وأيد هذا العمل من قبل المنحة الملكية URF المجتمع UF051616، المملكة المتحدة، ومجلس البحوث الأوروبي STG منحة 243261 إلى BS. كما يدعم العمل في مختبر MZ من معهد كاليفورنيا للالتجدد الطب منحة RB1-01417.

1. العصبية العزلة السلف الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح دماغ كامل من E14-16 الفئران والمتوسطة في مكان بارد DMEM/F12 القاعدية. إزالة جميع السحايا تحت مجهر تشريحي والعقول نقل في طبق بيتري 35 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة على فصل ميكانيكيا العقول إلى أجزاء الأنسجة ونقلها إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي ثم العينات في 800 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق لإزالة الأنقاض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMEM/F12 bFGF والتي تحتوي على صندوق تعديل العولمة الأوروبي ويسحن مع ماصة 1 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية للحصول على تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في قوارير في 2-5 X 10 4 خلية / مل، ثم نفذ وسيلة تغيير كامل في كل 3 أيام، ومرور الخلايا كل 6 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد لا يقل عن 5 فقرات، هضم neurospheres إلى الخلايا واحد باستخدام التربسين وEDTA وتنمو في غرف electrotactic poly-D-lysine/laminin-coated (أعدت على النحو المبين أدناه في 2). استخدام المتوسطة المتنامية التي تحتوي على N2، الملحق،bFGF وEGF في جميع الأوقات للحفاظ على خصائص الشخصيات. </li></ol> 2. إعداد غرفة electrotactic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 22 × 11 مم من شرائح الزجاج بقسمة تعقم 22 × 22 مم سمك coverslips NO.1 في نصف باستخدام قلم الماس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء زجاج قائمة بذاتها تماما من الأبعاد الداخلية 22 × 10 ملم من قبل الإلتصاق معا أربعة يقف عموديا 22 × 11 مم مع شرائح سيليكون الشحوم عالية فراغ. السماح للآبار حتى يجف تماما وتتصلب بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، ونعلق 2 22 × 11 ملم الزجاج الشرائط، وموازية لبعضها البعض مما يترك فجوة من 10 ملم، على قاعدة طبق ثقافة 100 ملم باستخدام الشحوم سيليكون. اغلاق المنطقة بين هذه الشرائط من خلال وضع 22 × 22 ملم الغطاء زلة في كل نهاية، تعلق على الجزء السفلي من الطبق مع الشحوم من ثلاث جهات، ولكن ليس أن الأقرب إلى مركز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع زجاج إعدادا جيدا في الخطوة 2.2 على غطاء ينزلق حتى الجدران الداخلية خلق مساحة محصورة لبذرالخلايا على الجزء السفلي من لوحة. المياه واقية من جميع المفاصل مع الشحوم سيليكون. معطف هذه المنطقة المحصورة بالتتابع مع laminin ثم بولي-D-يسين: إضافة 1 مل بولي-D-يسين الى داخل القاعة ويترك لمدة 5 دقائق للسماح للبولي-D-يسين لربط الجزء السفلي من لوحة؛ غسل الغرفة مع برنامج تلفزيوني العقيمة مرتين، ثم تمييع laminin في برنامج تلفزيوني العقيمة لانتاج 20 ميكروغرام / مل واستخدامها لتغطية الجزء السفلي من لوحة. ترك في درجة حرارة الغرفة خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وخلايا الحصاد وإعداد 1 مل من تعليق تحتوي على 1 × 104 خلايا. إزالة laminin من الزجاج أيضا، مما يسمح للهواء جاف تماما، واستبدالها مع 1 مل من تعليق خلية. وضع الطبق في الحاضنة في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات للسماح للمرفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في الخلايا هي متكدسة بما فيه الكفاية إزالة جميع متوسطة من الغرفة. إزالة بعناية الزجاج جيدا. يشكل وجود سقف فوق الخلايا عن طريق ربط بعناية، مع الشحوم سيليكون، وهو