 7A) وقطع ثلاثة الشقوق (2 ملم العرض) في الوجهين الشريط بوليميد (الشكل 7B) باستخدام الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل غرفة التدفق بواسطة يقحم اثنين من الزجاج غطاء مع طبقتين من الوجهين الشريط KAPTON. إدراج micropipette واثنين من الأنابيب الالتفافية بين الشريط (الشكل 7C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل غرفة التدفق على إطار معدني عن طريق مطابقة الثقوب الموائعية (الشكل 7D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط قنوات الموائعية من الغرفة إلى 10 مل المحاقن مليئة عازلة الاختيار عن طريق شبكة أنابيب من البولي ايثيلين (الشكل 7E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل الغرفة بأكملها على ملاقط بصرية بين الهدفين. تأكد من أن الجانب الأمامي للغرفة مع قنوات الموائعية يواجه نحو اليمين. التراجع عن الهدف الحق والمكونات دبابيس نحاسية من الإطار (الشكل 7E) إلى تصاعد ثقوب على رانه الملقط. تشديد الخناق لتحديد موقف الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط العينة والخرز صلب. مزيج العينة صلب مع حبات المغلفة مكافحة digoxigenin (حفر الخرز)، والسماح للخليط للبقاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة. عادة، يتم خلط 1 ميكرولتر من العينة صلب مع 5 ميكرولتر حفر حبات في 1 مل من العازلة. ملاحظة: كمية من الخرز ليتم تحميلها في غرفة تدفق ينبغي اختيار لضمان وجود كمية معقولة من الخرز ليتم تسليمها من الأنبوب تجاوز. نسبة من العينة صلب إلى الخرز لا يمكن قياسها كميا بسهولة. في الحالة المثالية، ومعظم حبات ليس لها RNA هذا أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخرز قد يكون جزيء RNA واحد فقط لكل حبة. كما العينات صلب وتعليق حبة يصعب قياسها كميا، وأفضل وسيلة فقط حاليا هو أن تختلف نسبة الخلط واختبار الخليط على ملاقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حبات لموقع رد الفعل في غرفة التدفق (أي بضعة ميكرومتر على رأس ميلغيض cropipette، الشكل 7C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل تعليق الخرز streptavidin المغلفة (بكتيريا الخرز) في حقنة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط المحقنة إلى الأنبوب فلويديك المؤدية إلى قناة السفلى من غرفة التدفق (الشكل 7A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع الحقنة في التدفق على بكتيريا الخرز في الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غرفة بأكملها باستخدام برامج التحكم في المحركات لوضع فخ الضوئية قرب افتتاح أنبوب التفافي السفلي (الشكل 7B). ثم تعمل في فخ البصرية من قبل كرة لالتقاط بكتيريا حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حبة قريبة من غيض من micropipette باستخدام برنامج التحكم في المحركات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب حقنة متصلة micropipette لامتصاص حبة على micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق تدفق برفق عن طريق الضغط على حقنة إلى القناة الوسطى لطرد إضافية بكتيريا الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبالمثل، تقديم مزيج من العينة والخرز حفر (راجع الخطوة 3.2) إلى القناة العليا من الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القبض على حفر حبة وجعله على مقربة من بكتيريا حبة باستخدام فخ البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف القناة الوسطى من خلال تطبيق التدفق. ملاحظة: strep- وحفر الخرز يتم اختيار أن تكون أحجام مختلفة بحيث يمكن تمييزها بصريا تحت نظر المجهري (الشكل 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصيد &quot;على جزيء واحد يربطون بين زوج من الخرز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حفر حبة عموديا على أعلى من بكتيريا حبة (الشكل 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حفر حبة أسفل نحو بكتيريا حبة من توجيه الفخ. فتح نافذة مؤامرة القوة لمسافات على جهاز الكمبيوتر لتصور التغييرات القوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء على اتصال من الخرز اثنين، حرك حفر حبة عموديا بعيدا عن بكتيريا حبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم إجراء أي اتصال معين، تبقى قوة الصفر تقريبا. إذا كنت متصلا حبات اثنين من الجزيئات، ويزيد من قوة بشكل ملحوظ عندما فصل حبات اثنين. هذا الإجراء، ويشار إليها باسم &quot;الصيد&quot;، وغالبا ما يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed عدة مرات على كل زوج من الخرز للعثور على حبل فعال واحدة جزيء. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

<html> تعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في إعداد العينات نتف الريش اختيار الاستنساخ المتجهات. على الرغم من أن المخطط العام الموصوفة هنا (الشكل 3) لا يتطلب ناقلات الاستنساخ خاص، ويفضل متجه ليس لديهم T7 جوهري أو T3 ...

