وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة شهادة NSF (MCB0954016) والطاقة الحيوية وزارة الطاقة بحوث غرانت (DEFG0208ER64694).

<html> 1. ثقافة الخلية (الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زراعة خلايا في المتوسط ​​مع الحد الأدنى من العناصر النزرة والأملاح والفيتامينات ، وركائز الكربون المسمى تحديدا على أن أفضل طريق للتحقيق. إما استخدام قوارير الهز أو المفاعلات الحيوية للثقافة الخلية. المواد الغذائية العضوية ، مثل خلاصة الخميرة ، قد تتداخل مع قياس العلامات الأحماض الأمينية ، وبالتالي لا يمكن أن تكون موجودة في الثقافة المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة نمو الخلايا من كثافة بصرية للثقافة في طول موجي الأمثل (على سبيل المثال ، OD 730 لCyanothece 51142) مع معمل الأشعة فوق البنفسجية / فيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأول ما تكون الخلايا المزروعة في وسط غير المسمى. ويفضل في المرحلة المتوسطة سجل نمو الخلايا لاستخدامها في تلقيح (3 ٪ (V / V) من نسبة التلقيح وحدة التخزين) من المتوسط ​​المسمى. وينبغي أن يكون المسمى ثقافة فرعية مثقف (3 ٪ V / V نسبة التلقيح) في المتوسط ​​نفس المسمى لتجنب إدخال الكربون غير المسمى من اللقاح الأولي. </li></ol>الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. استخراج الحمض الأميني <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصاد شبه مثقف الخلايا (10ML) في المرحلة المتوسطة النمو سجل بواسطة الطرد المركزي (10 دقيقة ، 8000 × ز). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend على بيليه في 1.5mL من حمض الهيدروكلوريك 6M وتحويلها إلى الزجاج الشفاف والمسمار GC - أعلى القارورة. غطاء قوارير ووضعها في فرن 100 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ليتحلل في البروتينات إلى أحماض أمينية الكتلة الحيوية. يمكن التحلل من الكتلة الحيوية الكريات الغلة 16 من الأحماض الأمينية 20 مشتركة (الشكل 2) 5. السيستين والتربتوفان والمتدهورة ، ويتم تحويلها إلى الجلوتامين والأسباراجين الغلوتامات واسبارتاتي ، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في حل من الأحماض الأمينية في 20000 × ز به لمدة 5 دقائق 2 مل أنابيب إيبندورف ، ونقل إلى قارورة supernatants GC جديدة. هذه الخطوة تزيل الجزيئات الصلبة في حل التحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأغطية فيال GC وتجفيف العينات تماما تحت تيار من الهواء باستخدام العلمية الحرارية Reacti - برنامج عمل فيينتيان المبخر (ملاحظة : مجفف تجميد يمكن أن تستخدم أيضا رس العينات الجافة). ويمكن القيام بهذه الخطوة عشية وضحاها. </li></ol> 3. حمض أميني derivatization والشروط GC - MS تحليل الأحماض الأمينية أو متهم / الأيضات عالية القطبية عبر GC يتطلب أن تكون هذه الأيضات derivatized ، حتى أن الأحماض الأمينية هي متقلبة ويمكن مفصولة اللوني للغاز 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل العينات المجففة مع 150 ميكرولتر من رباعي هيدرو الفوران (THF) و 150 ميكرولتر من N - (ثالثي butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide كاشف derivatization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان جميع العينات في فرن أو حمام المياه بين 65 و 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. دوامة أحيانا للتأكد من حل الأيضات في القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في العينات ز × 20000 لمدة 10 دقيقة ، ثم نقل إلى طاف GC قوارير جديدة. ينبغي أن يكون طاف حل واضح والصفرة. بسبب تشبع كاشفات ، يمكن أن تتأثر GC - MS دقة قياس عالية بغية دراسته واقراره من قبلntration من الأحماض الأمينية TBDMS derivatized حقن (هذه العينات غالبا ما يظهر اللون البني الداكن) ، ولذلك ، ينبغي لنا أن تضعف هذه العينات باستخدام THF قبل GC - MS قياس 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل العينات بواسطة GC - MS (نسبة استخدام تقسيم 1:05 أو 1:10 ، وحجم حقن = 1 ميكرولتر ، الناقل للغاز الهيليوم = 1.2 مل / دقيقة). استخدام الحرارة GC التالية البرنامج : عقد ب 150 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وزيادة في 3 درجات مئوية في الدقيقة إلى 280 درجة مئوية ، وزيادة في درجة حرارة 20 مئوية في الدقيقة إلى 300 درجة مئوية ، وعقد بعد ذلك لمدة 5 دقائق. يمكن ضبط تأخير المذيبات ودقيقة 5 ~ (GC