مشبع 22 × 22 ملم الزجاج ساترةسد بين الاثنين 22 × 11 مم الشرائط. تغطي الخلايا مع بضع قطرات من المتوسط ​​لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشكل خزان متوسط ​​معزولة في نهاية كل من الغرفة عن طريق خلق 2 الشحوم سيليكون حواجز للماء التي تعمل من حافة واحدة من الطبق إلى أخرى، وعلى سقف الغرفة. تملأ الغرفة مع متوسط ​​الطازجة، وضمان التدفق من خلال الخزان المتوسطة من واحدة إلى أخرى. إعادة الإناء إلى الحاضنة لمدة 12 ساعة للسماح لاسترداد الخلية. </li></ol> 3. تطبيق مجال كهربائي إلى الدائرة electrotactic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد غطاء لتغطية صحن من خلال حفر اثنين من الثقوب، واحد وضعه فوق كل خزان للغرفة الهجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال جميع المتوسطة في غرفة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 25 العازلة HEPES ملم ونقل طبق على نظام التصوير التحكم في درجة حرارته. إعداد المعلمات التجريبية للمضي الوقت وتسجيل موقف متعددة. محاذاة غرفة بحيث الكاثود والأنود وعلى اليسار واليمين على التوالي، للتأكد من أن ناقلات EF يمتد أفقيا ينظر إلى أسفل المجهر وتسجيلها في نظام التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ملء الأكواب مع حل شتاينبرغ في (58 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.67 ملي بوكل، 0.44 ملي الكالسيوم (لا 3) 2 0.4 H 2 0، 1.3 ملي MgSO 4 0.7 H 2 0 و 4.6 ملم قاعدة Trizma، ودرجة الحموضة 7.4). ربط دورق منفصل لكل خزان المتوسطة باستخدام الجسور زجاج معدة سلفا (أنابيب زجاجية ~ 13 سم طويلة و~ 3 مم في القطر، وعقدوا العزم في شكل-U عن طريق التسخين في لهب بنسن)، مليئة 2٪ (ث / ت) Steinberg&#39;s-أجار حل، ويمر من خلال الفتحات الموجودة في غطاء. استكمال الدائرة الكهربائية عن طريق وضع جي / أجكل أقطاب موصلة بمصدر التيار المستمر في كل كوب من حل لشتاينبرغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعة الاتصال الهاتفي الجهد على إمدادات الطاقة إلى 0 والتبديل في. قياس الجهد عبر غرفة electrotactic في حين تحول حتى الاتصال الهاتفي الجهد، وذلك باستخدام مقياس الجهد، وتعديل لتتناسب مع متطلبات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تسجيل مرور الزمن. إجراء تغيير المتوسطة وتعديل التيار الكهربائي، كما هو مطلوب، في كل ساعة. ويمكن إضافة المتوسطة الطازجة، والمخدرات، أو العوامل الكيميائية إلى الخزانات على النحو المطلوب. عندما تغير اداء متوسط، يمكن اعتبار خياران على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NO.1 خيار - لإيقاف التسجيل مؤقتا مرور الزمن، وإزالة بعناية الجسور الزجاجية من غرفة لتجنب احداث بلبلة غطاء الغطاء، واستخدام معقم ماصة باستير بلطف استبدال جميع المتوسطة مع المتوسطة الطازجة ووضع الجسور والزجاج الخلفي، ثم استئناف عملية التسجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NO.2 الخيار - بدلا من ذلك، جعل العرف غطاء الغطاء مع 4 فتحات (2 وضعه فوق كل خزان للغرفة الهجرة) يمكن أن تستخدم أيضا لغرض التغيير المتوسطة. اثنين من الجسور لربط الزجاج، والاثنان الآخران لتغيير المتوسطة. الخيار 2 يسمح التسجيل المتواصل دون تدخل خلال تغيير المتوسطة. </li></ol></li></ol> 4. إعداد شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح lumbالحبال AR الشوكي من 2 BL الاسبوع C57 القديمة / 6 الفئران. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة النخاع الشوكي إلى أجزاء ميكرون سميكة مع 500 مروحية الأنسجة McIlwain. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح منفصلة تحت مجهر تشريحي وحدد شرائح سليمة مع سهمي / هيكل محوري في الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شرائح لوحة في طبق بيتري 35 ملم تحتوي على 30 Matrigel ميكرولتر ووضعها أقرب إلى مركز ممكن، والحفاظ عليها في حاضنة 5٪ CO 2 في 37 درجة مئوية على الأقل 30 دقيقة حتى البروتينات Matrigel الذاتي تجميع لإنتاج طبقة رقيقة تغطي سطح شريحة الحبل الشوكي. من المهم جدا للتأكد من أنه قد تم تجميعها Matrigel تماما، واحتضان طبق بيتري في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 4-6 مل DMEM/F-12 المتوسطة التي تحتوي على 25 العازلة HEPES ملم و15-20٪ مصل العجل الجنين بلطف جدا وذلك لتجنب تدفق المتوسطة مباشرة على شريحة. ضمان عدم شريحة غارقة تماما في المتوسط، وترك على سطح explants تتعرض بشكل جيد للفي الهواء. تغيير متوسطة مرتين أسبوعيا. </li></ol> 5. حقن من الشخصيات 33342 هويشت المسمى في شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد تعليق مجلس الشعب في 1 × 10 6 خلية / ميكروليتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل احتضان تعليق خلية في المتوسط ​​مع 5 ميكرون هويشت 33342 لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أنبوب شعري من الزجاج على microinject 2 ميكرولتر من تعليق إلى شريحة الحبل الشوكي ببطء تحت المجهر. تأكد الشعرية أنبوب زجاجي يمر عبر matrigel (الجزء الوردي تحت المجهر)، وتصل إلى داخل شريحة الحبل الشوكي (نسيج رمادي تحت المجهر)، ويبقى داخل شريحة الحبل الشوكي ما لا يقل عن 30 ثانية لتجنب تعليق خلية دهس. وضع طبق بتري تحتوي على شريحة الحبل الشوكي في الحاضنة (37 درجة مئوية 5٪ CO 2) وتترك طوال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اليوم التالي، وتطبيق EF من 500 MV / مم الى شريحة تحتوي على النخاع الشوكي هويشت 33342 ذات العلامات الشخصيات في غرفة electrotactic (باستخدام الأساليب المذكورة في3). </li></ol> 6. ممثل النتائج عندما تعرضت اللجان التحضيرية الوطنية إلى مجموعة من الأجزاء التماثلية الصور الفسيولوجية أظهروا الموجهة للغاية هجرة الخلية نحو القطب السالب (الشكل 1). وأشير أيضا إلى الملاحظة نفسها على مستوى خلية واحدة على عضوي النمط شريحة الحبل الشوكي نموذج الجسم الحي السابقين، وهو محاكاة بيئة 3D في ظروف فيفو (الشكل 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" /> الشكل 1. الشخصيات تظهر هجرة موجهة في الأجزاء التماثلية الصور. وأظهرت أجهزة الهجرة الموجهة نحو القطب السالب للغاية عندما تتعرض لنظام تشفير الملفات، الخطوط الحمراء والأسهم الزرقاء تمثل مسارات واتجاه حركة الخلية (A). (ب) ويبين مسارات هجرة من الشخصيات. شريط: 50 ميكرون. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" /> الشكل 2. الشخصيات المزروع تظهر هجرة موجهة نحو القطب السالب في شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط </stرونغ&gt;. (أ) تم زرع الشخصيات المسمى مع هويشت 33342 إلى شريحة الحبل الشوكي عضوي النمط في نقطة الانطلاق للعلاج EF. هاجر الشخصيات إتجاهي نحو القطب السالب لمدة 2.5 ساعة، وعند هذه النقطة كان عكس قطبية EF (B). تغيير EF قطبية تسبب في تراجع حاد من انجذاب كهربي نحو القطب السالب الجديدة (C). (د) صورة من الشخصيات المزروعة داخل شريحة الحبل الشوكي في نهاية تسجيل مرور الزمن. (ه) وإعادة الإعمار 3D من الشخصيات المزروعة داخل شريحة الحبل الشوكي. وكان 3D أقسام المسح 300 ميكرون في سمك، بدءا من وسط وتنتهي في الجزء السفلي من شريحة. الخطوط المنقطة تشير إلى المواضع النسبية للسكان نفسه من الخلايا المزروعة في البداية، انعكاس، ونقطة نهاية العلاج EF (A - C، على التوالي). رؤوس السهم تشير إلى عدد السكان نفسه من الشخصيات 33342 هويشت باللقاء. شريط: 50 ميكرون.