منذ فترة طويلة رافقت تطور تقنية ملاقط بصرية مع تطبيقه في الأبحاث البيولوجية. عندما اكتشفت لأول مرة تأثير محاصرة البصرية، لاحظ آرثر Ashkin أن البكتيريا في المياه الملوثة يمكن محاصرين في التركيز الليزر 1. منذ ذلك الحين، أصبحت محاصرة البكتيريا وغير مقصود، تجربة ممتعة لأجيال من طلاب الفيزياء الحيوية وكذلك أداة بحثية جادة لدراسة علم وظائف الأعضاء الميكروبية 2،3. تستخدم تقنية محاصرة البصرية شعاع الليزر مركزة لشل حركة كائن مجهري 1. عمليا، فخ الليزر وظائف باعتباره الربيع البصري، الذي يقيس أيضا القوة (F) على الكائن المحاصرين من النزوح لها من مركز فخ (ΔX). ضمن نطاق قصير، F = κ س ΔX، في κ هو ثابت ربيع الفخ. فخ البصرية يمكن أن تستخدم لممارسة القوة في picoNewton (PN) الدقة إلى صغار جداالكائن copic وقياس موقفها مع نانومتر الدقة. في العقدين الماضيين، أصبحت ملاقط بصرية واحدة من التقنيات جزيء واحد الأكثر استخداما في الفيزياء الحيوية. واستخدمت هذه التقنية لدراسة لطي واليات 4-6 DNA، RNA 7-9، والبروتينات 10،11. كما تم استخدام ملاقط بصرية لمراقبة تكرار الحمض النووي 12، RNA النسخ 13، وتخليق البروتين 14،15، فضلا عن العديد من الأحداث الجزيئية البيولوجية الأخرى 16-18. ويعمل نهج واحد جزيء RNA في البحوث الهيكلي أساسا لاستكشاف المناظر الطبيعية الوعرة الطاقة للطي من الحمض النووي الريبي. تسلسل RNA يمكن طيها عادة في هياكل متعددة مستقرة ويستبعد بعضها بعضا، وذلك بسبب قواعد التركيب الكيميائي والتقشير قاعدة بسيطة من الحمض النووي الريبي. منذ فترة طويلة كان من المعروف أن RNA تعدد الأشكال الهيكلية، مثل أن يحدث في riboswitches 19،20، يلعب دورا هاما في تنظيم الجينات. وrecenوقد كشف مسح ر الجينوم على نطاق أن تغيرات درجة الحرارة صغيرة مثل بضع درجات تؤثر بشكل كبير هيكل والبروتين من جزء كبير من Transcriptome على الخلوي 21. تلميحات هذا المثال أن الدور البيولوجي للRNA البديل للطي هو ربما أكثر أهمية وانتشارا مما كان يفترض سابقا. تعدد الأشكال الهيكلي، ومع ذلك، يشكل تحديا للنهج البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية التقليدية، التي تدرس متوسط ​​خصائص العديد من الجزيئات. على سبيل المثال، &quot;على&quot; والتشكل &quot;OFF&quot; لriboswitch حصرية بشكل متبادل. هيكل المتوسط ​​المستمدة من الهياكل غير متجانسة من غير المحتمل أن تشبه أي من المتشاكلات ذات الصلة من الناحية البيولوجية. وعلاوة على ذلك، RNA الأهرام ومرنا عادة ما تشكل الهياكل. تفاعلها مع البروتينات والرنا التنظيمية يتطلب عادة تتكشف من الهيكل الحالي كجزء من التفاعل. لذلك، ودراسة RNA تتكشف / refolding يصبح وثيقة الصلةقضية البيولوجيا RNA. لمواجهة مثل هذا التحدي، فقد تم توظيف نهج واحد جزيء RNA لكشف تعدد الأشكال الهيكلي من خلال دراسة جزيء في وقت واحد 22-27. بالمقارنة مع شعبية واحدة جزيء طريقة مضان، ملاقط استنادا الميكانيكية تتكشف تقدم ميزة أن التشكل من الجزيئات الفردية يمكن التلاعب بالقوة التطبيقية وقياسها بدقة نانومتر. ويمكن استخدام هذه القدرة nanomanipulation لمراقبة تتكشف / للطي من المجالات البنيوية الفردية بحيث للطي الهرمي من RNA كبير يمكن تشريح 28. بدلا من ذلك، ضفيرة واحدة يمكن أن توجه إلى أضعاف في واحدة من عدة المتشاكلات. أو هيكل قائم يمكن أن يتسبب ميكانيكيا لrefold إلى التشكل مختلفة 29. تحت الظروف البيولوجية، بنية RNA يمكن تغييرها بناء على التغير في درجة الحرارة أو يجند ملزمة. القدرة على التلاعب مباشرة ق الجزيئيةtructure يفتح مكان جديد من الحمض النووي الريبي دراسة الهيكلية. من حيث المبدأ، والتقنيات الميكانيكية الأخرى، مثل مجهر القوة الذرية وملاقط المغناطيسية، يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة لطي من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة. ومع ذلك، هذه الطلبات تقتصر إلى حد كبير نظرا لدقة المكاني منخفض نسبيا 30. توظيف ملاقط بصرية يسمح الهياكل RNA أن تكشفت بالقوة الميكانيكية. ميزة الميكانيكية التي تتكشف هي عدة أضعاف. ويمكن استخدام القوة لتتكشف الهياكل كلا الثانوية والثالثية، في حين ايونات المعادن ويجند الناجم لطي تقتصر أساسا إلى هياكل التعليم العالي. درجة الحرارة وممسخ يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على أنشطة المياه والمواد المذابة. في المقابل، يتم تطبيق قوة محليا إلى التشويش على الهياكل الجزيئية. تأثير القوة على البيئة المحيطة لا يكاد يذكر. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام أفضل ذوبان الحراري لدراسة ديناميكا الحرارية للطي الهياكل RNA الصغيرة،في حين تم استخدام ملاقط بصرية لدراسة الهياكل RNA مع أحجام مختلفة، تتراوح بين سبعة tetraloop دبوس قاعدة الزوج 28 إلى ribozyme 400 النوكليوتيدات 31. وعلاوة على ذلك، والهياكل RNA يمكن تكشفت ميكانيكيا في درجات حرارة متوسطة الحرارة. في المقابل، تتكشف الرنا في تجربة ذوبان الحرارية، ودرجة الحرارة وعادة ما المثارة أعلاه جيدا درجات الحرارة الفسيولوجية، مما يزيد بشكل كبير RNA المائي، خاصة في وجود أيونات المغنيسيوم 2+. من المهم أن نلاحظ أن التأثير الميكانيكي للقوة يعتمد على كيفية تطبيقه على هيكل. قوة التطبيقية يميل المشهد الطاقة للطي. على سبيل المثال، عندما يتم تطبيق قوة إلى منعطف حاد، يتم تقسيم أزواج قاعدة بالتتابع، في وقت واحد (الشكل 1A). شوكة تمزيق تقدم على طول محور حلزونية، وهو عمودي على القوة المستخدمة. في المقابل، عندما مجمع التقبيل الحد الأدنى هو تحت التوتر، وهما التقبيلأزواج قاعدة، هي موازية للقوة التطبيقية، تبادل الحمل القوة (الشكل 1B). هندستها مختلفة من دبوس الشعر والتقبيل قريب معقدة إلى نتيجة القوة المطبقة في استجابتها الميكانيكية المختلفة، والتي يمكن استخدامها للتمييز بين الثانوي والعالي للطي 28،32. تم استعراض الجانب النظري من الميكانيكية التي تتكشف في وقت سابق 8،9،30. ويعرض هذا العمل النهج الأساسية لإعداد وتنفيذ واحد جزيء الميكانيكية فحص تتكشف. الإعداد التجريبية. في تجربة سحب الميكانيكية لدينا، وتتكون عينة الحمض النووي الريبي لنتف الريش من الحمض النووي الريبي التي تهم يحيط بها اثنان مقابض DNA / RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الشكل 2) 7. يمكن المربوطة الجزيء بأكمله لاثنين من الخرز ميكرون حجم المغلفة سطح (Spherotech) عبر streptavidin البيوتين وتفاعلات الأجسام المضادة digoxigenin-مكافحة digoxigenin، على التوالي. يقام حبة واحدة من قبل آر البصرية قياس القوةا ف ب، في حين أن الآخر هو عقد على غيض من micropipette. المسافة النسبية بين حبات يمكن تغيير إما عن طريق توجيه فخ أو نقل micropipette. باستخدام هذا النهج، جزيء RNA وحيد يربطون حبات يمكن أن تمتد والاسترخاء. إعداد العينات. تجميع عينات الحمض النووي الريبي لنتف الريش يتضمن خطوات قليلة (الشكل 3). أولا، يتم استنساخ تسلسل الحمض النووي RNA المقابلة لمن الفائدة لأول مرة في ناقلات البلازميد. بعد ذلك، يتم تنفيذ ثلاثة تفاعلات PCR لتوليد اثنين من مقابض وقالب لالنسخ. القالب النسخ يشمل المناطق المقبض وتسلسل المدرجة. يتم تصنيعه طول RNA كاملا في المختبر النسخ. أخيرا، ويلدن الحمض النووي الريبي ومقابض معدلة كيميائيا معا لتوليد جزيئات لنتف الريش. معايرة وتشغيل الملقط. التصميم الأساسي لاستخدام Minitweezersد في هذا العمل يتبع ذلك من ملاقط بصرية مزدوجة شعاع 33. مع العديد من التحسينات، عرض Minitweezers الاستقرار الاستثنائي بالمقارنة مع ملاقط بصرية الجيل الأول. وهناك عدد من المجموعات البحثية في العديد من البلدان استخدام Minitweezers في مجال البحوث جزيء واحد من 14،15،34-37. تفاصيل البناء، والمعايرة، وتشغيل الجهاز، بما في ذلك أشرطة الفيديو التعليمية، وتتوفر في &quot;الملقط لاب&quot; على الانترنت (http://tweezerslab.unipr.it). هنا، يتم وصف التحسينات وإجراءات المعايرة التي تحتاج إلى أن يقوم على أسس اليومية بالتفصيل.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