لعمود 30 مترا). يمكن تعيين مجموعة من كتلة لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) في MS بين 60 و 500. </li></ol> 4. GC - MS تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا TBDMS derivatized قياس الأحماض الأمينية تتأثر في فصل النظائر التمييز GC. النظائر ضوء التحرك قليلا يتنفس بشكل أسرع من النظائر في العمود GC. للحد من التحيز قياس المحتملة ، ونحن قد متوسط ​​الطيف الشامل للمجلس بكامل هيئتهحمض أميني مجموعة الذروة 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أبلغ مجلس الحكم وأطياف MS الأيضات TBDMS derivatized قبل 7. موضحة في الوقت الاحتفاظ GC وفريدة من نوعها قمم م / ض لكل من الأحماض الأمينية في الشكل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Derivatization من الأحماض الأمينية أو الأيضات المركزية بتقديم كميات كبيرة من النظائر المشعة طبيعيا والمسمى ، من بينهم 13 مئوية (1.13 ٪) ، و 18 O (0.20 ٪) ، و 29 سي (4.70 ٪) ، و 30 سي (3.09 ٪). يمكن تصحيح الضوضاء القياس من النظائر الطبيعية في الطيف الشامل isotopomer الخام باستخدام برنامج نشر 5 و 8. وأفادت البيانات النهائية العلامات النظائر ككسور الشامل ، وعلى سبيل المثال ، M 0 ، M 1 ، م 2 ، م 3 و م 4 (تمثل شظايا تحتوي على صفر إلى أربعة الكربون 13 C المسمى). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن قياس الأحماض الأمينية توفير المعلومات النظائر الوسم حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسمة : - 2 - أوكسو glutarأكلت ، 3 - P - غليسيرات ، أسيتيل التميم ، احميرار - 4 - P ، oxaloacetate ، الفسفوإينول ، بيروفات ، والريبوز P - 5. يمكن استخدام أنماط العلامات في هذه الأيضات لتحديد العديد من المسارات الأيضية المركزية (الشكل 2) 9. ويمكن لنتائج هذه التجارب وضع العلامات وأكد كذلك باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية الأخرى (على سبيل المثال ، RT - PCR). </li></ol> 5. تحليل المسارات باستخدام الحمض الأميني المسمى البيانات من خلال التحقيق سوى عدد قليل من الأحماض الأمينية الأساسية التي تنتج من 13 مصممة جيدا التجارب التتبع C ، ونحن قد تكشف عدة مسارات فريدة أو أنشطة انزيم دون إجراء تحليل تدفق 13 متطورة من طراز C - الأيض الأيض المركزية برمتها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Entner - Doudoroff المسار : [1 -- 13 C] ويمكن استخدام الجلوكوز كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير نشطة ، ووضع العلامات سيرين يكون أقل بكثير من العلامات في الألانين 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TCA دورة تشعبت : [1 -- 13 C]ويمكن استخدام البيروفات كمصدر للكربون. إذا ما تم كسر دورة TCA ، يمكن أن توصف من قبل اثنين من الكربونات اسبارتاتي ، بينما هو المسمى الغلوتامات مع واحد فقط الكربون 11 ، 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وكلاهما يستخدم لغير المسمى CO 2 و المسمى ركائز الكربون ومصادر الكربون : CO 2 التثبيت بواسطة كالفين - بنسون - Bassham دورة في التمثيل الغذائي mixotrophic. إذا كالفين دورة وظيفية ، سيتم سيرين وتوسيم الحامض الاميني مخففة إلى حد كبير ، مقارنة مع الأحماض الأمينية الأخرى. هذه الطريقة يمكن تحديد نسبة ثاني أكسيد الكربون عند التثبيت 2 مصادر الكربون العضوي موجودة في 13 المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التأكسدي مسار الفوسفات البنتوز : [1 -- 13 C] ويمكن استخدام الجلوكوز كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير النشطة ، وغير المسمى الألانين أن&gt; 50 ٪ 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصليحي المسارات (على سبيل المثال ، PEP + CO oxaloacetate à 2) : 13 (2) وثاني أكسيد الكربون غير المسمى ركائز الكربون (مثل الجلسرين أو البيرينيهويمكن استخدام uvate) كمصدر للكربون. إذا كان المسار نشطا ، وسوف تكون العلامات اسبارتاتي المخصب بدرجة كبيرة ، مقارنة ب 13 ألانين وسيرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة سيترات - سينسيز : [1 -- 13 C] يمكن استخدامها البيروفات كمصدر للكربون. إذا كان الإنزيم نشطا ، هو المسمى في الغلوتامات β - الكربوكسيل المجموعة 3 ، 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Citramalate المسار : [1 -- 13 C] البيروفات ، [2-13 C] الجلسرين ، أو [1 -- 13 C] ويمكن استخدام أسيتات كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير نشطة ، ليسين والعلامات المبالغ آيسولوسين متطابقة 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيرين isocitrate لياز دورة : [1 -- 13 C] البيروفات أو [1 -- 13 C] يمكن استخدامها لاكتات كمصدر للكربون. إذا كان المسار نشطا ، وسوف يكون المسمى الكربون المركز الثالث في 15 سيرين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستفادة من العناصر الغذائية (مثل الأحماض الأمينية الخارجية) : وسيلة الثقافة مع ركائز الكربون المسمى بشكل كامل وغير المسماة الأحماض الأمينيةيمكن استخدامها. إذا كانت الخلايا بشكل انتقائي استخدام هذه المواد الغذائية تستكمل غير المسمى ، سوف نرى العلامات الهامة التخفيف من هذه الأحماض الأمينية في الكتلة الحيوية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب للتحقيق الذي يفضل المكملات الغذائية من قبل الخلية 16. </li></ol> 6. ممثل النتائج وأحيا دراسات الطاقة الحيوية الحديثة في استخدام الكائنات الحية الدقيقة مصالح ضوئي جديدة لإنتاج الطاقة الحيوية والتقاط ثاني أكسيد الكربون 2. في السنوات الماضية ، تم تطبيق عدد غير قليل 13C - الأيض التحليلات ، بما في ذلك تحليلات متقدمة التمويه - 13C الاستقلابية (13C - MFA) ، للتحقيق في الأيض المركزية في البكتيريا ضوئي ، وذلك لأن المعرفة البيوكيميائية من المسارات الأيضية المركزي ليس له ما يبرره في هذه الكائنات غير النموذجية 10 ، 11 ، 17-20. هنا ، نقدم مثالا للاكتشاف مسار بديل في آيسولوسين Cyanothece 51142 21. سماويothece 51142 لا تحتوي على انزيم (EC 4.3.1.19 ، ثريونين لياز الأمونيا) ، والذي يحفز تحويل ثريونين لketobutyrate - 2 في مسار آيسولوسين التوليف نموذجي. لحل المسار آيسولوسين ، نحن ننمو Cyanothece 51142 (20 مل) في المتوسط ​​22 ASP2 مع الجلسرين 54 مم (2 - 13C ،&gt; 98 ٪). Cyanothece 51142 2 يستخدم الموقف الثاني المسمى الجلسرين كمصدر الكربون الرئيسية. نلاحظ أن ثريونين والألانين واحد يسمى الكربون ، بينما هو المسمى آيسولوسين مع ثلاثة من الكربونات. لذا ، لا يمكن توليف في Cyanothece 51142 تتأتى من الطريق التي تستخدمها ثريونين معظم الكائنات الحية (الشكل 4). من ناحية أخرى ، وآيسولوسين ليسين وأنماط وضع العلامات على أساس جزء متطابقة (M - 15) + وتفتيت (M - 159) +. على سبيل المثال ، فإن البيانات isotopomer من [M - 15] + (تحتوي على الأحماض الأمينية غير مجزأة) وتظهر العلامات متطابقة ليسين (= 0.01 M0 ، M1 = 0.03 ، 0.21 = M2 ، M3 = 00.69) وآيسولوسين (= 0.01 M0 ، M1 = 0.03 ، 0.24 = M2 ، M3 = 0.67). ومن ثم يجب توليفها ليسين وآيسولوسين من السلائف واحد (أي البيروفات وأسيتيل التميم). هذه الملاحظة بما يتفق مع انتقال الكربون المسمى في مسار citramalate لتخليق آيسولوسين. لتأكيد هذا المسار ، ونحن نبحث عن قاعدة بيانات معهد الجينوم المشترك والبحث عن وجود CIMA سينسيز citramalate (cce_0248) في Cyanothece. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. تحليل المسارات ال 13 C - ساعدت الخطوات. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. الأحماض الأمينية المستخدمة في الحصول على نمط توسيم سلائفها الأيضية. ACoA ، أسيتيل التميم ؛ AKG ، α - كيتوغلوتارات ؛ C5P ، ريبوز 5 فوسفات ؛ الاتصالات وتكنولوجيا المعلومات ، سترات ؛ E4P ، احميرار 4 - الفوسفات ؛ G6P والجلوكوز 6 فوسفات ؛ OAA ،<html> oxaloacetate ؛ PEP ، الفسفوإينول ؛ PGA ، 3 - فسفوغليسرات ؛ البيرينيه ، بيروفات. <img src="/files/ftp_upload/3583/3583fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. قمم GC لمدة 16 الأحماض الأمينية. وتصدع الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS قسمين شظايا : (M - 57) + ، الذي يحتوي على حمض أميني بأكمله ، و (M - 159) + ، والذي يفتقر إلى مجموعة الكربوكسيل α من الأحماض الأمينية. ليسين وآيسولوسين ، وتتداخل مع + (M - 57) من قمم الإعلام الأخرى. نقترح استخدام جزء (M - 15) + لتحليل كامل العلامات الأحماض الأمينية. تم الكشف عن مجموعة + (f302) في معظم الأحماض الأمينية ، والذي يحتوي فقط على الأول (α - الكربوكسيل المجموعة) والكربونات الثاني في العمود الفقري من الأحماض الأمينية. لأن هذا قد MS الذروة غالبا ما تكون مرتفعة من الضوضاء إشارة إلى نسب (f302) + غير مستحسن لتحليل كمي لتدفقات الأيضية 7. igure 4 &quot;/&gt; الشكل 4. صفها التحولات في مسارات آيسولوسين في Cyanothece 51142 (معدلة من ورقتنا السابقة) 21.