<ol>
	<li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+with+electric+potential.">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li><li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+cell+behavior+electrically:+current+views+and+future+potential.">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li><li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord.">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li><li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans:+a+phase+1+trial.">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li><li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons.">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li><li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem&#47;progenitor+cell+migration.">Direct-current electrical field guides neuronal stem&#47;progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li><li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors.">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice:+significance+for+cell+transplantation+therapy.">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li><li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice:+significance+for+cell+transplantation+therapy.">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li><li>Song, B., Gu, Y., Pu, j. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo.">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li></ol>

ليس لدينا ما يكشف.

وتستند البروتوكولات التي نستخدمها في الدراسات السابقة 5،11. يمكن الحفاظ على الأوضاع الحالية باستخدام هذه الأساليب، ثقافة مستقرة والكهربائية في حين بتطبيق EF عبر الجسور أجار، حل شتاينبرغ، والأقطاب الكهربائية AG / أجكل، إلى خلايا أو شرائح تربيتها في غرف electrotactic مص?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> جمعية جيل المستقبل، من حقوق الإنسان الأساسية المؤتلف </td><td> إينفيتروجن </td><td> PHG0026 </td><td> 20 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> EGF الإنسان المؤتلف </td><td> إينفيتروجن </td><td> PHG0311 </td><td> 20 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> N2-الملحق (100X) السائل </td><td> إينفيتروجن </td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 المتوسطة (الجلوكوز عالية) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td> بولي-D-ليسين </td><td> ميليبور </td><td> A-003-E </td><td></td></tr><tr><td> الطبيعية الماوس Laminin </td><td> إينفيتروجن </td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td> تخفيض عامل النمو البدروم مصفوفة غشاء (Matrigel) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </TD&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES العازلة </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> McIlwain الأنسجة المروحية </td><td> وMickle مختبر الهندسة المحدودة </td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td> داو كورنينج الشحوم سيليكون عالية فراغ </td><td> سيغما الدريخ </td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

electric field-controlled directed migration of neural progenitor cells in 2d and 3d environments

الحقول الكهربائية الذاتية (EFS) بشكل طبيعي في الجسم الحي، وتلعب دورا حاسما خلال الأنسجة / جهاز تنمية والتجديد، بما في ذلك من 1،2 الجهاز العصبي المركزي. يتم إنشاء هذه الأجزاء التماثلية الصور الذاتية عن طريق التنظيم الخلوي للنقل الأيونية جنبا إلى جنب مع المقاومة الكهربائية من الخلايا والأنسجة. فقد أفيد أن التطبيقية EF العلاج يمكن أن يشجع على إصلاح وظيفي من إصابات في النخاع الشوكي في الحيوانات والبشر 3،4. على وجه الخصوص، وقد تجلى EF الموجه هجرة الخلية في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 5،6، بما في ذلك الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) 7،8. تطبيق مباشر الأجزاء التماثلية الصور (DC) الحالية ليست تقنية متاحة عادة في معظم المختبرات. وقد وصفت نحن بروتوكولات مفصلة لتطبيق الأجزاء التماثلية الصور DC إلى الخلايا والأنسجة الثقافات 5،11 سابقا. هنا نقدم تظاهرة الفيديو من الأساليب القياسية استنادا إلى قوة الحقل المحسوب لاقامة 2D 1د بيئات 3D لاللجان التحضيرية الوطنية، والتحقيق في الاستجابات الخلوية لتحفيز EF في كل الظروف نمو الخلايا واحد في 2D، وعضوي النمط شريحة الحبل الشوكي في 3D. وcordslice الشوكي هو نسيج المتلقي المثالي لدراسة السلوكيات مجلس الوطنى المجراة سابقا، في مرحلة ما بعد زراعة الأعضاء، لأنه يتم الحفاظ عليها بشكل جيد في تنظيم أنسجة التهندس الخلوي ضمن هذه الثقافات 9،10. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا النموذج الحي السابقين يسمح أيضا الإجراءات التي لم تكن ممكنة من الناحية التقنية لتعقب الخلايا في الجسم الحي باستخدام الوقت الفاصل بين تسجيل على مستوى خلية واحدة. من الضروري للغاية لتقييم السلوكيات خلية في بيئة ليس فقط 2D، ولكن أيضا في حالة من عضوي النمط 3D التي mimicks على البيئة في الجسم الحي. وسوف يسمح هذا النظام عالية الدقة التصوير باستخدام غطاء زجاجي على أساس الأطباق في الأنسجة أو ثقافة الجهاز مع تتبع 3D الهجرة خلية واحدة في المختبر، والمجراة سابقا ويمكن أن تكون خطوة وسيطة قبل الانتقال الى السادسنماذج فو.