هو كتب جزء كبير من الجينوم البشري ولكن لم تترجم. في هذا العصر الجينومي آخر، وقد تبين أن المهام التنظيمية من الحمض النووي الريبي لتكون ذات أهمية متزايدة. وظيفة RNA غالبا ما يعتمد على قدرته على اعتماد هياكل بديلة، فمن الصعب التنبؤ RNA الهياكل ثلاثية الأبعاد مباشرة من التسلسل. يقترب احد جزيء تظهر إمكانات لحل مشكلة RNA تعدد الأشكال الهيكلي من خلال مراقبة الهياكل الجزيئية جزيء واحد في كل مرة. يقدم هذا العمل وسيلة للتلاعب على وجه التحديد للطي وبنية جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة باستخدام ملاقط بصرية. أولا، طرق لتجميع وصفها جزيئات مناسبة للجزيء واحد العمل الميكانيكي. وتناقش المقبلة، مختلف الإجراءات المعايرة لضمان عمليات السليم للملاقط بصرية. المقبل، وأوضح تجارب مختلفة. للتدليل على فائدة هذه التقنية، نتائج تتكشف ميكانيكيا دبابيس الشعر RNA و RNA واحد كيسينوتستخدم ز مجمع كدليل. في هذه الأمثلة، تم استخدام تقنية nanomanipulation لدراسة لطي من كل مجال الهيكلي، بما في ذلك الثانوية والثالثية، بشكل مستقل. وأخيرا، وتناقش القيود والتطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة.

محدودة من الفضاء، ويتجلى nanomanipulation من جزيئات الحمض النووي الريبي واحدة من خلال عرض أمثلة الميكانيكية الوحيدة التي تتكشف من دبابيس الشعر وRNA RNA مع هيكل العالي. التلاعب الجزيئات واحدة دبوس الشعر <p class="jove_content" style=";text-align:rig...

Watch this Scientific Journal Video about Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers at JoVE.com

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulation من واحدة RNA الجزيئات بواسطة الملقط البصرية

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K Views.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

Video: Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

تمتد سلاسل قصيرة من الحمض النووي مع ثابت القوة المحورية الملقط البصري

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

المضاعفة واحدة جزيء القياسات التحلل البروتيني باستخدام الملقط قوة مغناطيسية

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

في تركيب المختبر من تباعد الليفية الأصلية، طويل والقطاعي الكولاجين تباعد طويل

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

كشف البصري<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا عن طريق أجهزة الاستشعار السيليكون Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

الملقط المغناطيسي لقياس تطور وعزم الدوران

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

تسمية خالية واحدة كشف الجزيئة عن طريق Microtoroid البصرية الرنين

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...