<ol>
	<li>Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+biological+insights+through+metabolomics+and+13C-flux+analysis.">Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+analysis+of+microbial+metabolic+fluxes+via+13C+isotopic+labeling.">Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling.</a> Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+carbon+metabolism+in+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+via+isotopic+and+transcriptomic+analysisa.">Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa.</a> J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+confirmation+and+flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Desulfovibrio+vulgaris+Hildenborough+using+GC-MS+and+FT-ICR+mass+spectrometry.">Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry.</a> Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).</li><li>Dauner, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GC-MS+analysis+of+amino+acids+rapidly+provides+rich+information+for+isotopomer+balancing.">GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing.</a> Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).</li><li>Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluxome+analysis+using+GC-MS.">Fluxome analysis using GC-MS.</a> Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).</li><li>Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+assessment+of+amino+acid+mass+isotopomer+distributions+for+metabolic+flux+analysis.">Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis.</a> Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).</li><li>Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+mass+isotopomer+data+evaluation+in+13C+flux+analysis:+mass+isotope+correction,+data+consistency+checking,+and+precursor+relationships.">New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships.</a> Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).</li><li>Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotopomer+distributions+in+amino+acids+from+a+highly+expressed+protein+as+a+proxy+for+those+from+total+protein.">Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein.</a> Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).</li><li>Tang, K. -. H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate+metabolism+and+carbon+fixation+in+Roseobacter+denitrificans+OCh114.">Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114.</a> PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).</li><li>Tang, K. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+flow+of+Heliobacterium+modesticaldum+is+more+related+to+Firmicutes+than+to+the+green+sulfur+bacteria.">Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Central+Metabolic+Pathways+in+Thermoanaerobacter+sp.+X514+via+Isotopomer-Assisted+Metabolite+Analysis.">Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).</li><li>Feng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixotrophic+and+photoheterotrophic+metabolisms+in+Cyanothece+sp.+ATCC+51142+under+continuous+light.">Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light.</a> Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flux+analysis+of+central+metabolic+pathways+in+Geobacter+metallireducens+during+reduction+of+soluble+Fe(III)-NTA.">Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).</li><li>Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaerobic+central+metabolic+pathways+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+reinterpreted+in+the+light+of+isotopic+metabolite+labeling.">Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling.</a> Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).</li><li>Zhuang, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+utilization+of+exogenous+amino+acids+by+Dehalococcoides+ethenogenes+strain+195+and+the+enhancement+resulted+to+dechloronation+activity.">Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2011).</li><li>Feng, X., Tang, K. -. H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+of+the+mixotrophic+metabolisms+in+the+green+sulfur+bacterium+Chlorobaculum+tepidum.">Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum.</a> J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+dioxide+fixation+as+a+central+redox+cofactor+recycling+mechanism+in+bacteria.">Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).</li><li>McKinlay, J. B., Harwood, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calvin+cycle+flux,+pathway+constraints,+and+substrate+oxidation+state+together+determine+the+H2+biofuel+yield+in+photoheterotrophic+bacteria.">Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria.</a> MBio. 2, (2011).</li><li>Erb, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+C5-dicarboxylic+acids+from+C2-units+involving+crotonyl-CoA+carboxylase/reductase:+The+ethylmalonyl-CoA+pathway.">Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway.</a> PNAS. 104, 10631-10636 (2007).</li><li>Wu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+isoleucine+synthesis+pathway+in+cyanobacterial+species.">Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species.</a> Microbiology. 156, 596-602 (2010).</li><li>Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unicellular,+aerobic+nitrogen-ï¬xing+cyanobacteria+of+the+genus+Cyanothece.">Unicellular, aerobic nitrogen-ï¬xing cyanobacteria of the genus Cyanothece.</a> J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).</li><li>Shastri, A. A., Morgan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transient+isotopic+labeling+methodology+for+13C+metabolic+flux+analysis+of+photoautotrophic+microorganisms.">A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms.</a> Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).</li><li>Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariability+of+central+metabolic+flux+distribution+in+Shewanella+oneidensis+MR-1+under+environmental+or+genetic+perturbations.">Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations.</a> Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).</li><li>Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-based+metabolic+flux+analysis.">13C-based metabolic flux analysis.</a> Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