Watch this Scientific Journal Video about Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments at JoVE.com

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

هذا البروتوكول يوضح الأساليب المستخدمة في تهيئة بيئات 2D و 3D في غرف electrotactic مصمم خصيصا، والتي يمكن تعقب الخلايا<em&gt; في الجسم الحي / خارج الحي</em&gt; استخدام الوقت الفاصل بين تسجيل على مستوى خلية واحدة، من أجل التحقيق في انجذاب غلفاني / انجذاب كهربي والاستجابات الخلوية الأخرى إلى تيار مباشر (DC) المجالات الكهربائية (EFS).

الكهربائية الميدانية التي تسيطر عليها هجرة إخراج من الخلايا العصبية السلف في البيئات 2D و 3D

Endogenous electric fields (EFs) occur naturally in vivo and play a critical role during tissue/organ development and regeneration, including that of the ...

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Views.  Cardiff University. هذا البروتوكول يوضح الأساليب المستخدمة في تهيئة بيئات 2D و 3D في غرف electrotactic مصمم خصيصا، والتي يمكن تعقب الخلايا في الجسم الحي / خارج الحي استخدام الوقت الفاصل بين تسجيل على مستوى خلية واحدة، من أجل التحقيق في انجذاب غلفاني / انجذاب كهربي والاستجابات الخلو?...

Video: Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

زراعة خلايا العصبية السلف في هيدروجيل 3 الابعاد الذاتي تجميع الببتيد

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

طلب خلايا واحدة والأجنة واحدة في 3D الحبس: جهاز جديد لفحص المحتوى العالي

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Electrotaxis Studies of Lung Cancer Cells using a Multichannel Dual-electric-field Microfluidic Chip

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of physiological dcEF in guiding cell movement during embryo development, cell differentiation, and wound healing has been demonstrated in many studies. By applying microfluidic chips to an electrotaxis assay, the investigation process is shortened and experimental errors are minimized. In recent years, microfluidic devices made of polymeric substances (e.g., polymethylmethacrylate, PMMA, or acrylic) or polydimethylsiloxane (PDMS) have been widely used in studying the responses of cells to electrical stimulation. However, unlike the numerous steps required to fabricate a PDMS device, the simple and rapid construction of the acrylic micro&#64258;uidic chip makes it suitable for both device prototyping and production. Yet none of the reported devices facilitate the efficient study of the simultaneous chemical and dcEF effects on cells. In this report, we describe our design and fabrication of an acrylic-based multichannel dual-electric-field (MDF) chip to investigate the concurrent effect of chemical and electrical stimulation on lung cancer cells. The MDF chip provides eight combinations of electrical/chemical stimulations in a single test. The chip not only greatly shortens the required experimental time but also increases accuracy in electrotaxis studies.

Many microfluidic devices have been developed for use in the study of electrotaxis. Yet, none of these chips allows the efficient study of the simultaneous chemical and electric-field (EF) effects on cells. We developed a polymethylmethacrylate-based device that offers better-controlled coexisting EF and chemical stimulation for use in electrotaxis research.

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

The behavior of directional cell migration under a direct current electric-field (dcEF) is referred to as electrotaxis. The significant role of ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

2D و 3D مصفوفات لدراسة إنفادوسوم الخطي تشكيل والنشاط

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

التلاعب بالخلايا الجذعية العصبية والخلايا العصبية في شرائح الدماغ باستخدام الحقن المجهري الروبوتي

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell culture system that was used for a long-term cell differentiation study using microscopy. The microfluidic system consists of the following major components: an optically transparent electrotactic chip, a transparent indium-tin-oxide (ITO) heater, a culture media-filling pump, an electrical power supply, a high-frequency power amplifier, an EF multiplexer, a programmable X-Y-Z motorized stage, and an inverted phase-contrast microscope equipped with a digital camera. The microfluidic system is beneficial in simplifying the overall experimental setup and, in turn, the reagent and sample consumption. This work involves the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) induced by direct current (DC) pulse stimulation. In the stem cell maintenance medium, the mouse NPCs (mNPCs) differentiated into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes after the DC pulse stimulation. The results suggest that simple DC pulse treatment could control the fate of mNPCs and could be used to develop therapeutic strategies for nervous system disorders. The system can be used for cell culture in multiple channels, for long-term EF stimulation, for cell morphological observation, and for automatic time-lapse image acquisition. This microfluidic system not only shortens the required experimental time, but also increases the accuracy of control on the microenvironment.

In this study, we present a protocol for the differentiation of neural stem and progenitor cells (NPCs) solely induced by direct current (DC) pulse stimulation in a microfluidic system.

تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

أجهزة المجال الكهربائي والمغناطيسي لتحفيز الأنسجة البيولوجية

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...