يتكون هذا البروتوكول للتغذية الخلية مع ركيزة وصفت وقياس الناتج أنماط العلامات النظائر في الأحماض الأمينية عبر GC - MS. منذ MS البيانات (م / ض النسب) تعطي فقط من المبلغ الإجمالي لوضع العلامات من الأيونات MS ، لدينا لتقييم توزيعات isotopomer من الأحماض الأمينية عن طريق فحص نسب م / ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليق (اختياري) </th></tr><tr><td> TBDMS </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 19915 </td><td> -- </td></tr><tr><td> THF </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 34865 </td><td> -- </td></tr><tr><td> المسمى الكربون الركيزة </td><td> النظائر مختبرات كامبريدج </td><td> تعتمد على الشرط التجريبي </td><td> الموقع : <a href="http://www.isotope.com">http://www.isotope.com</a> </td></tr><tr><td> الغاز اللوني </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> هيوليت باكارد ، والنموذج 7890A </td><td> -- </td></tr><tr><td> أعمدة GC </td><td> J &amp; W العلمية ، فولسوم ، كاليفورنيا </td><td> DB5 (30M) </td><td> -- </td></tr><tr><td> مطياف الكتلة </td><td> اجيلنت تكنولوجيز </td><td> 5975C </td><td> -- </td></tr><tr><td> Reacti - برنامج عمل فيينتيان Evaporأتور </td><td> الحرارية العلمية </td><td> TS - 18825 </td><td> لتجفيف عينات الحمض الأميني </td></tr></tbody></table>

metabolic pathway confirmation and discovery through 13c-labeling of proteinogenic amino acids

الميكروبات والمسارات الأيضية المعقدة التي يمكن أن يتم التحقيق باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية وعلم الجينوم وظيفية. أسلوب واحد مهم لدراسة استقلاب الخلية المركزية واكتشاف الانزيمات الجديدة هو 13 C - 1 ساعدت تحليل الأيض. وتستند هذه التقنية على وضع العلامات النظائر ، حيث يتم تغذية الميكروبات مع ركائز المسمى C 13. من خلال تتبع مسارات الانتقال بين ذرة الأيضات في شبكة الكيمياء الحيوية ، ويمكننا تحديد مسارات وظيفية جديدة واكتشاف الانزيمات. كوسيلة مكملة لtranscriptomics والبروتيوميات ، وأساليب isotopomer بمساعدة تحليل المسارات الأيضية تحتوي على ثلاث خطوات رئيسية 2. أولا ، نحن تنمو الخلايا مع ركائز المسمى C 13. في هذه الخطوة ، وتكوين وسيلة واختيار من ركائز المسمى هما عاملان رئيسيان. لتجنب الضوضاء القياس من الكربون غير المسمى في المكملات الغذائيةمطلوب وسيط مع الحد الأدنى من مصدر وحيد للكربون. علاوة على ذلك ، ويستند اختيار ركيزة المسمى على مدى فعالية سيكون توضيح المسار يجري تحليلها. لأن الانزيمات رواية مختلفة الفراغية غالبا ما تنطوي على رد فعل أو منتجات وسيطة ، بصفة عامة ، ركائز الكربون المسمى منفردة أكثر إفصاحا للكشف عن مسارات الرواية من تلك المسماة موحد للكشف عن مسارات الرواية 3 ، 4 ، وثانيا ، نقوم بتحليل الحمض الأميني أنماط العلامات باستخدام GC - MS. الأحماض الأمينية هي وفيرة من البروتين وبالتالي يمكن الحصول عليها من التحلل الكتلة الحيوية. يمكن أن الأحماض الأمينية التي كتبها N - derivatized (ثالثي butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS) قبل فصل GC. يمكن أن تكون مجزأة الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS والنتيجة في صفائف مختلفة من شظايا. استنادا إلى نسبة الكتلة (م / ض) تهمة من الأحماض الأمينية مجزأة وغير مجزأة ، يمكننا أن نستنتج أن أنماط المسمى ممكن من الأيضات المركزية التيالسلائف من الأحماض الأمينية ، وثالثا ، علينا تتبع التحولات الكربون 13C في المسارات المقترحة ، واستنادا إلى البيانات isotopomer ، تأكيد ما إذا كانت هذه المسارات هي 2 النشطة. قياس الأحماض الأمينية النظائر يوفر معلومات عن العلامات التجارية حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسما في عملية الأيض المركزية. يمكن لهذه العقد الأيضية الرئيسية تعكس مهام المسارات المركزية المرتبطة بها. ويمكن تحليل عملية الأيض 13 C - ساعدت عبر proteinogenic الأحماض الأمينية المستخدمة على نطاق واسع لتوصيف وظيفي في استقلاب الجرثومية سيئة اتسمت 1. في هذا البروتوكول ، وسوف نستخدم Cyanothece 51142 لان السلالة نموذج للتدليل على استعمال الكربون من ركائز المسمى لاكتشاف وظائف جديدة الأنزيمية.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids at JoVE.com

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13 C - النظائر الوسم هو تقنية مفيدة لتحديد استقلاب الخلية المركزية لمختلف أنواع الكائنات الحية الدقيقة. بعد أن تم مثقف الخلايا مع ركيزة محددة المسمى ، يمكن GC - MS قياس تكشف المسارات الأيضية الوظيفية استنادا إلى أنماط وسم فريدة من نوعها في الأحماض الأمينية proteinogenic.

تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال 13 C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

metabolic-pathway-confirmation-discovery-through-13c-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

24.1K Views.  Washington University. 13 C - النظائر الوسم هو تقنية مفيدة لتحديد استقلاب الخلية المركزية لمختلف أنواع الكائنات الحية الدقيقة. بعد أن تم مثقف الخلايا مع ركيزة محددة المسمى ، يمكن GC - MS قياس تكشف المسارات الأيضية الوظيفية استنادا إلى أنماط وسم فريدة من نوعها في الأحماض الأمينية protein...

Video: Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

One-step Metabolomics: Carbohydrates, Organic and Amino Acids Quantified in a Single Procedure

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on tandem mass spectrometry and quantifies acylcarnitines as a screen for organic acidemias and also measures amino acids. All states also perform enzymatic testing for carbohydrate disorders such as galactosemia. Because the results can be non-specific, follow-up testing of positive results is required using a more definitive method. The present report describes the "urease" method of sample preparation for inborn error screening. Crystalline urease enzyme is used to remove urea from body fluids which permits most other water-soluble metabolites to be dehydrated and derivatized for gas chromatography in a single procedure. Dehydration by evaporation in a nitrogen stream is facilitated by adding acetonitrile and methylene chloride. Then, trimethylsilylation takes place in the presence of a unique catalyst, triethylammonium trifluoroacetate. Automated injection and chromatography is followed by macro-driven custom quantification of 192 metabolites and semi-quantification of every major component using specialized libraries of mass spectra of TMS derivatized biological compounds. The analysis may be performed on the widely-used Chemstation platform using the macros and libraries available from the author. In our laboratory, over 16,000 patient samples have been analyzed using the method with a diagnostic yield of about 17%--that is, 17% of the samples results reveal findings that should be acted upon by the ordering physician. Included in these are over 180 confirmed inborn errors, of which about 38% could not have been diagnosed using previous methods.

The urease method of sample preparation for GC/MS analysis of intermediary metabolites is presented by its inventor. The method allows one-step follow-up of newborn screening for inborn errors by tandem mass spectrometry by quantifying carbohydrates, organic and amino acids all in a single process.

خطوة واحدة Metabolomics : الكربوهيدرات والأحماض الأمينية والعضوية والكمية في إجراء واحد

Every infant born in the US is now screened for up to 42 rare genetic disorders called "inborn errors of metabolism". The screening method is based on ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

تحديد القائم على النمو وتأكيد البيوكيميائية من متطلبات الوراثية للتدهور البروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by providing improved methodology for the identification of inhibitors for such binding sites and which represent the majority of potential drug targets. The main goal of this paper is to provide a methodological overview of the use and application of the REPLACE strategy which involves computational and synthetic chemistry approaches. REPLACE is exemplified through its application to the development of non-ATP competitive cyclin dependent kinases (CDK) inhibitors as anti-tumor therapeutics. CDKs are frequently deregulated in cancer and hence are considered as important targets for drug development. Inhibition of CDK2/cyclin A in S phase has been reported to promote selective apoptosis of cancer cells in a p53 independent manner through the E2F1 pathway. Targeting the protein-protein interaction at the cyclin binding groove (CBG) is an approach which will allow the specific inhibition of cell cycle over transcriptional CDKs. The CBG is recognized by a consensus sequence derived from CDK substrates and tumor suppressor proteins termed the cyclin binding motif (CBM). The CBM has previously been optimized to an octapeptide from p21Waf (HAKRRIF) and then further truncated to a pentapeptide retaining sufficient activity (RRLIF). Peptides in general are not cell permeable, are metabolically unstable and therefore the REPLACE (REplacement with Partial Ligand Alternatives through Computational Enrichment) strategy has been applied in order to generate more drug-like inhibitors. The strategy begins with the design of Fragment ligated inhibitory peptides (FLIPs) that selectively inhibit cell cycle CDK/cyclin complexes. FLIPs were generated by iteratively replacing residues of HAKRRLIF/RRLIF with fragment like small molecules (capping groups), starting from the N-terminus (Ncaps), followed by replacement on the C-terminus. These compounds are starting points for the generation of non-ATP competitive CDK inhibitors as anti-tumor therapeutics.

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

التأسيس-بقايا محددة من Noncanonical الأحماض الأمينية في البروتينات نموذج باستخدام<em&gt; كولاي</em&gt; نظام النسخ، ترجمة خالية من خلية

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

عزل الترشيح من الأحماض النووية: وبسيطة وسريعة استخراج الحمض النووي الطريقة

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.